人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人白血病抑制因子(LIF)和血管内皮生长因子165(VEGF165)对脊髓损伤后神经元存活有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目标：构建双基因共表达载体pIRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-LIF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES(即内部核糖体进入位点)的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp。构建的pIRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/NotI双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/NotI双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR 与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

汉坦病毒核蛋白基因片段真核表达载体的构建及鉴定

目的 确定特定小鼠ＭＨＣ Ｉ类分子Ｈ－２ｄ限制性另工提呈的汉坦病毒核蛋白（ＮＰ）抗原表位。方法 在计算机预测的基础上,以编码ＮＰ的Ｓ基因为模板,合成了３个相互重叠的基因片段,构建了以携带ＧＦＰ报告基因的ｐＥＧＦＰ－Ｎ２为持载体的重组质粒,并进行了初步表达及鉴定。结果 目的基因片段已插入质粒载体,并在转染的真核细胞内成功表达。结论 汉坦病毒核蛋白片段能够被细胞加工提呈。     

血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞

背景：血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义。 目的：克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性。 方法：采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和DNA测序的方法对提取和重组DNA 进行鉴定。pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定。 结果与结论：构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段。提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性。     

人TRAM基因真核表达载体的构建

目的 构建TRAM基因真核表达载体,为研究TRAM的功能提供研究工具。方法 首先采用PCR方法扩增人TRAM蛋白相应的编码序列,将扩增的特定片段克隆至pCMV-N-Flag真核表达载体。然后,对重组载体进行DNA测序,确认序列正确后将重组载体转染至HEK-293T细胞,并用Western blot方法检测TRAM蛋白的表达以评价载体是否构建成功。结果 菌落PCR电泳可检测到800 bp附近出现目的条带,质粒DNA测序显示载体插入705 bp的核苷酸序列,其序列与TRAM完全一致。Western blot检测到HEK-293T细胞高表达带Flag标签的TRAM蛋白。结论 基于PCR扩增、双酶切、酶连接扩增片段和载体成功构建带Flag标签的TRAM真核表达载体。构建的质粒可为进一步研究干扰素的调控和抗病毒免疫治疗提供一种研究工具。     

AngiostatinK（1—3）基因真核表达载体的构建,鉴定和表达

构建携带人ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ的真核表达载体,并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞中表达。方法将带有分泌信号的ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎＫ（１－３）ｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤ－ＮＡ－ＳＡＫ（１０３）,采用酶切鉴定结果。     

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line - derived neurotrophic factor,GDNF)和血管内皮生长因子165 (vascular endothelial growth factor 165,VEGF₁₆₅)在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建双基因共表达载体pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅并对其进行鉴定。方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES₂-EGFP多克隆位点构建成为pIRES₂-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES₂-VEGF₁₆₅-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES₂-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR 与 Western-blot 方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES₂-GDNF-VEGF₁₆₅双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出 IRES-VEGF₁₆₅片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF₁₆₅片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

微小隐孢子虫CPl5基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的：构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCB3．1—15，观察其在Hela细胞中的表达。方法：用BglⅡ从pMD18-T-15中酶切得到CP15基因，将其插入真核表达载体pCR3．1( )的BamH I位点，构建CP15真核表达载体pCR3．1—15，脂质体介导法将其转染Hela细胞，并用G18加压筛选，用RT—PCR方法检测外源CP15基因的转录，用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果：酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3．1-15；外源CP15基因能在转染细胞中有效转录；ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论：构建的pCR3．1—15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。     

人源抗-HAV Fab真核表达载体的构建及表达

目的 构建人源抗－ＨＡＶＦａｂ真核表达载体并进行表达。方法 采用ＤＮＡ重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体ｐＣｄｈｆｒｌ、ｐＣＤＮＡ３．１;以脂质体介导法转染ＣＨＯ细胞,经Ｇ４１８筛选细胞,ＥＬＩＳａｂ基因的表达。结果 成功地构建了Ｆａｂ表达载体。转染细胞后,经ＥＬＩＳＡ检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Ｆａｂ片段。结论Ｆａｂ真核表达载体的构建及其在ＣＨＯ细胞中的表达     

