逆转录病毒载体介导人 GM-CSF 基因在 HL-60 白血病细胞的高效转移和表达

目的探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性，为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７，获得重组逆转录病毒，将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞，经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群，应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实，ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移并整合到ＨＬ－６０细胞基因组中，而未转基因和转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞经ＰＣＲ检测未能扩增出特异性片段。经ＧＭ－ＣＳＦ依赖株ＴＦ－１检测，转基因细胞分泌的ＧＭ－ＣＳＦ生物学活性为６０～２００ｎｇ／ｍｌ（细胞１×１０６，培养２４小时），而未转基因及转空载体Ｎ２Ａ的ＨＬ－６０细胞培养上清无ＧＭ－ＣＳＦ活性。结论逆转录病毒载体介导的ｈＧＭ－ＣＳＦ基因能在体外培养的人ＨＬ－６０白血病细胞中获得高效的转移和表达。     

受体介导的基因转移与基因治疗

基因治疗成功的关键在于将治疗基因靶向性转移到细胞或组织，受体介导的基因转移能满足此要求，很有发展潜力的基本转移方法。然而，要将这种转移方法用于基因治疗，与转移系统有关的万分的化学特性与物理反应，靶细胞的受体表达水平，DNA配体复合物怎样逃逸溶酶体的降解以及包含在复合物中的外源基因的表达等都是至关重要的。本文综述了受体介导的基因转移的基本原理。DNA配体复合物形成的最佳条件与性质，影响基因转移与表达的各种因素以及近年来国内外受体介导的基因转移用于基因治疗取得的进展。     

逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究

目的 观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用，探讨淋巴瘤的基因治疗方法。方法 在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317，经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317／CD tk细胞株，收集病毒上清，浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞，再次经G418筛选，获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD tk细胞株。采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达。MTT法测定转基因组及末转基因组Raji细胞的存活率。结果 双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达，联合使用5-氟胞咳暖(5-FC)和无环鸟苷(QCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV。结论 逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用。     

多药耐药基因在白血病细胞的高效转移与表达研究

目的　研究逆转录病毒介导多药耐药基因 MDR1的转移与表达。方法　用 MDR病毒转导人类白血病细胞K5 6 2和 NB4,获得耐药细胞系 ;外源性 MDR1基因的转移和表达用聚合酶链反应 (PCR)、流式细胞术 (FCM)和半固体集落培养法分析。结果　 MDR病毒转导使白血病细胞获得经典多药耐药表型 ,78.0 %～ 98.7%的细胞表达 P-糖蛋白 ;PCR分析证实耐药细胞整合有 MDR原病毒 ,并共表达全长和异常剪切 MDR1转录本。以 K5 6 2细胞为模型 ,FCM和集落培养法发现共培养法的基因转导率 (6 7.9%～72 .5 % )明显高于上清法 (33.1%～ 46 .8% ) ,加入生长因子可提高基因转导率约 2 3%。结论　逆转录病毒可介导MDR1基因在髓系白血病细胞进行有效的转移与表达 ;MDR1基因可作为选择性标志用于基因治疗     

逆转录病毒载体介导人GM—CSF基因在HL—60白血病细胞的高效转…

探讨将外源基因导入白血病细胞的条件及可行性,为造血系统恶性肿瘤的基因治疗奠定基础。方法采用脂质体（ｌｉｐｆｅｃｔｉｎ）包装技术将Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ导入包装细胞ＰＡ３１７,获得重组逆转录病毒,将重组病毒悬液感染人髓系白血病ＨＬ－６０细胞,经Ｇ４１８筛选出ＨＬ－６０转基因细胞群,应１用ＭＴＴ法测定ＧＭ－ＣＳＦ活性。结果ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测结果证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因成功地转移     

逆转录病毒介导GM-CSF在造血祖细胞中的基因转移

为了探索GM-CSF基因治疗的可行性,采用逆转录病毒载体介导的基因转移方法将小鼠GM-CSF cDNA逆转录病毒pLXSN/GM转染病毒包装细胞PA317,然后感染富含造血干、祖细胞群体,经含G418的体外半固体造血祖细胞培养,表现出较多的G418抗性CFU-GM生成,用PCR和Southem Blot方法分别检测出转化细胞基因组中整合有Neo~R基因和GM-CSF cDNA,原位杂交显示转化细胞有较强的GM-CSF mRNA表达,在Dexter培养中,GM-CSF修饰组的成熟非粘附细胞计数明显高于对照组(P<0.05).上述结果表明GM-CSF重组逆转录病毒成功地转入造血祖细胞并获得了表达,为下一步体内基因治疗奠定基础.     

