对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐的合成及其在重组人内皮抑素中的定点引入

以对硝基-L-苯丙氨酸为原料,通过5步反应制备纯度较高的对叠氮-L-苯丙氨酸盐酸盐。利用构建好的重组表达载体和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA(MjTyrRS/tRNA)系统将对叠氮-L-苯丙氨酸(pAzPhe)定点(31位)引入到人内皮抑素分子中,表达人内皮抑素中突变体——rhEs31m。对分离纯化所获得的目的产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,突变体rhEs31m电泳纯度达90%以上,同时可被抗人内皮抑素抗体特异性识别。通过MTT法检测rhEs31m体外抗人脐静脉内皮细胞增殖活性,结果显示:与野生型rhEs相比,rhEs31m保留了大部分生物活性。本实验表明单个pAzPhe的定点引入并未破坏重组人内皮抑素的空间结构和生物活性。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑索蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因，连接PGEM-T载体，测序确认，定向克隆入pBV220表达载体，转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实，所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因，构建表达载体在大肠杆菌中表达，经SDS-PAGE分析，出现特异性蛋白质条带，并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达．表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖，为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人内皮抑素基因的克隆、表达、纯化及活性测定

目的 获得有生物学活性的人内皮抑素蛋白。方法 用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)得到人内皮抑素编码区基因,连接PGEM-T载体,测序确认,定向克隆入pBV220表达载体,转化大肠杆菌DH5α进行表达、纯化及活性测定。结果 经测序分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素基因,构建表达载体在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,并具有生物学活性。结论 人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖,为应用内皮抑素进行抗血管生成治疗奠定了基础。     

人内皮抑素cDNA克隆和初步表达

目的：克隆人内皮抑素基因,获得初步表达产物,为进一步研究打下基础。方法：用RT-PCR方法从中国汉族人正常肝组织扩增出内皮抑素cDNA,T/A插入pUCm-T载体,测序,再插入表达载体pKPL-3a,转化大肠杆菌POP2136,42℃诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白。结果：中国人内皮抑素cDNA开放阅读框架全长552bp,编码184个氨基酸,其85位谷氨酸和98位天冬氨酸密码子的第三位碱基出现改变,但编码的氨基酸不变。结论：构建了中国人内皮抑素的克隆载体和表达载体,初步表达了约20kD人重组内皮抑素。     

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的:将人内皮抑素(endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达.方法:将endostatin基因定向插入表达载体pQE-31 BamH I/Kpn I位点,构建重组质粒pQEN,转化E.coli M15,进行原核表达.结果:在IPTG的诱导下,endostatin基因在重组转化株E.coli M15 (pQEN) 中获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为22×103 u,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的34.6%.结论:从组织中克隆endostatin基因并进行原核表达是可行的方法.     

重组人内皮抑素在酵母中的表达及对人肺腺癌Astc－a－1细胞生长的抑制

OBJECTIVE: To achieve expression of recombinant human endostatin (rhES) in a highly efficient foreign gene expression system, the yeast strain Pichia pastoris, and to evaluate the inhibitory effect of rhES on the growth of nude mouse pulmonary adenocarcinoma cells. METHODS AND RESULTS: The rhES gene was efficiently expressed in the yeast strain, and heparin affinity chromatography yielded highly purified endostatin identified by Western blotting, which proved to significantly inhibit the growth of the ECV-304 cells in vitro and also the growth of the lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice. CONCLUSIONS: The rhES gene can be expressed in Pichia pastoris, and has the ability to restrain the growth of ECV-304 cells and lung adenocarcinoma Astc-a-1 in nude mice, showing important potentials for future clinical applications.     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用

目的研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响。方法RT-PCR获取人内皮抑素基因，通过酶切，测序鉴定获取的hES，MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。结果获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因；hES基因转染HUVEC细胞24h、4h和72h，细胞增殖率均较正常组明显降低（P〈0．05），而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化。结论hES基因能够抑制HUVEC增殖。     

