B7基因转染骨髓干／祖细胞及表达的实验研究

探索非实体瘤白血病转基因治疗的可能性,以便临床应用,方法利用脂质体为载体,将Ｂ７基因转导入骨髓干／祖细胞内,通过Ｇ４１８筛选,收集转导的阳性细胞;以ＣＤ８０单克隆抗体免疫荧光标记,观察Ｂ７基因在人骨髓干／祖细胞内基因转移及其表达的稳定性。     

脂质体介导B7基因在C6胶质瘤细胞中表达的实验研究

目的 通过脂质体介导基因转移方法,将含B7基因的重组逆转录病毒表达质粒导入C6细胞中。使之能有效的表达B7分子,探索胶质瘤免疫基因治疗的新方法。方法 用脂质体将pLXSN—B7重组表达质粒导入Wistar大鼠胶质瘤细胞系C6中,经G418筛选出阳性克隆。通过PCR、狭缝杂交及B7单克隆抗体免疫荧光方法检测B7基因在C6细胞中的整合、转录及表达情况。结果 PCR可从B7基因转导的C6细胞(C6pLXSN-B7)基因组中扩增出0．8 kb的B7基因片断;以B7为探针狭缝杂交显示C6pLXSN—B7细胞中有B7基因的转录;以抗-B7单克隆抗体进行的免疫荧光检测显示C6pLXSN—B7细胞表面有B7分子的表达,而对照组肿瘤细胞(C6pLXSN、C6)则无B7分子的表达。结论 脂质体介导B7基因转移方法可将B7基因完整整合到C6细胞基因组中并使之能稳定、有效的表达。     

对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用mGM-CSF基因转染

目的探讨小鼠粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(mGM-CSF)基因转导对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果.方法应用脂质体将含有mGM-CSF基因的真核表达载体转染B16小鼠黑色素瘤细胞,经G418加压筛选后,挑选表达mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞.观察转导或未转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞在Balb/c小鼠体内的肺转移.结果转导mGM-CSF基因的B16黑色素瘤细胞可以稳定表达mGM-CSF,在小鼠模型上其肺转移灶数目显著少于未转染基因的黑色素瘤细胞对照组,二者差异显著(n=5,125.8±34.3vs27.8±24.0,P<0.01).结论mGM-CSF转导可显著抑制小鼠黑色素瘤细胞B16的肺转移,提示GM-CSF具有治疗黑色素瘤的临床应用前景.     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7(recombinant human bone morphogenetic protein 7, rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞,构建rhBMP7逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,经G418筛选后,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,病毒液感染骨骼肌卫星细胞,使用RT-PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果成功地构建了逆转录病毒真核表达载体,逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7 的mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中,目的基因可在mRNA水平有效表达。     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的：建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株，观察Fas基因在转导前后的表达，方法：采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间，以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo ,用G418筛选克隆细胞，以dot blotting,Westting blotting检测转导细胞Fas基因的表达，结果：成功建立了Fas基因表达株，转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株，转导细胞增殖速度，倍增时间，对数生长期等均比非转导株更为缓慢，但无显著性差异，在Fas抗体作用下，转导株细胞生长明显受到抑制，有非常显著性差异，结论：Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态，通过真核表达载体介导，Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达，Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

3腺病毒介导的LacZ基因在B16小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　观察腺病毒介导的LacZ基因转移在B1 6细胞的转导效率。方法　腺病毒介导的LacZ基因转导B1 6细胞。结果　当MOI为 50～ 1 0 0 ,即可获得较高的转导效率 ,达 90 %± 1 %。结论　腺病毒介导的基因转移在B1 6细胞能获得较高的转导效率和目的基因的有效表达。提示腺病毒载体作为一种高效的基因转移载体 ,在肿瘤的基因治疗中有着良好的应用前景     