逆转录病毒介导IL-2基因转移对K562细胞增殖周期的影响

应用逆转录病毒载体将IL-2基因导入人红白血病细胞系K562细胞中。转导18天后,细胞DNA周期分析发现空载体转导的细胞K562/neo及含IL-2基因载体转导的细胞k562/IL-2的G0/G1期比例降低,而G2 M期增高。转导30天后K562/neo DNA周期分布恢复至转导前水平,而K562/IL-2细胞G0/G1期比例仍低于未转导细胞,G2 M期仍高于未转导细胞。MTT法检测细胞增殖活性观察到K562/IL-2从培养第4天起增殖活性明显落后于未转导细胞,核分裂指数亦低于水转导细胞。光学显微镜观察见K562/IL-2细胞中出现较多巨大细胞及多核巨细胞,细胞核数目可多达20余个,推测多核巨细胞的形成可能与细胞核反复分裂而胞质不能分裂有关。进一步形态计量学分析证实IL-2基因修饰的K562细胞体积增大,巨大细胞出现率显著高于未转导的K562细胞。结果提示K562/IL-2细胞体积增大与G2 M期细胞比例增高有关,推测IL-2基因修饰可能导致K562细胞周期滞留于G2期。     

非病毒介导的基因转移

基因转移是研究基因功能和实现基因治疗的一个关键.基因转移必须安全、有效、稳定、特异、可控、经济、简便易行并可携带不同长度的DNA.目前,基因转移主要有病毒和非病毒介导的两种方式.本文结合心血管系统的基因治疗,介绍几种我们实验室创建的一些非病毒介导的基因转移方法.1. 基因缝线 基因缝线是将外源性DNA直接涂粘或通过Poylysine耦联到手术缝合线上,进行血管、肌肉和组织的缝合而实现基因转移的方式.应用pcDNA3/lacZ基因缝线,缝合血管、骨骼肌、心肌等器官可以实现高效基因转移,其表达量可较直接注射法高5～10倍,并可持续3个月以上.并且肌肉再生、组织缺血损伤可以促进外源性基因的表达.应用这种方法转移MTHFR基因,可以产生DNA抗体;应用基因缝线,携带尿激酶原的基因,给微小动脉进行血管缝合,可以防止吻合口的血栓形成和再狭窄.携带VEGF基因,给血管梗塞的大鼠、狗和猴进行血管外基因转移,可以促进血管内皮的生长、新生血管的形成和侧枝循环的建立,治疗梗塞性血管病.携带心钠素基因,可以使血中心钠素水平升高一倍以上,产生明显利钠、利尿和降低血压的作用,防治和延缓高血压的发生.应用这种方法,进行肌肉介导的基因转移,其外源基因仅在局部表达,而不累及远隔的组织和器官.     

PCR技术检测儿童急性淋巴细胞白血病TcRγ基因重排

应用ＰＣＲ技术检测２０例急性淋巴细胞白血病ＴｃＲγ基因重排，其扩地产产物的长度为４００ｂｐ左右。初治和复发的１３例患儿中有７例检出ＴｃＲγ基因重排，其中复发的３例患儿均有ＴｃＲγ基因重排，完全缓解的７例患儿中有４例检出ＴｃＲγ基因重排，此４例患儿目前继续维持治疗，尚我复发之临床表现。     

High efficiency retrovirus-mediated gene transfer to leukemia cells

Genetherapywithgenetransferasitsmolecularbasispromisesaneffectivestrategyforthetreatmentofcancerandinheriteddiseases.RetroviralvectorsderivedfromtheMoloneymurineleukemiavirus(MoMLV)backbonearewidelystudiedasvehiclesforgenetransferbasedontheirpotentia...     

