小鼠造血干细胞因子基因克隆及在 C H O 细胞中的表达

目的： 克隆造血干细胞因子（ Ｓ Ｃ Ｆ）并在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达。方法： 采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法从ｐ Ｒ Ｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ（含 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ）中钓取 Ｓ Ｃ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 膜外段活性区,克隆入真核表达载体ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３,转染入 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞;用 Ｒ Ｔ－ Ｐ Ｃ Ｒ 方法检测 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 水平表达及通过协同刺激骨髓细胞集落形成来检测转染细胞上清的生物活性。结果：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 的 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞可表达 Ｓ Ｃ Ｆｍ Ｒ Ｎ Ａ,其细胞培养上清可协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ刺激骨髓细胞形成集落数比 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 单独作用高 ２ 倍,转染外源基因对细胞周期没有明显影响。结论：转染 Ｓ Ｃ Ｆｃ Ｄ Ｎ Ａ 在 Ｃ Ｈ Ｏ 细胞中表达,转染细胞上清协同 Ｇ Ｍ － Ｃ Ｓ Ｆ 刺激骨髓细胞集落的形成,而本身对集落的形成没有影响。     

人血小板生成素cDNA转染及表达产物对实验性血小板减少症的…

目的 探讨将人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ转染ＣＯＳ－７细胞中及表达产物对实验性小鼠血小板减少症（卡铂诱导）的治疗作用。方法 以哺乳动物表达载体ＰＣＩｎｅｏ为运载体，构建受控于ＳＶ４０早期启动子ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ的表达载体，利用脂质体介导转染技术，将重组ＰＣＩｎｅｏ－ｈＴＰＯ表达载体转染ＣＯＳ－７细胞中，经Ｇ４１８作用后，对挑选阳性克隆ＣＯＳ－７细胞中ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和ｍＲＮＡ分别进行ＰＣＲ     

阳离子脂质体介导血管内皮生长因子的基因表达

以ＲＴ－ＰＣＲ自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子全长ｃＤＮＡ，测序鉴定正确后，插入真核表达载体ｐＡｄＣＭＶｌｉｎｋ１中的ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点。用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ体外介导转染ＣＨＯ细胞，收集转染后２４ｈ至第５ｄ的培养上清，用ＲＴ－ＰＣＲ检测转染细胞中外源ＶＥＧＦ１６５基因的转当，Ｍｉｌｅｓ试验检测细胞培养上清中ＶＥＧＦ的生物活性。     

H—2K^b cDNA的克隆及其在多种真核细胞中的表达

目的 克隆Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ及研究其在多种真核细胞中的表达。 方法 ＲＴ－ＰＣＲ法扩增Ｈ－２Ｋ＾ｂｃＤＮＡ,克隆入双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ,ＰＡ３１７包装出重组病毒后,分别感染ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７及ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ分析目的基因表达,ＦＡＣＳ分析Ｈ－２Ｋ＾ｂ在细胞膜上的表达。结果 以双顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ介导,分别建立了Ｈ－２Ｋ＾ｂ基因转导细胞：ＮＩＨ３Ｔ     

鼠内皮细胞抑制素的克隆及在COS-7细胞中的分泌表达

目的从小鼠肝脏中克隆出ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ并在ＣＯＳ－７细胞中分泌表达,为其在肿瘤抗血管基因治疗中的应用打下基础。方法用ＲＴ－ＰＣＲ从鼠肝脏扩增出内皮细胞抑制素ｃＤＮＡ并克隆入测序载体ＰＵＣ－Ｔ测序证实后,装入分泌表达载体ｐＳＥＣ－ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ,用ＤＥＡＥ－葡聚糖转染ＣＯＳ－７细胞,从ｍＲＮＡ水平及蛋白水平检测内皮细胞抑制素的表达。结果测序结果显示所克隆的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ ｃＤＮＡ     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式ＰＣＲ的方法从Ｒａｊｉ细胞中扩增出人ＣＤ８０ ｃＤＮＡ，并将这一ｃＤＮＡ克隆入载体ｐＵＣ１９中，经ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，进行初步鉴定后，再将入ＣＤ８０ｃＤＮＡ克隆到ｐｃＤＮＡ表达载体上，构建成ｐＣＤ－ＣＤ８０重组质粒。应用脂质本介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞后，用ＳＡＢＣ法进行瞬时表达的检测。结果表明，转染后４８ｈ就具有明显人ＣＤ８０基因的表达产物。     