逆转录病毒介导的SHP-1基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达

目的 构建逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1.获取重组逆转录病毒.并将SHP-1基因转导入乳腺癌MDA-MB-231细胞株.方法 采用RT-PCR方法从高表达SHP-1的人乳腺癌细胞株MCF-7中克隆出SHP-1基因全长cDNA,构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,通过脂质体介导将其转染入包装细胞系PT67,G418筛选建立稳定产病毒的细胞株,将病毒感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.采用Western blotting方法检测SHP-1基因在MDA-MB-231细胞中的表达情况.结果 成功构建重组逆转录病毒表达载体pLNCX2-SHP-1,转染包装细胞PT67,筛选出对G418具有稳定抗性的克隆PT67/SHP-1,获取重组逆转录病毒上清液,并感染人乳腺癌细胞MDA-MB-231.从蛋白水平证实,感染后的MDA-MB-231有SHP-1基因的表达.结论 将SHP-1基因定向克隆入逆转录病毒载体的方法可成功获取重组逆转录病毒,感染MDA-MB-231细胞得到稳定表达SHP-1基因MDA-MB-231/SHP-1,为进一步研究奠定了基础.     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

人胰岛素样生长因子-1逆转录病毒载体的构建及其在骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人胰岛素样生长因子-1的逆转录表达载体,建立逆病毒介导的IGF-1基因转移系统。方法用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）从人肝细胞克隆IGF-1的基因;经DNA测序分析证实后将目的基因插入逆转录病毒载体LXSN,制备pLXSN-IGF-1表达载体;借助阳离子脂质体转染包装细胞PA317,G418筛选阳性克隆,获取病毒上清;培养人骨髓基质干细胞,用病毒上清感染骨髓基质干细胞;采用RT-PCR及Western blot法检测目的基因在靶细胞的表达。结果经酶切电泳和DNA测序表明成功构建了IGF-1逆转录病毒表达载体,转染包装细胞后可以产生IGF-1逆转录病毒,病毒感染人骨髓基质干细胞后能够表达IGF1-1重组蛋白。结论成功建立逆转录病毒载体介导的IGF-1体外表达体系,能够快速、稳定地将IGF-1基因转入骨髓基质干细胞。     

E2F1基因敲除小鼠骨髓造血干、祖细胞减少

目的了解转录因子E2F1基因敲除对造血干、祖细胞的影响。方法用不同抗体标记E2F1基因敲除及同窝野生对照小鼠的外周血、脾脏、骨髓等细胞,应用流式细胞仪进行分析,比较两组之间的差异。结果对检测结果进行统计分析发现,与野生型小鼠相比,E2F1基因敲除小鼠的外周血、骨髓细胞均有改变,脾脏细胞未见明显变化,骨髓前体B细胞、髓系祖细胞、造血干细胞等均有显著变化。骨髓造血干、祖细胞减少,G1期造血干细胞减少。结论 E2F1基因敲除可使小鼠造血干、祖细胞减少。     

Experiments on Gene Transferring to Primary Hematopoietic Cells by Liposome

GenetransferintohematopoieticcelIshasmanyexperimentalaswellasclinicalapplications['].Atpresenttime,thestrategyofgenetransferusedmostlyistheretroviralvectorsystem['].However,theuseofretroviralvectorssuffersfromseveraldrawbacks:(l)thegenerationandmanufacturingofretroviralvectorsarecomplexandnotinexpensive;(2)generalsafetyconcernsareassociatedwiththeuseofanyviral--basevectorssystem,includingrepli-cationdefectivemurineretroviraIvectors;(3)retro-viralvectorscurrent1yusedareabletotransduceon1ydividi…     

