黏着斑激酶siRNA抑制结肠癌细胞株侵袭的机制研究

目的研究胃泌素-胆囊收缩素2受体（CCK2R）-黏着斑激酶（FAK）信号通路在人结肠癌细胞侵袭过程中的作用,探讨通过FAK siRNA降低FAK表达抑制癌细胞侵袭的可行性。方法使用CCK2R的真核表达载体pCR3.1/CCK2R,转染人结肠癌细胞株Colo320,使用RT-PCR检测细胞CCK2R表达情况。设计并合成针对FAK的siRNA,转染细胞,抑制FAK表达;使用胃泌素刺激结肠癌细胞,免疫沉淀和蛋白质印迹法检测不同情况下FAK第397位酪氨酸（tyr-397）磷酸化表达情况;Boyden小室法检测相应细胞侵袭力变化。结果真核表达载体pCR3.1/CCK2R可以有效增加CCK2R表达,增加CCK2R可以增强胃泌素促FAK tyr-397磷酸化和细胞侵袭力作用。使用RNA干扰技术可以明显降低细胞内FAK tyr-397磷酸化,并抑制胃泌素促结肠癌细胞侵袭作用。结论胃泌素-CCK2R-FAK信号通路在结肠癌细胞侵袭和转移过程中发挥关键作用,阻断FAK表达可以有效抑制胃泌素促结肠癌细胞侵袭作用。     

胃泌素促进人大肠癌细胞系Colo320WT侵袭力增加的分子机制探讨

目的 探讨胃泌素促进入大肠癌细胞侵袭力增加的分子机制。方法 脂质体转染表达胃泌素受体（CCK-2R）的pCR3．1／GR质粒于结肠癌细胞Colo320中,G418筛选出稳定表达CCK-2R的阳性克隆,逆转录PCR和免疫印迹鉴定,转染成功命名为Colo320WT。应用1×10^-8mol／L胃泌素以时间梯度0、1、6、12、24、48h干预Colo320WT细胞,同时应用胃泌素受体拮抗剂L365,260干预Colo320WT细胞30min,再加1×10^-8 mol／L胃泌素干预12h。免疫印迹检测Colo320WT细胞中的磷酸化黏着斑激酶（FAK）Tyr397和总FAK表达。共聚焦显微镜观察磷酸化FAKTyr397在板状伪足的定位表达。免疫共沉淀检测FAK—Src—p130^Cas-Dock180信号复合物的形成。Pull-down测定Rac活性。结果 随着胃泌素干预时间的延长,磷酸化FAKTyr397的表达量呈增加趋势,且12h达最大,但对总的FAK无明显影响,磷酸化的FAKTyr397／FAK比值分别为2．82％、9．28％、22．62％、38．59％、28．41％、14．94％。L365,260阻断后的磷酸化的FAKTyr397／FAK的比值为7．21％。定位在板状伪足上磷酸化的FAKTyr397也呈增加趋势,12h达最大。免疫共沉淀检测发现FAK、Src、p130^Cas和Dock180在胃泌素的干预下形成了信号复合物。Pull—down测定证明胃泌素能活化Rac,但对总Rac表达无影响。胃泌素受体拮抗剂1365,260阻断可胃泌素引起的效应。结论胃泌素能增加大肠癌细胞的侵袭力可能是通过其与受体作用后使FAK发生磷酸化,促进磷酸化FAKTyr397定位在板状伪足、使FAK—Src—p130^Cas-Dock180信号复合物形成以及活化Rac。     

Effect of crosstalk between EGFR and integrin signaling pathways on invasion of gastric cancer cells

目的 了解表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和整合素信号通路在胃癌细胞SGC7901中的交叉反应和对细胞侵袭增殖的影响.方法 使用EGF和Fn刺激SGC7901细胞,免疫沉淀和蛋白质电泳检测ERK、FAK和p130cas总蛋白和FAK Y397、p130cas Y410和ERK总酪氨酸磷酸化的改变;使用改良Boyden小室法检测胃癌细胞侵袭力;MTT法检测细胞增殖的改变;使用RNA干扰降低FAK表达,观察FAK低表达对交叉反应和胃癌侵袭增殖的影响.结果 ERK、FAK和p130cas总蛋白在刺激前后无变化(P＞0.05).Fn刺激后,ERK总酪氨酸磷酸化增强了2.90倍(P＜0.05),细胞侵袭力增强了2.36倍(P＜0.05),24 h MTT值升高了1.68倍(P＜0.05);EGF刺激后,FAKY397磷酸化增强了2.75倍(P＜0.05),p130cas Y410磷酸化增强了4.33倍(P＜0.05),细胞侵袭力增强了1.50倍(P＜0.05),24 h MTT值分别升高了1.76倍(P＜0.05).转染FAK siRNA组细胞,FAK Y397磷酸化表达只有对照组的0.30倍(P＜0.05);Fn刺激后,ERK总磷酸化表达只有对照组的0.66倍(P＜0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.37倍(P＜0.05),24 h MTT值只有对照组的0.63倍(P＜0.05);EGF刺激后,p130 Y410磷酸化只有对照组的0.49倍(P＜0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.48倍(P＜0.05),24 h MTT值只有对照组0.77倍(P＜0.05).结论 EGFR和整合素信号在胃癌细胞中发生交叉反应,FAK是其中的关键信号分子,阻断FAK表达可以有效抑制两条信号通路引起的胃癌细胞侵袭和增殖.     