人血小板生成素cDNA的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的：克隆人血小板生成素（ｈＴＰＯ）ｃＤＮＡ，并研究其在ＣＯＳ－７细胞中的表达。方法：通过ＲＴ－ＰＣＲ法获得ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ，测序后克隆到真核表达载体ｐＥＤ上，以ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ－７细胞，巨核细胞集落形成培养法测表达产物活性。结果和结论：获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ和献报道的序列一致。转染细胞ＲＮＡ斑点杂交结果显示ＴＰＯ ｃＤＮＡ获得转录，转染后４８和７２ｈ的细胞上清均可测到Ｔ     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞 …

目的 构建丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｐｒｅＳ融合蛋白的真核表达载体。方法 用ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,用脂质体转染试剂将其转入ＣＯＳ７细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白,结果Ｅ２－ｐｒｅＳ融合蛋白基因包括了全长的ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,嵌合基因长度约１．６ｋｂ表达载体在ＣＯＳ７细胞表达出     

rhG-CSF cDNA高表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５＇ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组入表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ｐＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５２ｎｇ／ｍｌ，７２ｈ为２３０ｎｇ／ｍｌ，显示ｒｈＧ－ＣＳＦ获得了暂时性高表达。结论：ｐＥＤ－ＧＣＳＦ是一个能在哺乳动物细胞中高效表达ｒｈＧ－ＣＳＦ的真核表达质粒。     

rhG—CSF cDNA表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达

目的：构建一个能在哺乳动物细胞中高表达人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）ｃＤＮＡ的重组质粒。方法：利用化学合成引物，进行ＰＣＲ，对人Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ５ＡＵＧ侧翼序列进行翻译优化突变。测序确证后，重组人表达载体ｐＥＤ，构建成质粒ＰＥＤ－ＧＣＳＦ，用ＤＥＡＥ－Ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，ＥＬＩＳＡ法定量测定ｒｈＧ－ＣＳＦ表达水平。结果：转染ＣＯＳ７细胞后４８ｈ收集的上清ｒｈＧ－ＣＳＦ表达量为５     

GDNF cDNA在神经及非神经细胞系中的表达

研究重组ＧＤＮＦｃＤＮＡ在神经及非神经细胞系中的表达。方法；重组克隆，基因转染及ＲＴ－ＰＣＲ。结果；ＣＶ１及ＳＨ－ＳＹ－５Ｙ细胞中无ＧＤＮＦ内源性表达，转基因后出现ＧＤＮＦ表达条带。ＮＧ１０８－１５细胞有ＧＤＮＦ的内源性表达，转基因后表达条带增强。结论：重组ＧＤＮＦＣＤＮＡ在神经及非神经细胞系中均有较强表达，提示以此制备的工程细胞在Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ‘ｓ病基因治疗中可能具有重要作用。     

RT-PCR方法检测非神经元、类神经元、神经元细胞系中淀粉样前体蛋白基因表达

目的与方法：根据人淀粉样前体蛋白（ａｍｙｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＰＰ）基因ｃＤＮＡ序列设计的引物，提取总ＲＮＡ，利用ＲＴＰＣＲ方法检测非神经、类神经及神经细胞系ＡＰＰ基因的表达。结果：利用专门设计的引物不能检测野生型ＣＯＳ７细胞中ＡＰＰ基因的表达，但可以检测转染人ＡＰＰ基因的非神经元类ＣＯＳ７细胞，类神经元的野生型ＰＣ１２及人神经母细胞瘤细胞ＳＨＳＹ５Ｙ细胞中ＡＰＰ基因的表达。结论：利用特异设计的人ＡＰＰ基因引物及ＲＴＰＣＲ方法可以检测类神经及神经细胞系ＡＰＰ基因的表达     

RT—PCR方法检测非神经元,类神经元,神经元细胞系中淀粉样前 …

目的与方法 根据人淀粉样前体蛋白（ａｍｙｏｌｏｉｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ,ＡＰＰ）基因ｃＤＮＡ序列设计的引物,提取总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ方法检测非神经,类神经及神经细胞系ＡＰＰ基因的表达。结果 利用专门设计的引物不能检测野生型ＣＯＳ－７细胞中,ＡＰＰ基因的表达,但可以检测转染人ＡＰＰ基因的非神经元类ＣＯＳ－７细胞类神经元的野生型ＰＣ１２及人神经母细胞瘤细胞,ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞中ＡＰＰ     

含hBDNFcDNA和HTH1cDNA两个转录单位表达质粒的构建及在C …

在ＣＨＯ细胞同时表达ｂＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源因基因。方法 构建同时含ｈＢＤＮＦｃＤＮＡ和ＨＴＨ１ＣＤＮＡ两个转录单位的表达质粒并转染ＣＨＯ细胞,筛选出同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１的克隆命名为ＣＨＯｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞;用双重免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ及活性测定等方法检测外源ＨＴＨ１、ｈＢＤＮＦ基因在ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞的表达。结果 ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１同     