Recombinant Apoptin gene retrovirus induces apoptosis in human breast cancer cells 435

Objective  To construct recombinant Apoptin gene (vp3) retrovirus pLVP3 and to study its apoptosis inducing effect on human breast cancer cells 435 as well as to discuss its mechanism in vitro and in vivo. Methods   vp3 gene was cloned and recombinated into retrovirus vector pLP-LNCX-VP3 (pLVP3) at loxP site, which was transformed into package cell line PT67 and then into NIH3T3 cells for titer assay. The human breast cancer cell line 435 was infected with retrovirus pLVP3, and then MTT assay and Western blotting were adopted to detect cellular proliferation and Apoptin protein expression. Forty-eight hours after infection flow cytometry (FCM) was used for apoptosis detection and Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time of Flight-Mass Spectrometry (SELDI-TOF-MS) was used for protein profile assay. Nude mice model of human breast cancer cells 435 was set up to observe the tumor inhibiting rates of pLVP3, and TUNEL assay was used to detect tumor apoptosis as well as real-time PCR for vp3 gene expression. Results  Recombinant plasmid pLVP3 was successfully constructed. Virus titer reached to 5×10⁸ pfu/ml in the PT67 culture supernatant. Forty-eight hours after infection, cellular inhibition rate was 65.1% in MTT assay, higher than that in blank control (P<0.05) and Apoptin protein expressed more in test group in Western blotting. FCM assay showed apoptotic peaks with a percentage of 15.42%. SELDI-TOF-MS findings suggested that two protein peaks, M_2544.1+H and M_3712.4+H, were statistically different between infection group and control group (P<0.05). The tumor inhibition rates in pLVP3 group were 65.52% and 68.23%, much higher than that of control group (t=4.06, P<0.01). TUNEL assay findings showed that positive yellow stains were seen in pLVP3 retrovirus group and 5-FU positive control group without difference (t1=1.05, t2=0.84, P>0.05). Conclusion  The experiment demonstrated that vp3 could induce apoptosis in tumor cells in vivo and in vitro, which laid a basis for further study on molecular mechanism of tumor cell apoptosis induced by Apoptin and provided valuable reference for tumor gene therapy. Contributed equally to this work.     

急性白血病患者多药耐药基因mdrl的表达及其临床意义

目的　探讨白血病细胞的抗药性与化疗效果及预后的关系。方法　采用逆转录 -聚合酶链反应 ( RT- PCR)的方法检测了 85例不同时期急性白血病 ( AL)患者多药耐药基因 mdrl m RNA的表达 ,同时检测了 2 0例正常人作为对照。结果　初治组 mdrl的阳性率为 4 4 .7% ,mdrl 与 mdrl-患者的完全缓解 ( CR)率分别为 2 3.9%和 88.5% ( P<0 .0 0 5) ,复发及难治组患者 mdrl的阳性率明显高于CR组 ( P<0 .0 0 1) ,复发及难治组 mdrl m RNA的表达水平也高于 CR组 ( P<0 .0 0 1)。CR患者 mdrlm RNA的表达水平逐渐升高可导致临床复发。正常人和长期生存患者 mdrl的阳性率很低。另外发现mdrl的表达与法、美、英协作组 ( FAB)分型有关。结论　mdrl的表达与 AL的化疗效果及预后密切相关 ,它是 AL患者一个重要的不利预后因素。     