重组人内皮抑素的初纯工艺探索

目的：通过对比实验，找出一条成本低、纯度高的重组人内皮抑素（rhEndostatin)纯化工艺路线。方法：将rhEndostatin包涵体裂解后用缓冲液稀释至不同尿素（Urea)浓度，上分子筛层析；再将含2－巯基乙醇（2－ME）和不含2－ME的样品分别上分子筛层析；将所得蛋白样品电泳，测定活性，比较结果。结果：使用不含Urea和2－ME的缓冲液所得样品纯度、活性、回收率均很好。结论：用不含Urea和不含2－ME的纯化方法是最佳工艺路线。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的毕赤酵母菌株;观察纯化的重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用。方法 利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组,获得可分泌表达人内皮抑素(endostatin)的菌株。用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子(bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组,分别给予rhES和磷酸缓冲盐液(PBS)皮下注射,每日1次,连续14d。观察2组小鼠肿瘤生长情况。结果经筛选获得表达量较高的转化菌株,其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血符内皮细胞系ECV－304细胞的增殖,与对照组比较具有显苫差异(P＜0．001),动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长(P＜0．001)。结论用毕亦酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生物学活性,能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。     

重组人内皮抑素诱导人脐带静脉血管内皮细胞凋亡

目的观察人内皮抑素重组蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法采用细胞凋亡的荧光检测法检测对内皮细胞凋亡的影响。MTT法观察不同浓度的重组人内皮抑素对人脐带静脉血管内皮细胞（ECV304）增殖的抑制作用。结果重组人内皮抑素具有明显的抑制内皮细胞增殖的作用，ED50=550ng／ml，随重组蛋白浓度的增加抑制作用更为明显。结论重组人内皮抑素对细胞增殖的抑制与其浓度呈正相关，存在剂量效应关系；内皮抑素抗血管生成的机制与其抑制内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡有关。     

重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用

目的探讨重组人血管内皮抑制素对人脑胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法体外培养人脑胶质瘤细胞,设立对照组与重组人血管内皮抑制素实验组（终浓度分别为50、100、150 ng/ml）,采用MTT法来判定该抑制因子对人脑胶质瘤细胞有无抑制作用。结果对照组OD值为0.302±0.012,实验组的OD值分别为0.284±0.006,0.218±0.014,0.175±0.012,P值均〈0.05。结论重组人血管内皮抑制素能够抑制人脑胶质瘤细胞的增殖且呈剂量依赖性。     

重组人血管内皮抑制素联合同步放化疗治疗鼻咽癌的疗效观察

摘要：目的  分析重组人血管内皮抑制素联合同步放化疗对鼻咽癌患者预后和肿瘤恶性程度的影响。方法  选取2012年11月-2015年1月在该院接受治疗的78例鼻咽癌患者作为研究对象,根据治疗方式分为接受重组人血管内皮抑制素联合同步放化疗的观察组36例,接受单纯同步放化疗的对照组42例。对比两组患者治疗后鼻咽癌预后相关因子蛋白表达量、血清生长因子水平、血清病情相关因子水平差异。结果  观察组患者治疗后鼻咽癌标本中乙酰肝素酶、蛋白激酶CK2β、缺氧诱导因子-1α、潜伏膜蛋白蛋白表达量均低于对照组（P <0.05）;观察组患者治疗后血清转化生长因子β1、血小板源性生长因子-β、表皮生长因子、表皮生长因子受体、血管内皮生长因子值均低于对照组（P <0.05）;观察组患者治疗后血清巨噬细胞炎性蛋白-3α、α-羟基丁酸脱氢酶、细胞角蛋白19片段、胸苷激酶-1、Ⅲ型前胶原、层粘连蛋白值均低于对照组（P <0.05）。结论  鼻咽癌患者接受重组人血管内皮抑制素联合同步放化疗,可以降低肿瘤恶性程度并优化治疗预后,具有积极的临床意义。

     