重组人促红细胞生成素cDNA在CHO-dhfr-细胞中的高效表达

目的：使重组人促红细胞生成素（ｒｈＥＰＯ）在ＣＨＯ细胞中获得高效表达。方法：利用基因重组构建了两个人促红细胞生成素ｃＤＮＡ重组表达质粒ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ，分别用ＤＥＡＥ－ｄｅｘｔｒａｎ法转染ＣＯＳ７细胞，作瞬时高表达，选ｐＥＦ－ＥＰＯ用磷酸钙共沉淀法转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，加入氨甲喋呤（ＭＴＸ）扩增、选择，作稳定性高表达。结果：ｐＥＤ－ＥＰＯ和ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＯＳ７细胞后７２ｈ表达量分别为１７．８和２１．０ｎｇ／ｍｌ，ｐＥＦ－ＥＰＯ转染ＣＨＯ－ｄｈｆｒ－细胞，随着ＭＴＸ浓度的增加，ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＋的克隆数减少，而混合克隆的ＥＰＯ表达量逐渐升高。筛选了一株稳定性高表达ｒｈＥＰＯ的细胞株，其３ｄ表达量为１６μｇ／ｍｌ。结论：ｒｈＥＰＯ在ＣＨＯ细胞中获得了高表达     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

粒—巨噬细胞集落刺激因子cDNA在造血祖细胞中的表达

目的；探讨逆转录病毒介导的ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ在造血母细胞中转移与表达。方法：采用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组逆转录病毒ｐＬＸＳＮ／ＧＭ和空载体ｐＬＸＳＮ转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，再将含有ＧＭ－ＣＳＦ重组逆转录病毒的细胞培养上清液感染富含造血干祖细胞群体，采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析培养细胞基因组中外源基因的整合，用Ｄｅｘｔｅｒ培养体系检测培养３周的各组细胞增殖数，结果：在     

含hBDNF cDNA和HTH_1 cDNA两个转录单位表达质粒的构建及在CHO细胞的表达

在ＣＨＯ细胞同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因。方法构建同时含ｈＢＤＮＦｃＤＮＡ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个转录单位的表达质粒并转染ＣＨＯ细胞,筛选出同时表达ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１的克隆命名为ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞;用双重免疫组化、ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ及活性测定等方法检测外源ＨＴＨ１、ｈＢＤＮＦ基因在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞的表达。结果ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１同时在ＣＨＯｈＢＤＮＦＨＴＨ１细胞得到表达;ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法检测到ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液中Ｌ－ＤＯＰＡ含量为每２４ｈ（２５．３±６．７）ｎｇ／１０６ｃｅｌｓ;ＣＨＯ－ｈＢＤＮＦ－ＨＴＨ１细胞培液可明显促进人胚脊神经根节细胞的存活和生长。结论采用多基因表达技术可以使ｈＢＤＮＦ和ＨＴＨ１ｃＤＮＡ两个外源基因同时在一个细胞中得到表达,而且表达的ｈＢＤＮＦ、ＨＴＨ１具有生物学活性     

肾细胞癌中脆性组氨酸三联体基因异常及其意义

目的 检测肾细胞癌（ＲＣＣ）组织脆性组氨酸三本（ｆｒａｇｉｌｅ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｒａｉｄ,ＦＨＩＴ）基因蛋白编码外显子及ｍＲＮＡ表达情况,了解ＲＣＣ组织中ＦＨＩＴ基因异常特征,探讨ＦＨＩＴ基因与ＲＣＣ发生发展的关系。方法 收集ＲＣＣ及相应癌周肾组织标本,提取组织ＤＮＡ及ＲＮＡ。ＤＩＧ标记ＦＨＩＴ全长ｃＤＮＡ探针。ＰＣＲ法扩增ＦＨＩＴ基因Ｅ５～Ｅ９。扩增产物电泳转膜后行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｏｌ     

CR3的Ⅰ结构域的克隆和在CHO细胞中的表达及配体结合特性的研究

研究白细胞整体合素ＣＲ３α亚基的Ⅰ结构域在配体结合中的作用。方法克隆ＣＤ１１ｂ的Ⅰ结构域，用重叠ＰＣＲ的方法将其与信号肽ＤＮＡ连接，克隆到表达载体ＰＥＥ６ＨＣＭＶ．ＧＳ，转化ＣＨＯ－Ｋ１细胞。表达的Ⅰ－结构域经ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ和ｍｏｎｏ－Ｓ柱纯化后，与Ｃ３ｂｉ进行配体结构实验。结果用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得重组的Ⅰ结构域分子量为２９ＫＤ。重组的Ⅰ结构域可以与Ｃ３ｂｉ结合，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析