八肽胆囊收缩素对小鼠神经元蛋白质磷酸化的影响

目的:从蛋白质可逆磷酸化修饰的角度,对小鼠神经元在八肽胆囊收缩素(CCK8)刺激下的信号转导通路进行初步研究.方法:将培养的小鼠神经元分为对照组(加入无磷培养基)、实验组(加入CCK8)、拮抗剂组(分别加入CCKA受体拮抗剂L-364 718和(或)CCKB受体拮抗剂L-365 260).采用双向电泳法观察CCK8和受体拮抗剂作用下蛋白质磷酸化水平的改变.结果:CCK8作用不同时间后,神经元蛋白质磷酸化状态发生明显改变,涉及的信号转导相关磷酸化蛋白质包括多种蛋白激酶、胞内信号分子、激素受体、转录因子等;动力学分析结果显示,主要的信号转导相关蛋白的磷酸化时间动力学曲线多数呈峰型;应用CCK受体拮抗剂作用后的结果表明,在皮质神经元中同时存在CCK的2种类型受体,其中B型受体介导的信号转导途径更复杂.结论:CCK A型、B型受体均可介导CCK8在神经元的信号转导,其中B型受体介导的信号途径可能包括肌醇磷脂信使系统、cAMP-PKA途径、MAPK途径和JNK途径等.     

表皮生长因子受体和整合素通路交叉作用对胃癌细胞侵袭的影响

目的了解表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)和整合素信号通路在胃癌细胞SGC7901中的交叉反应和对细胞侵袭增殖的影响。方法使用EGF和Fn刺激SGC7901细胞,免疫沉淀和蛋白质电泳检测ERK、FAK和p130cas总蛋白和FAK Y397、p130cas Y410和ERK总酪氨酸磷酸化的改变;使用改良Boyden小室法检测胃癌细胞侵袭力;MTT法检测细胞增殖的改变;使用RNA干扰降低FAK表达,观察FAK低表达对交叉反应和胃癌侵袭增殖的影响。结果 ERK、FAK和p130cas总蛋白在刺激前后无变化(P>0.05)。Fn刺激后,ERK总酪氨酸磷酸化增强了2.90倍(P<0.05),细胞侵袭力增强了2.36倍(P<0.05),24 h MTT值升高了1.68倍(P<0.05);EGF刺激后,FAKY397磷酸化增强了2.75倍(P<0.05),p130cas Y410磷酸化增强了4.33倍(P<0.05),细胞侵袭力增强了1.50倍(P<0.05),24 h MTT值分别升高了1.76倍(P<0.05)。转染FAK siRNA组细胞,FAK Y397磷酸化表达只有对照组的0.30倍(P<0.05);Fn刺激后,ERK总磷酸化表达只有对照组的0.66倍(P<0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.37倍(P<0.05),24 h MTT值只有对照组的0.63倍(P<0.05);EGF刺激后,p130 Y410磷酸化只有对照组的0.49倍(P<0.05),细胞侵袭力只有对照组的0.48倍(P<0.05),24 h MTT值只有对照组0.77倍(P<0.05)。结论 EGFR和整合素信号在胃癌细胞中发生交叉反应,FAK是其中的关键信号分子,阻断FAK表达可以有效抑制两条信号通路引起的胃癌细胞侵袭和增殖。     