Effect of recombinant human endostatin on endometriosis in mice

Background Direct and indirect evidences have suggested that angiogenesis is a prerequisite for the development of endometriosis. Aiming at offering experimental evidences for anti-angiogenesis therapy, we transplanted the eutopic endometrium from patient with endometriosis into the severe combined immunodeficiency disease (SCID) mice, to evaluate the effect of the endostatin on the growth and angiogenesis of the established endometriosis lesions in SCID mice model.Methods Eutopic endometrium of women with endometriosis was transplanted into the SCID mice. The mice were randomized into treatment (n=10) and control groups (n=10). Two weeks after the implantation of endometrium fragment, the treatment group was injected with recombinant human endostatin YH-16 into the peritoneal cavity (2 mg·kg(-1)·d(-1)), whereas the control group received equivalent volume of PBS (200 &micro;l/d). The volume of endometriotic lesions in SCID mice was measured every three days, and all the treatment lasted for 14 days. Immunohistochemistry was used to determine microvessel density (MVD) and the expression of VEGF. The results were analyzed by t test and χ(2) test to value the treating effect. Results Compared with the control group, growth of endometriosis lesion was reduced in the mice treated with YH-16. Statistically significant differences in the volume and weight of the ectopic lesions were observed between the treatment and the control groups (P&lt;0.05). Microscopical examination showed that after being treated with YH-16, the volume of the endometrial tissues decreased, the glands depauperated, and the glandular epithelium partially degenerated. Necrotic debris was observed in the endometrial stroma. MVD and expression of VEGF in the treatment group were significantly lower than those in the control group (P&lt;0.05). Conclusions Recombinant human endostatin affects the maintenance and growth of endometriotic tissues by inhibiting angiogenesis and reducing the expression of VEGF in ectopic lesion. The angiostatic agent may be promising as a therapy for endometriosis.     

携带人分泌型内皮抑素基因重组腺病毒的制备和鉴定

目的制备包含人分泌型内皮抑素基因的重组腺病毒,为下一步探讨其在血管生成依赖性疾病的治疗研究中的应用提供基础。方法以T-Endostatin质粒为模板,通过PCR扩增回收hEndostatin,将hEndostatin连接到pShuttle2中,构建pShuttle2-hEndostatin表达质粒,将此表达质粒连接到缺陷型腺病毒载体,构建Ad-hEndo。其线性化后转染HEK293T细胞,纯化后的重组腺病毒Ad-hEndo在HEK293T细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,并测定其滴度。结果利用PCR反应进行鉴定,扩增得到的hEndostatin经酶切鉴定,DNA测序证实为重组腺病毒,测定病毒滴度为5.2×109PFU/ml。结论本实验成功构建了人分泌型内皮抑素重组腺病毒Ad-hEndo,可直接用于血管生成依赖性疾病基因治疗的实验研究。     

HPLC法同时测定芦根中对香豆酸和阿魏酸含量

采用HPLC法同时测定对香豆酸和阿魏酸的含量以评价芦根质量。芦根经碱性乙醇水溶液回流提取对香豆酸和阿魏酸,Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),乙腈-0.3%醋酸水溶液流动相梯度洗脱分离,紫外310 nm波长检测。对香豆酸和阿魏酸分别在0.2~200μg/m L和0.1~120μg/m L范围有良好线性,平均回收率分别为(96.9±2.91)%和(98.7±1.78)%。测得15批市售芦根饮片中对香豆酸和阿魏酸的含量(x珋±s,max~min)分别为(0.88±0.16,1.21~0.70)%和(0.41±0.035,0.49~0.36)%。所建立的对香豆酸和阿魏酸含量的同时测定方法可用于芦根质量的评价。     

Endostatin基因mRNA在卵巢上皮癌中的表达及其临床意义

目的探讨Endostatin基因mRNA在卵巢上皮癌中的表达以及临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应技术检测48例卵巢上皮癌组织和18例正常卵巢组织中Endostatin基因的表达。结果①卵巢癌组织中Endostatin基因的表达(平均0.525;范围0.09～1.31)明显高于正常卵巢组织(平均0.28;范围0.08～0.38;P<0.05)。②Endostatin基因在晚期(Ⅲ～Ⅳ期)上皮癌组织中的表达明显高于早期(Ⅰ～Ⅱ期)上皮癌(P<0.05),而与年龄、病理类型、病理分级无关。结论Endostatin基因在卵巢癌上皮癌组织中的表达比正常组织表达高,在晚期卵巢癌上皮癌组织中的表达比早期高。本实验结果为上皮性卵巢癌的生物治疗提供了新的治疗策略。