CⅡTA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CⅡTA核酶抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类分子的表达.设计并合成针对人类CⅡTA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性.将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHC Ⅱ类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA mRNA水平.结果表明,Rz464与CⅡTA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带.pRz464+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CⅡTA的诱导型mRNA含量明显减少.Rz464通过切割CⅡTA mRNA,进而阻止了后者调控的MHC Ⅱ类分子的表达.     

CIITA锤头状核酶的克隆及其体外活性

通过CIITA核酶抑制HeLa细胞表面MHCⅡ类分子的表达。设计并合成针对人类CIITA的核酶Rz464,通过体外转录和切割实验鉴定其活性。将Rz464亚克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP(pRz464),并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测MHCⅡ类抗原表达,RT-PCR检测CIITA mRNA水平。结果表明,Rz464与CIITA靶序列体外切割产物电泳见预期切割条带。pRz464~+HeLa细胞与对照组比较,HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79.21%、90.31%及48.30%;同时CIITA的诱导型mRNA含量明显减少。Rz464通过切割CIITA mRNA,进而阻止了后者调控的MHCⅡ类分子的表达。     

CⅡTA M1-RNA对MHCⅡ类分子表达的抑制作用

目的探讨MHCⅡ类分子转录激活因子（CⅡTA）的M1-RNA对细胞表面MHCⅡ类分子表达的抑制。方法M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位，设计并克隆针对CⅡTA第452、629位点的M1-RNA（分别为M1-452-GS、M1-629-GS）及其相应的CⅡTA靶基因，分别插入pUC19、pGEM-7zf（＋）载体，进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作甩明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体（psNAV-M1-629-GS，pA629）并稳定转染ECV304细胞株，流式细胞术检测经典的MHCⅡ（HLA-DR、-DP、-DQ）类抗原表达，RT-PCR检测CⅡTA的mRNA水平。结果pA629阳性ECV304细胞株与对照组比较，HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了89．21％及92．31％；同时CⅡTA的mRNA含量降低（P〈0．05）。结论CⅡTA的M1-RNA（M1-629-GS）降低了自身mRNA含量，从而阻止其调控的MHCⅡ类分子的表达。     

抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS)的生物学活性

目的 通过抗CⅡ TA RNaseP抑制HeLa细胞表面MHCⅡ分子的表达。方法 M1-RNA是RNaseP的催化活性单位，从包含M1．RNA的pTK117质粒克隆抗CⅡTA RNaseP(M1-3408-GS)，定向插入腺相关病毒载体psNAV(paAV-M1-3408-GS)；以RT-PCR从Raji细胞株克隆靶基因模板，插入pEM-7zf( )载体(pGEM-3176)。psNAV-M1-3408-GS和pGEM-3176分别进行体外转录和体外切割实验。通过纳米载体介导psNAV-M1-3408-GS质粒稳定转染HeLa细胞，应用流式细胞术检测其表面HLA-DR、DP、DQ抗原表达，RT-PCR检测其CⅡTAmRNA水平。结果 M1-3408-GS与pGEM-3176体外切割产物电泳见预期切割条带。M1-3408-GS HeLa细胞与对照组比较，其表面HLA-DR、DP、DQ抗原诱导型表达分别降低了79．21％、90．31％及48．30％；同时诱导型CⅡTA mRNA含量减少。结论 抗CⅡTA核糖核酸酶P(M1-3408-GS)有可能发展为新一代抑制自身免疫疾病的核酸药物。     

腺病毒介导CⅡTA突变体基因转移抑制MHCⅡ类分子表达的体外研究

目的:构建携带小鼠MHCⅡ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ molecule transactivator,CⅡTA)突变体基因的腺病毒,并观察腺病毒介导该基因的表达情况以及表达产物的体外功能.方法:采用常规分子生物学方法从IFN-γ诱导后的BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞中获得Ⅳ型CIITAcDNA;利用重叠延伸PCR法构建CIITA突变体基因,并克隆入表达载体pIRES;采用pAdEasy-1系统获得具有感染能力的、携带CIITA突变体基因的缺陷型重组腺病毒(Ad-CIITAm)和空载对照病毒(Ad-GFP),并经大量扩增、纯化及滴度测定;将Ad-CⅡTAm和Ad-GFP分别感染HeLa细胞和Raji细胞,流式细胞术观察对诱导型和组成型HLA-DR分子表达的影响.结果:成功克隆了小鼠CⅡTA突变体基因,并构建了携带小鼠CⅡTA突变体基因的重组腺病毒Ad-CⅡTAm;经流式细胞术证实感染Ad-CⅡTAm的Hela和Raji细胞较感染Ad-GFP的细胞,其表面HLA-DR分子的表达均受到明显的抑制.结论:本实验证实了重组腺病毒介导表达的小鼠CⅡTA突变体在体外能够有效地抑制MHCⅡ类分子的表达.     