胃泌素拮抗剂和活化T淋巴细胞联合应用对结肠癌细胞的杀伤作用

目的:探讨联合应用胃泌素拮抗剂和CD28/CD80单克隆抗体共刺激活化的健康人外周血T淋巴细胞(PBLs)在体外对结肠癌细胞株HT-29的杀伤作用.方法:分离与体外培养外周血PBLs,并用CD28/CD80共刺激活化PBLs;用含活化的PBLs和(或)胃泌素拮抗剂CI-988的RPMI 1640培养基培养HT-29细胞.MTT法检测2者对HT-29细胞的杀伤率,并用电镜观察效应细胞杀伤结肠癌细胞株HT-29的超微结构及HT-29细胞的凋亡情况.结果:胃泌素拮抗剂与活化PBLs合用,对结肠癌细胞株HT-29的杀伤率((95.81±1.99)%)大于单用胃泌素拮抗剂((66.36±1.31)%)(P＜0.05).电镜结果显示,效应细胞作用12 h肿瘤细胞就发生部分坏死,部分肿瘤细胞可见凋亡.结论:联合应用活化的PBLs和胃泌素拮抗剂CI-988可以提高对结肠癌细胞株HT-29 杀伤作用.活化的淋巴细胞杀伤结肠癌细胞可能是通过诱导肿瘤细胞坏死及凋亡2条途径来实现.     

半边旗提取物5F对高转移卵巢癌细胞HO-8910PM细胞增殖的影响及作用机制的实验研究

目的:探讨半边旗提取物5F(简称5F)对人高转移卵巢癌细胞HO-8910PM细胞增殖的影响及其作用机制.方法:以MTT法检测5F对HO-8910PM细胞增殖的影响;流式细胞术分析5F对HO-8910PM细胞周期的影响;Western blot分析NF-κB(P65)、焦点粘附激酶(focal adhesionkinase,FAK)的表达及FAK酪氨酸磷酸化水平.结果:不同浓度的5F分别处理细胞24 h后,对HO-8910PM细胞增殖有明显的抑制作用;使G0/G1期的细胞减少,阻断细胞于G2/M期;5F可使NF-κB(P65)的表达下调,上调FAK的表达,并下调FAK酪氨酸磷酸化水平.结论:5F通过影响HO-8910PM细胞周期、下调NF-κB(P65)表达及促进FAK的表达来抑制细胞生长.     

游离脂肪酸对大鼠肝细胞瘦素受体基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化的影响

目的 :探讨游离脂肪酸 (FFA)是否会对大鼠肝细胞瘦素 (leptin)受体的基因、蛋白表达及酪氨酸磷酸化产生一定的影响。　方法 :分离、培养新生Sprague Dawley大鼠肝细胞 ,分别与软脂酸 (0 .2 5mmol/L)或油酸 (0 .12 5mmol/L)孵育 12、2 4和 36h ,提取蛋白后用Western印迹法检测瘦素受体的蛋白水平。用RT PCR检测肝细胞内瘦素受体RNA含量的变化。应用免疫沉淀法检测瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度。　结果 :软脂酸和油酸孵育后大鼠肝细胞瘦素受体的蛋白表达水平在孵育 12和 2 4h后无显著变化 ,在孵育 36h后显著下调 (P <0 .0 5 ) ;瘦素受体的RNA水平在孵育 12h后无显著变化 ,孵育 2 4和 36h后显著下调 (P <0 .0 5 ) ;瘦素受体的酪氨酸磷酸化程度在孵育 12h后无显著变化 ,孵育 2 4和 36h后显著下调 (P <0 .0 5 )。　结论 :FFA可对大鼠肝细胞瘦素受体的基因、蛋白表达水平及磷酸化程度产生一定的抑制作用 ,这可能是FFA导致胰岛素抵抗的机制之一。     

抗BST-1抗体刺激介导的髓系细胞酪氨酸磷酸化及FcγR表达的研究

目的探讨髓系细胞表面BST-1(骨髓基质细胞抗原1)/CD157分子能否作为一受体介导信号传导和调节细胞表面FcγR的表达。方法制备兔抗人BST-1多克隆抗体及其F(ab')2片段,以其刺激U937细胞后,用免疫沉淀及免疫印迹法研究胞内蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化;用FACS法检测细胞表面FcγR的表达。结果抗人BST-1抗体刺激U937细胞可介导胞内多种蛋白的酪氨酸磷酸化水平增高,包括M     