人神经营养素-3基因真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建含有人NT-3基因真核表达载体pcDNA3．1-NT-3。方法：采用PCR技术，扩增编码神经营养素-3基因，克隆到PMD18-T载体上，再亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1的Hind Ⅲ和BamHI位点。结果：重组真核表达载体pcDNA3．1-NT-3经酶切鉴定证明NT-3基因正向插入真核表达载体中，碱基序列的测定证明重组质粒中含有人的NT-3基因序列。结论：构建的真核表达载体携有人NT-3cDNA序列，并且含有巨细胞病毒强启动子、ploy(A)加尾信号和neo标志基因，可能具有转染多种哺乳类细胞通用性，可用于NT-3基因的真核表达及基因治疗的研究。     

IL—2—preS融合基因真核表达载体的构建与鉴定

ＩＬ－２－ｐｒｅＳ融合基因真核表达载体的构建与鉴定汤丽霞马文煜杨晓峰张富泉任君萍（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）以往研究表明，诱导保护性免疫的目的基因直接体内转染，能诱导产生抗体及ＣＤ８＋的ＣＴＬ，产生有效免疫保护作用。ｐｒｅＳ具有强...     

pIRES2-BDNF-VEGF165真核表达载体的构建与鉴定

背景：人脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。 目的：构建双基因共表达载体pIRES2-BDNF-VEGF165并对其进行鉴定。 方法：采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人脑源性神经营养因子基因,然后将人脑源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建为pIRES2-BDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有即内部核糖体进入位点的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和 DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染 HEK293细胞,利用RT-PCR与 Western-blot 方法检测双基因的表达。 结果与结论：DNA测序显示,提取的人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段长度分别为744 bp和576 bp。构建的pIRES2-BDNF-VEGF165双基因共表达载体经Eco RⅠ/Bam HⅠ切出BDNF条带,经BDNF/NotⅠ双酶切后可见 IRES- VEGF165基因片段,经 Eco RⅠ/NotⅠ双酶切后可见BDNF-IRES-VEGF165基因片段。RT-PCR 与Western-blot 方法检测显示,此载体转染后,HEK293 细胞均能表达人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。结果证实,实验成功构建了人脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 双基因真核表达载体。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

骨形成蛋白-7基因逆转录病毒载体的构建及其表达

目的：实现骨形成蛋白—7(BMP—7)基因在骨髓基质干细胞中的稳定、长久表达。方法：构建重组BMP—7逆转录病毒表达载体。通过PT67包装细胞克隆，嘌呤霉素筛选、扩增，获得含BMF—7基因的逆转录病毒液，直接感染骨髓基质干细胞，用免疫组化方法检测BMP—7的表达。结果：成功地构建了重组BMP—7逆转录病毒表达载体，并可在骨髓基质干细胞中表达BMP—7。结论：重组逆转录病毒表达载体转染的靶细胞可表达BMP—7，为组织工程中骨和软骨种子细胞的研究奠定了基础。     

Construction of eukaryotic expression vector of TSLC1 gene

Introduction

To construct a eukaryotic expression vector of the tumour suppressor in lung cancer 1 (TSLC1) gene, so as to explore the mechanisms of tumour suppression of the gene theoretically.

Material and methods

The open reading frame (ORF) of TSLC1 gene was amplified with RT-PCR from normal human foreskin acrobystia, and cloned to pMD19-T simple vector (TA Clone method). The resultant plasmid was transformed into Escherichia coli JM109 for amplification. The TA Clone recombinant was digested by double restriction enzyme (Bgl II/EcoR I) and analysed with agarose gel electrophoresis. The positive one was sequenced. The inserted DNA fragment was recovered, and then it was mounted into the eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP, transformed into E. coli JM109 for amplification. A positive recombinant plasmid named pIRES2-EGFP-TSLC1 was confirmed by Bgl II/EcoR I double-enzyme digestion analysis.

Results

RT-PCR amplified the ORF of the TSLC1 gene. It was approximately 1400 base pairs. The obtained DNA was confirmed a high degree of homology with the sequence of TSLC1 cDNA sequence ({"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"AY358334","term_id":"37181792"}}AY358334) stored at GenBank.