TLR激动剂抑制IL-27诱导的THP-1细胞HLA-DR的表达

目的研究白介素27(IL-27)对THP-1单核细胞系Ⅱ类转录活化子(classⅡtransactivator,CⅡTA)和Ⅱ类主要组织相容性复合物(major histocom patibility complex classⅡ,MHCⅡ)分子的表达的影响及Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)激动剂LPS和Pam3CSK4的干预作用。方法RT-PCR检测CⅡTAⅠ、Ⅲ和Ⅳ以及人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DRA和干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)mRNA的表达。半定量PCR检测HLA-DRA、DRB、DPA、DPB、DQA、DQB、IRF-1、CⅡTA mRNA的表达。流式细胞术检测细胞表面HLA-DR的表达。结果IL-27刺激24h后可分别上调THP-1细胞CⅡTAⅢ、CⅡTAⅣ和IRF-1mRNA表达水平。IL-27刺激24h和48h可升高MHCⅡ类分子mRNA的表达,并能诱导HLA-DR在28%和53%的THP-1细胞表面表达。在THP-1细胞和PMA诱导的THP-1巨噬细胞,LPS和Pam3CSK4均可抑制IL-27诱导的CⅡTA和HLA-DR的表达。结论IL-27可上调THP-1细胞CⅡTA和MHCⅡ类分子的表达,这种作用可被LPS和Pam3CSK4抑制。     

抗转化生长因子β1的U1 snRNA嵌合型核酶体外剪切作用

目的： 研究抗转化生长因子β₁ U1snRNA嵌合型锤头状核酶的细胞外切割活性。方法： 通过计算机设计针对TGFβ₁的锤头状核酶，然后把合成的核酶片段克隆入含有U1 snRNA启动子/增强子和终止子的U1 snRNA核酶载体中。通过RT-PCR扩增获得TGFβ₁的部分基因片段，将其克隆入T载体中T7启动子的下游，体外转录获得核酶和靶RNA，转录过程中掺入同位素，通过变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化回收。［³²P］标记的核酶与靶RNA在不同条件下进行切割反应，变性PAGE电泳，放射自显影，分析反应结果。结果： 活性的U1 snRNA嵌合型核酶（U1Rz803）在生理温度下具有良好特异的切割活性； 而点突变型核酶U1Rz803m没有切割活性，因此这些结果显示U1Rz803设计是正确的。结论： 本研究中制备的U1Rz803具有良好的特异催化切割活性。U1 snRNA嵌合型核酶U1Rz803有望在胞内抑制TGFβ₁的表达，为研究转化生长因子（TGF）β₁在造血调控中的作用机制提供有效工具。     

靶向CⅡTA基因siRNA对大鼠角膜基质细胞MHCⅡ基因表达影响的研究

目的：探讨靶向主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类抗原转录激活因子（MHCⅡtransactivator CⅡTA）的化学合成小干扰RNA(small interfering RNA)抑制大鼠角膜基质细胞表面的MHCⅡ类抗原表达的可行性。 方法： 设计并合成靶向CⅡTA基因的5条siRNA，分离并培养大鼠角膜基质细胞，经重组大鼠IFN-γ刺激后，在阳离子脂质体的介导下，将siRNA转染大鼠角膜基质细胞。于转染后24 h收集细胞,用荧光定量PCR方法检测CⅡTA和MHCⅡ mRNA水平的变化;流式细胞仪检测MHCⅡ抗原表达的变化。 结果： 大鼠角膜基质细胞经重组大鼠IFN-γ刺激后，CⅡTA和MHCⅡ的表达大幅增强。荧光定量PCR检测显示化学合成的5条siRNA通过脂质体转染大鼠角膜基质细胞后,均能不同程度地抑制CⅡTA和MHCⅡ的表达，与对照组具有显著差异(P<0.01)。其中siRNA-4组的抑制作用最明显，对CⅡTA、MHCⅡ基因的mRNA抑制率分别为95.10%±1.25%、82.70%±1.95%。流式细胞仪检测显示siRNA-4组对MHCⅡ抗原分子表达抑制率为81.90%±1.23%。 结论： 在大鼠角膜基质细胞中，靶向CⅡTA siRNA抑制了自身mRNA表达,并阻止其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。从而为进一步研究利用siRNA技术抑制MHCⅡ的表达防治角膜缘移植排斥反应提供了实验依据。     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC Ⅱ类抗原的表达