粘着斑激酶基因表达与结肠癌的相关性研究

目的　研究粘着斑激酶 (focaladhesionkinase ,FAK)的mRNA在结肠癌组织和对应癌旁正常组织中的表达水平 ,探讨FAK参与结肠癌发病的可能机制。方法　采用半定量RT -PCR法检测 30例新鲜结肠癌及相对应的癌旁正常组织FAK的表达水平。结果　 30例结肠癌组织FAK阳性表达率为 86 7% ,其表达平均值为 0 794±0 2 5 0 ,对应癌旁组织FAK阳性表达率为 33 3% ,其表达平均值为 0 12 1± 0 115 ,FAK在结肠癌组织的表达水平明显高于正常癌旁组 (P =0 0 0 0 )。结论　FAK在结肠癌组织中的表达水平较正常组织明显增高 ,提示FAK在结肠癌的发病中起重要作用。     

马钱苷通过抑制蛋白磷酸酶2A催化亚基C磷酸化降低tau蛋白过度磷酸化

目的 探讨马钱苷对tau蛋白过度磷酸化的影响及其作用机制。方法 马钱苷（500、1 000 μmol/L）与人神经母细胞瘤细胞株（SK-N-SH细胞）预孵育24 h,之后加入PI3K抑制剂Wortmannin（WT）及PKA抑制剂GF-109203X（GFX）与SK-N-SH细胞孵育3 h,采用Western blotting方法观察马钱苷对tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的磷酸化,GSK-3β-Ser9、GSK-3β、PP2A催化亚基C（protein phosphatase 2A catalytic subunit C,PP2Ac）磷酸化/甲基化及PP2Ac的表达。结果 WT/GFX明显抑制p-GSK-3β-ser9的表达,引起GSK-3β活性增高,从而导致tau蛋白Thr205、Thr217、PHF-1位点高度磷酸化。马钱苷能够明显抑制模型细胞tau蛋白在Thr205、Thr217、PHF-1位点的过度磷酸化,但是不能增高p-GSK-3β-ser9的表达,提示马钱苷抑制tau蛋白磷酸化的作用不是通过影响GSK-3β通路实现的。但是实验显示马钱苷能够抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,但对Leu309位点甲基化无影响。结论 马钱苷能够抑制tau蛋白过度磷酸化,机制可能与其抑制PP2A催化亚基C Tyr307位点的磷酸化,提高PP2A活性有关,与GSK-3β通路无关。     

胰岛素对生长期长骨成骨细胞增殖及受体后P44/42MAPK活性的影响

[目的]研究胰岛素对生长期长骨成骨细胞增殖影响及受体后作用机制.[方法]用四唑蓝比色法和蛋白质免疫印迹法观察不同浓度胰岛素对成骨细胞增殖和胞内P44/42MAPK及其磷酸化的变化.[结果]胰岛素对成骨细胞的促增殖作用具浓度和时间依赖性,10-7mol/L时促增殖作用最强,96 h后细胞增殖进入平台期.用不同浓度胰岛素急性刺激成骨细胞各组的p4/42MAPK表达量差别无统计学意义(P＞0.05),但P44/42MAPK磷酸化程度随加入胰岛素浓度的增高而增强(组间P＜0.05);经胰岛素慢性处理后的各组的P44/42MAPK表达量仍差别无统计学意义(P＞0.05),但P44/42MAPK磷酸化程度却随着胰岛素浓度的升高而呈逐渐下降趋势(组间P＜0.05).[结论]胰岛素能以生长因子样的作用呈剂量依赖性的方式刺激成骨细胞生长,但高胰岛素状态以及长时间的胰岛素作用后此种增强效应消失.其受体酪氨酸蛋白激酶介导的MAPK信号途径参与了促成骨细胞的生长增殖的作用.     

去甲肾上腺素及血管紧张素Ⅱ对大鼠心肌细胞胰岛素受体及胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化的综合效应

目的:初步探讨去甲肾上腺素（NE）与血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对大鼠心肌细胞胰岛素受体β亚基（Ins-Rβ）及胰岛素受体底物1（IRS-1）酪氨酸磷酸化的综合效应,以及心肌胰岛素抵抗的机制。方法:培养新生大鼠心肌细胞。按照浓度梯度,将相同浓度的NE与AngⅡ的混合液加入培养基中,培养72 h后,采用Western blotting法检测胰岛素信号分子蛋白表达水平。另于每个实验组中加入AngⅡ受体阻断剂氯沙坦,分别观察NE与AngⅡ的独立效应。结果:相同浓度的NE与AngⅡ混合液可引起心肌细胞Ins-R、IRS-1及葡萄糖转运体4（GLUT4）等蛋白表达减少,Ins-Rβ亚基酪氨酸磷酸化等蛋白表达减少,IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白表达增加（P<0.05）。1 μmol/L氯沙坦对Ins-Rβ亚基酪氨酸磷酸化蛋白表达无显著影响（P>0.05）,可减少IRS-1酪氨酸磷酸化蛋白表达（P<0.05）。结论:相同浓度的NE与AngⅡ的共同作用可降低大鼠心肌细胞Ins-Rβ酪氨酸磷酸化水平,升高IRS-1酪氨酸磷酸化水平。NE为引起Ins-Rβ酪氨酸磷酸化水平降低的主要原因,AngⅡ升高为IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高的主要原因。     