Conclusions

Construction of a TSLC1 eukaryotic expression vector was successful, and it has established a solid foundation for further study.     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

小鼠微小RNA miR-21真核表达载体构建及其在293细胞的活性表达

目的构建小鼠微小RNA miR-21的真核表达载体,在人胚肾293细胞中验证其活性表达,为进一步以此载体研究miR-21的功能打下基础。方法根据小鼠miR-21的成熟序列及其上下游约170 bp的序列设计引物,利用PCR技术从小鼠基因组DNA扩增含有miR-21前体的片段382 bp,克隆到质粒pRc/CMV,对重组质粒经双酶切及测序分析,鉴定完全正确后转染人胚肾293细胞,G418(1 000 mg/L)筛选后获得miR-21稳定表达细胞系,Northern blot验证其在293细胞的过表达;同时构建pmiR-21-Luc reporter荧光素酶报告质粒,与miR-21重组质粒共转染293细胞进行荧光素酶活性分析,验证其调控活性。结果成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,其可以在293细胞中稳定高效表达,荧光素酶活性实验证实其有生物活性。结论成功构建小鼠miR-21的真核表达载体,为进一步探讨miR-21的生物学功能奠定了实验基础。     

Trim6真核表达载体的构建及表达

目的:构建人Trim6的真核表达载体pcDNA3.1(+ )-Trim6,并观察其在HEK293T细胞中的表达.方法:提取HeLa细胞总RNA,用RT-PCR方法扩增出Trim6编码区全长基因片段,克隆到pcDNA3.1(+),通过酶切、菌落PCR及测序进行鉴定.将该载体转染HEK293T细胞,用蛋白印迹检测Trim6蛋白的表达.结果:通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建人Trim6表达载体,该载体可以在HEK293T细胞细胞系中表达Trim6.结论:构建Trim6真核表达载体pcDNA3.1(+)-Trim6,为研究Trim6在固有免疫应答中的作用奠定了基础.     

pRluc-hKOR-pcDNA3.1 真核重组质粒的构建及在HEK293细胞中的表达

目的： 构建与海肾荧光素酶(renilla luciferase,Rluc)融合的人κ型阿片受体（kappa opioid receptor, KOR）的真核表达载体,用于生物发光共振能量转移法检测人KOR与其它受体间的相互作用。方法: 以质粒pcDNA3.1-hKOR为模板,PCR方法扩增人KOR。扩增的人KOR用NotⅠ和XhoⅠ双酶切,同时用这2种酶双酶切质粒pRluc-pcDNA3.1。然后将这2种酶切产物按常规方法连接、转化大肠杆菌Top10。挑取菌落培养,提取质粒,然后进行酶切鉴定,最后进行测序。将测序正确的重组载体用脂质体法转染人胚胎肾（human embryonic kidney 293,HEK293) 细胞,免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察。结果: 扩增出了1条约1.2 kb的片段,与预期的人KOR大小相符,质粒酶切结果显示重组质粒 pRluc-hKOR-pcDNA3.1被切成2条片段,其中1条为pRluc-pcDNA3.1载体大小,另1条为目的片段大小。经测序鉴定,序列与GenBank (NM_000912)中的序列高度同源。共聚焦显微镜观察显示,阿片受体主要表达在细胞膜上。结论: 构建成功了pRluc-hKOR-pcDNA3.1重组真核表达载体,此表达载体可用于检测人KOR与其它受体之间的相互作用。     

pEGFP/hVEGF121融合蛋白真核表达载体的构建及在骨髓间质干细胞中的表达

目的：构建携带人血管内皮细胞生长因子121及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒并检测其在骨髓间质干细胞（MSC）中的表达。 方法： 采用PCR技术，以pCD/hVEGF121质粒为模板扩增VEGF121基因全长，采用PCR产物的粘端克隆法，将VEGF121定向克隆入pEGFP-C1的多克隆位点，构建pEGFP/hVEGF121重组质粒，酶切、PCR及序列分析鉴定，脂质体介导转染体外培养的MSC，荧光显微镜及免疫细胞化学染色检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达。 结果： PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF121正确连接至pEGFP-C1的多克隆位点，pEGFP/hVEGF121重组质粒转染MSC后，荧光显微镜及免疫细胞化学检测EGFP/VEGF蛋白在MSC中存在表达。 结论： 成功构建了携带人VEGF121及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒，并在MSC中获得表达，为进一步研究VEGF基因治疗缺血性心血管疾病及MSC的分化奠定了实验基础。