探讨MHC Ⅱ类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC Ⅱ类分子表达的抑制.M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf( )载体,进行细胞外切割活性筛选.将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平.在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P＜0.05).CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC Ⅱ类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法.     

MHCⅡ类反式激活因子基因的克隆、鉴定及初步功能测定

目的 克隆MHCⅡ类反式激活因子（class Ⅱ rtansactivator,CⅡTA）基因并进行初步功能测试，为CⅡTA的应用研究奠定基础。方法 RT－PCR扩增CⅡTA基因，将其克隆到pGEM-T载体上并进行酶切和测序鉴定，用EcoRⅡ、XhoⅠ将CⅡTA定向克隆到表达载体pcDNA3上，用脂质体转染法将pcDNA3/CⅡTA转入HeLa细胞；流式细胞术观察细胞表面HLA－DR／DQ的表达变化。结果 成功克隆CⅡTA基因，CⅡTA的转入使HeLa细胞表面表达HLA－DR／DQ分子。结论 转入CⅡTA能使HeLa细胞表面表达MHCⅡ类分子表达，CⅡTA参与调控MHCⅡ类基因的转录和表达。     

构建可抑制HLA-DR/DQ表达的MHC-Ⅱ类分子反式激活因子基因的突变体及其机制

目的：构建能抑制MHC—Ⅱ类分子表达的MHC—Ⅱ类分子反式激活因子(MHC class Ⅱ transactivator，CⅡTA)基因的突变体．并探讨其抑制MHC—Ⅱ类分子表达的机制。方法：用PCR、酶切及连接技术，构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2，含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3以及含起始密码子及NLS(nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体。用脂质体转染法，将上述3种突变体及空载体pcDNA3转入Hela细胞和Raji细胞中。用流式细胞术和RT-PCR法，观察他们对Hela／Raji细胞HLA—DR／DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。将mCⅡTA4转移到对四环素浓度依赖的质粒pU-HD10-3上，通过改变培养环境中四环素的浓度，调节外源CⅡTA突变体的表达量，观察突变体的表达量与MHC-Ⅱ类分子受抑率的关系。结果：细胞和基因水平证实，pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对Hela／Raji细胞HLA-DR／DQ的表达均有明显的抑制作用；而pcDNA3mCⅡTA2和空载体pcD-NA3无此作用。MHC-Ⅱ类分子被抑制的程度与外源转入CⅡTA突变体(pUHD10-3mCⅡTA4)的量明显相关。结论：成功地构建pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4，并能抑制HLA-Ⅱ类分子的表达。初步证实CⅡTA突变体是通过与胞内的野生型CⅡTA竞争性结合反式激活蛋白，来抑制MHC-Ⅱ类分子的转录和表达。     

抗自身免疫的新途径-CⅡTA siRNA的体外筛选及活性

目的 探讨主要组织相容性复合物II类转录激活因子(CⅡTA)的siRNA对软骨细胞表面主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子表达的抑制.方法 设计并合成针对CⅡTA编码区第176、741及3061位点的siRNA(分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3).通过纳米载体介导siRNA稳定转染原代软骨细胞,流式细胞术检测经典的MHC-Ⅱ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT-PCR检测CⅡTA及其调控的MHC-Ⅱ类分子的mRNA水平.结果 在重组人干扰素(interferon, IFN)-γ诱导下,siRNA3阳性软骨细胞表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了93.36%、94.16%,同时CⅡTA的mRNA含量明显减少.结论 siRNA3抑制了CⅡTA的mRNA含量,并阻止其调控的MHC-Ⅱ类分子的表达.     