Effect of Cigarette Smoke Extract on the Proliferation of Human Airway Epithelial Cells and Expression and Activation of FAK

The effect of cigarette smoke extract (CSE) on the proliferation of human airway epithelial cells and the possible mechanism was studied. After airway epithelial cells were treated with different concentrations of CSE for 24 h, the cell proliferation was measured by MTT and the distribution of different cell cycles by flow cytometry. The FAK expression level was detected by Western blot and the degree of tyrosine phosphorylation by immunoprecipitation. The results showed that CSE could inhibit the proliferation of human airway epithelial cells, arrest the epithelial cells in G1 phase of cell cycle, dramatically decrease the number of epithelial cells in S and G2 phases； Meanwhile CSE could decrease the expression level of FAK and the degree of its tyrosine phosphorylation. The above effects of CSE were concentration-dependent. The expression of FAK and the degree of its phosphorylation was positively correlated to the increased number of epithelial cells in G1 phase, and negatively to the number of epithelial cells in S and G2 phases. It was concluded that the mechanism by which CSE could inhibit the proliferation of human epithelial cells was contributed to the increased expression and activation of FAK.     

氯化锌和N-乙酰半胱氨酸对镉诱导人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响研究

目的研究氯化锌(ZnCl2)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl cysteine,NAC)对氯化镉(CdCl2)致人肝癌细胞SMMC-7721增殖及凋亡的影响。方法体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721分别以0、20、40、80、160和320μmol/L的CdCl2处理3、6、12、24、48h,ZnCl2预处理和NAC预处理组在CdCl2处理前分别以100μmol/L的ZnCl2和5mmol/L的NAC预处理24h,应用MTT法检测细胞相对存活率,流式细胞仪Annexin V-PI双标法检测细胞凋亡百分率。结果随着镉处理浓度的增高和时间的延长,SMMC-7721细胞存活率逐渐降低;SMMC-7721细胞凋亡率随着CdCl2浓度的增加而逐渐增加,40μmol/L及以上镉处理组与对照组相比,凋亡率显著增加,P<0.01;与相同剂量的单纯Cd处理组相比,Zn预处理组细胞凋亡率差异无统计学意义,P>0.05,与40、80μmol/L镉处理组相比,相同剂量的NAC预处理组细胞凋亡百分率显著下降,P<0.05,其余镉处理剂量的NAC预处理组细胞凋亡百分率差异无统计学意义,P>0.05。结论一定剂量的ZnCl2预处理不能显著降低镉诱导的SMMC-7721细胞凋亡,而NAC预处理可在一定程度上显著降低镉诱导的肝癌细胞凋亡百分率。     

Activated focal adhesion kinase involved in adhesion and migration of vascular smooth muscle cells stimulated by fibronectin

Objective To study the effects of focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation on smooth mu scle cells (SMCs) adhesion and migration stimulated by fibronectin.Methods Adhesion and migration of cultured SMCs were stimulated by different concentrati ons of fibronectin (FN), FAK and its phosphorylation were detected by immunoprec ipitation and Western blot. FAK antisense oligodeoxynucleotides (ODNs) were tra nsfected into SMCs by cationic lipid to investigate its modulatory effects on ty rosine phosphorylation. SMCs adhesion and migration were also measured by morph ological enumeration and modified Boyden Chambers, respectively.Results FAK were expressed when SMCs adhesion and migration were successfully simulated by different concentrations of FN. FAK phosphorylation were detected only at 20 μg/ml FN or more. FAK antisense ODNs were transfected efficiently by cationi c lipid and FAK phosphorylation was inhibited substantially. The SMCs migration rate in the 5-60μg/ml FN groups was reduced by 17.89%-27.67%. Cell migrat ion stimulated by FN at 10, 20, 40 and 60μg/ml were reduced by 23.26%, 21.6 3%, 19.31% and 17.88%, respectively (P&lt;0.05).Conclusions FAK phosphorylation and FAK-mediated signal transduction play important roles i n SMCs adhesion and migration stimulated by ECM. The process can be inhibited e ffectively by FAK antisense ODNs.