急性白血病患者WT1基因表达水平及其临床意义

目的：探讨WT1基因与急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）患者预后的关系及其用于微小残留病（MRD）监测的可能性。方法收集58例初发AML、32例初发ALL、40例AML-完全缓解（CR）、28例ALL-CR患者及31例同期三系增生活跃患者（对照组）骨髓单个核细胞,利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测WT1基因的表达,建立WT1基因在各组间的表达阈值,以WT1拷贝数／ABL拷贝数×100%表示WT1基因的相对表达量。结果初发AML患者与对照组间WT1基因中位相对表达量差异有统计学意义[20.880%（3.550%～48.500%）比0.026%（0～0.240%）,Z＝-7.74,P＜0.0001]。AML-CR患者[0.102%（0～5.380%）]与初发AML患者间WT1基因中位相对表达量差异有统计学意义（Z＝-8.34,P＜0.0001）。此外,WT1基因表达高于阈值（20.880%）的AML患者第1个疗程CR率为60.7%（17／28）,而表达低的患者为76.7%（23／30）。AML患者复发时WT1表达升高。与对照组相比,初发ALL患者WT1基因中位相对表达量[0.350%（0.021%～10.780%）]升高（Z＝-2.58,P＜0.05）,但与ALL-CR患者[0.038%（0～2.800%）]相比,WT1基因中位相对表达量差异无统计学意义（P＝0.065）。结论 WT1基因在AML中的表达相对较高,其可能成为AML患者预后评估及MRD监测的有效指标,但并不适用于ALL患者。     

THE CLINICAL SIGNIFICANCE OF MULTIDRUG RESISTANCE GENE(mdr1) EXPRESSION IN ACUTE LEUKEMIA

ＴＨＥＣＬＩＮＩＣＡＬＳＩＧＮＩＦＩＣＡＮＣＥＯＦＭＵＬＴＩＤＲＵＧＲＥＳＩＳＴＡＮＣＥＧＥＮＥ（ｍｄｒ１）ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＩＮＡＣＵＴＥＬＥＵＫＥＭＩＡＤｏｎｇＺｕｏｒｅｎ董作仁ＬｕｏＪｉａｎｍｉｎ罗建民ＸｕＷｅｎｘｉｎ徐文新ＷａｎｇＦｕｘｕ...     

重组人GM-CSF逆转录病毒基因转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的　建立逆转录病毒介导的 GM- CSF基因转移系统 ,为 GM- CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法　应用基因重组技术将 GM- CSF c DNA克隆于逆转录病毒载体p DORneo,获得重组载体 p DORGM。经脂质体介导将其转染于病毒包装细胞系 PA317细胞 ,经NIH3T3细胞检测病毒滴度 ,NIH3T3放大实验检测辅助病毒 ,并用高滴度病毒感染人乳腺癌细胞系MCF- 7。结果　GM- CSF基因克隆入逆转录病毒载体 ,经 PA317细胞包装产生病毒 ,最高的病毒滴度为 1× 10 6CFU/ ml,且没有发现辅助病毒存在。重组病毒感染的人乳腺癌 MCF- 7细胞在体外长期培养中保持稳定分泌 GM- CSF,活性在 50 0～ 80 0 U/ 10 6细胞 / 2 4小时。结论　建立的逆转录病毒介导的GM- CSF基因转移系统安全、有效 ,为 GM- CSF应用于肿瘤基因治疗提供了实验基础。     

多重巢式反转录-聚合酶链反应检测白血病相关融合基因及其临床意义

 目的　检测白血病相关29种染色体结构畸变形成的融合基因并对其在白血病MICM分型、危险度分组和微小残留病（MRD）检测中的临床价值进行分析。方法　采用多重巢式反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法对141例白血病患者进行29种染色体结构畸变形成的融合基因进行分析,并与骨髓染色体检测结果进行对比分析。结果　141例白血病患者骨髓或外周血标本中, 66例（46.8 %）阳性,具有13种染色体结构畸变产生的融合基因, 包括PML／RARα、bcr-abl p210、bcr-abl p190、AML1／ETO、TEL／AML1、E2A／PBX1、MLL／AFX、MLL／AF6、MLL／AF9、dupMLL、MLL／ENL、CBFβ／MYH11、TLS／ERG等。在78例ALL和57例AML标本中,分别有27例（47.4 %）和33例（42.3 %）为阳性,染色体结构畸变产生的融合基因分别为7种和6种。结论　采用多重巢式RT-PCR 方法,可快速分析29种染色体结构畸变产生的融合基因,可同时筛选出29种急性白血病的常见染色体易位,帮助临床诊断、疾病危险度分组、预后判断和治疗后微量残留病的检测。