氟伐他汀抑制内皮细胞MHCⅡ表达的研究

目的 研究氟伐他汀抑制干扰素-γ（IFN-γ）诱导的内皮细胞表面主要组织相容性抗原复合物Ⅱ（MHCⅡ）表达的作用，并研究其抑制作用的机理。方法 通过流式细胞仪检测分析MHCⅡ在内皮细胞中的表达，通过RT-PCR检测Ⅱ类反式激活因子（CⅡTA）mRNA的生成，通过Western blot分析信号转导和转录激活因子1（STAT1）的总量和磷酸化STAT1（P-STAT1）。结果 氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的内皮细胞表面MHCⅡ表达，RT-PCR分析表明CⅡTA mRNA的诱导生成可以被氟伐他汀阻断。Western blot分析表明氟伐他汀预处理并不影响STAT1的总量和在IFN-γ刺激后STAT1的磷酸化。结论在内皮细胞中，氟伐他汀预处理可以抑制由IFN-γ刺激诱导的CⅡTA mRNA的表达，并因此抑制了细胞表面MHCⅡ表达，这种抑制作用主要发生在CⅡTA的转录水平，可能与转录因子和CⅡTA启动子的结合有关。     

两种抑制MHCⅡ类分子表达方法的比较

目的：评价cⅡTA（MHC classⅡ transactivator，CⅡTA）基因突变体和反义RNA对MHCⅡ类分子的抑制效率和胞内稳定性，为改造MHC分子奠定基础。方法：用PCR、酶切及连接技术，构建不含起始密码子的peDNA3mCⅡTA2，含起始密码子的peDNA3mCⅡTA3突变体及cⅡTA基因的反义RNA-pcDNA3／CⅡTAJ亘。用脂质体转染法，将突变体、反义RNA及空载体pcDNA3转入PIEC细胞和123细胞中。持续四个月，流式细胞术观察它们对PIEC／123细胞株MHCⅡ类（sLA-DR）分子的诱导性和组成性表达的影响。结果：转染pcDNA3、pcDNA3mCⅡTA2后，PIEC／123细胞SLA-DR的表达没有受到抑制，转染peDNA3mCⅡTA3后，9／20（45．0％）的PIEc细胞、10／20（50．O％）的L23细胞SLA-DR的表达受到明显抑制，抑制率高达90％以上；转染pcDNA3mCIITA＆后，7／15（46．7％）PIEC细胞、5／15（33．3％）123细胞sLA-DR的表达受到明显抑制，抑制率高达85％以上。持续检测4个月，转染peDNA3mCⅡTA3的PIEC／123细胞SLA-DR的表达受抑率均在90％以上。转染反义RNA的PIEC／123细胞在第65／45天。SLA-DR表达抑制率降至10％以下。结论：构建成功的CⅡTA突变体和反义RNA均能有效抑制sLA-DR表达，但CⅡTA突变体稳定存在于胞内的时间长，构建突变体是和用CⅡTA抑制MHCⅡ类分子的好方法。     

小鼠pIV启动子调控CⅡTA突变体重组腺病毒表达选择性抑制MHC Ⅱ类分子的表达

目的：观察受CⅡTA-pIV启动子驱动的MHCⅡ类分子反式激活因子突变体（CⅡTAm）重组腺病毒对MHCⅡ类分子表达的选择性抑制作用，并探讨其相关机制。方法：构建了N-端酸性氨基酸区缺失了118aa的CⅡTA突变体及其CⅡTA-pIV启动子驱动的重组腺病毒Ad-pⅣ-CⅡTAm，将Ad-pIV-CⅡTAm或对照腺病毒Ad-GFP感染小鼠内皮细胞株SVEC细胞和转染巨噬细胞株J774细胞，并以IFN-γ刺激。用RT-PCR检测野生型和突变型CⅡTA mRNA的表达，用流式细胞术检测MHCⅡ类分子在细胞表面的表达。结果：成功构建CⅡTA-pIV启动子调控下的CⅡTA突变体基因重组腺病毒表达载体Ad-pIV-CⅡTAm；该腺病毒介导的CⅡTA突变体mRNA在SVEC和J774细胞内的表达受到IFN-7的上调，同时抑制这些细胞上诱导型和组成型MHCⅡ类分子的表达。结论：Ad-pIV-CⅡTAm重组腺病毒是一种WN-γ调控型表达载体，可有效地抑制受感染细胞上MHCⅡ类分子的表达。     