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。     

二氢叶酸还原酶基因在肿瘤生物治疗中的作用

目的 :为了保护骨髓免受或少受化疗药物的损伤 ,用转染人类突变二氢叶酸还原酶 (DHFR)基因反转录病毒载体 ,研究其耐药特性及在小鼠造血细胞的表达和对造血细胞的保护作用。方法 :将含有DHFR基因的病毒上清转染小鼠骨髓造血细胞 ,将转染后的骨髓细胞从尾静脉回输给经致死量 (9Gy)照射的小鼠 ,用MTX和G4 18筛选。结果 :经G4 18和MTX筛选均可得到阳性克隆 ,实验组小鼠白细胞计数和红细胞压积逐渐恢复正常 ,而对照组小鼠 30d内全部死亡。结论 :经初步研究表明 ,该反转录病毒载体能成功转染小鼠造血细胞 ,并表达目的基因 ,使在MTX筛选下重建小鼠造血功能。     

表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系的建立及其在HL-60细胞分化过程中的作用

目的:建立表达人Jagged1基因的骨髓基质细胞系,并研究Jagged1基因表达在HL-60细胞诱导分化过程中的作用.方法:构建含有人全长Jagged1基因的逆转录病毒载体MSCV-Jagged1/neoR,将其导入包装细胞PT67并收获病毒上清,用病毒上清转染骨髓基质细胞系HFCL,经G418筛选得HFCL-pMSCV-Jagged1细胞,用Western印迹方法检测Jagged1基因的表达;将HL-60细胞与HFCL-pMSCV-Jagged1细胞、HFCL细胞在含有全反式维甲酸(ATRA)的培养液中共培养,流式细胞仪检测不同时间点HL-60细胞CD11b的阳性率.结果:Western印迹方法证明HFCL-pMSCV-Jagged1细胞Jagged1表达水平明显高于HFCL细胞;HL-60细胞与HFCL-pMSCV-Jagged1、HFCL共培养48和72 h后,CD11b阳性率在Jagged1组明显低于HFCL组(P<0.05).结论:Jagged1基因表达可以较为显著地抑制ATRA诱导的HL-60细胞的分化.     

转导JAK2基因可促进原始多能造血细胞在体外的长期扩增

目的 探讨激活JAK2信号通路是否能够长期扩增调控造血干祖细胞并评价扩增细胞的定向分化潜能。方法 构建克隆1个含有JAK2基因和二聚化化学诱导物(AP20187)结合位点所组成的逆转录病毒载体。AP20187可以使JAK2二聚化激活细胞内信号传导。将该载体转人小鼠原始骨髓造血细胞,在无血清培养基中,将JAK2转基因的细胞分为：①空白对照组,②AP20187组,③细胞因子联合组[干细胞因子(SCF) Flt3-配体(Flt3-L)],④。AP20187 SCF Flt3-L组。对扩增的细胞进行免疫表型、定向分化、造血祖细胞集落分析及脾集落形成单位的研究。结果 只有AP20187 SCF Flt3-L组能够使JAK2转基因的骨髓细胞持续大量对数级增殖。约8d时,细胞数量可以达到扩增前的10^19倍。扩增的细胞经流式细胞仪检测为：Seal阳性细胞为52％～98％,C-kit阳性率为56％～69％,CD34阳性率40％～85％;而其他表型TER119阳性0～20％,CD41阳性5％～36％,B220阳性12％～46％,Grl阳性6％～17％,CD11b阳性35％～46％,CD3为阴性。扩增细胞在SCF/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)／白介素(IL)-3条件下,可分化形成明显的粒细胞和巨噬细胞;在SCF／红细胞生成素(EPO)条件下,可分化为红细胞;在SCF／血小板生成素(TPO)／IL-11条件下,可分化为巨核细胞。祖细胞半固体集落培养,可以形成红系爆式集落形成单位(BFU-E)、粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、混合集落形成单位(CFU-Mix)以及IL-7产生的B淋巴细胞集落,并可在照射过的小鼠体内形成脾集落形成单位。结论 JAK2介导的转基因骨髓造血细胞可以长期扩增调控,扩增的细胞仅限于JAK2转基因的细胞,并且具有多系分化的潜能。