质粒介导的RNAi技术对大鼠CⅡTA和MHCⅡ基因表达抑制的检测

目的 研究应用质粒介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对大鼠MHC Ⅱ类分子反式激活因子(MHCclass Ⅱ transactivator,C Ⅱ TA)和MHC Ⅱ基因表达的抑制作用.方法 根据大鼠CⅡTA基因信息,设计合成3条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)并构建质粒载体,于体外转染大鼠骨髓源树突状细胞(DC)及体内转染大鼠脾脏,采用实时定量RT-PCR技术检测转染后DC和脾脏的C Ⅱ TA及MHCⅡ的mRNA表达变化,流式细胞术检测转染后MHCⅡ蛋白表达变化.结果 成功构建shRNA质粒载体,3个shRNA质粒转染组的DC和脾脏转染后的CⅡTA和MHC Ⅱ的mRNA表达水平及MHC Ⅱ抗原表达水平均明显减低(P<0.01),其中第1条shRNA的质粒转染组抑制效果最侍,C ⅡTA与MHCⅡ基因表达呈正相关.结论 应用C Ⅱ TA靶向shRNA质粒载体在体内外均能显著抑制C Ⅱ TA和MHC Ⅱ基因表达,为进一步基因治疗研究奠定实验基础.     

CIITA M1-RNA抑制HeLa细胞表面MHC II类抗原的表达

探讨MHC II类转录激活因子(CIITA)的M1-RNA对细胞表面MHC II类分子表达的抑制。M1-RNA是核糖核酸酶P的催化活性单位,设计并克隆针对CIITA第452、629位点的M1-RNA(分别为M1-452-GS、M1-629-GS)及其相应的CIITA靶基因,分别插入pUC19、pGEM-7zf(+)载体,进行细胞外切割活性筛选。将细胞外切割作用明显的M1-629-GS亚克隆入psNAV载体(psNAV-M1-629-GS,pA629)并稳定转染HeLa细胞株,流式细胞术检测经典的MHC II类抗原(HLA-DR、-DP、-DQ)的表达,RT-PCR检测CIITA的mRNA水平。在重组人γ干扰素诱导下,pA629阳性HeLa细胞株表面HLA-DR、-DP抗原表达分别降低了83.03%及89.91%;同时CIITA的mRNA含量明显减少(P<0.05)。CIITA的M1-RNA抑制了自身mRNA含量,从而阻止其调控的MHC II类分子的表达,为移植物抗宿主病的研究提供了一种新方法。     

抗HPV16E_6核酶的原核表达与体外活性研究

目的　获得一种特异性抗人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因的核酶,用以在基因调控水平预防、治疗HPV相关性肿瘤。方法　以核酶(ribozyme,Rz)的锤头结构为模型,采用计算机软件针对HPV16E6基因,设计相应的Rz;体外合成其基因后,克隆于原核表达质粒中。将HPV16E6基因片段也克隆于原核表达质粒中,通过体外转录而得到核酶和病毒mRNA,进行体外切割试验以鉴定核酶的活性。结果　抗HPV16E6核酶(简称抗16HRz)被装入pRG523中而构成pRG16HRz,体外转录后能将核酶独立地释放出来。HPV16E6mRNA转录质粒pTZ16E6含有HPV16E6基因片段( 94位～ 296位),体外切割实验证明抗16HRz具备切割活性,在体外能准确、有效地识别和切割HPV16E6mRNA片段,得到82nt和132nt的切割产物。结论　所获得的抗HPV16E6核酶能特异性切割HPV16E6mRNA,可作为对HPV相关性肿瘤进行基因治疗的工具。     

构建MHCⅡ类分子反式激活因子基因突变体抑制转染细胞HLAⅡ类分子的表达

目的：探讨MHCⅡ类分子反式激活因子（CⅡ\TA）突变体抑制HLAⅡ类分子表达的可能性。方法：构建不含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA2、含起始密码子的pcDNA3mCⅡTA3的含起始密码子及NLS（nuclear localization signal)的pcDNA3mCⅡTA4突变体。用脂质体转染法将上述3种突变体及pcDNA3空载体转入HeLa细胞和的Raji细胞。用流式细胞术和RT－PCR法观察它们对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ分子的诱导性和组成性表达的影响。结果：在细胞和基因水平证实pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mCⅡTA4对HeLa/Raji细胞HLA－DR／DQ的表达起明显抑制作用，而pcDNA3mCⅡTA2和pcDNA3空载体无此作用。结论：成功构建的pcDNA3mCⅡTA3和pcDNA3mⅡTA4能抑制HLAⅡ类分子的表达。