黄芩苷对ESBLs大肠埃希菌感染RAW264.7 细胞TLR4表达的影响

目的:体外研究黄芩苷经由TLR4信号转导途径抗ESBLs大肠埃希菌感染的作用及其机制.方法:用临床分离ESBLs大肠埃希菌接种于单层生长的RAW264.7细胞培养板中以及用黄芩苷(25,50 mg·L-1)预处理的单层生长的RAW264.7细胞培养板中,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测培养细胞TLR4 mRNA表达的变化,免疫荧光检测TLR4蛋白表达的变化,Western blot检测NF-κB表达的变化和酶联免疫吸附(ELISA)检测培养上清中TNF-α含量的变化.结果:ESBLs大肠埃希菌上调RAW264.7细胞TLR4 mRNA和蛋白的表达,NF-κB表达量增加,培养上清中TNF-α含量升高.黄芩苷能抑制大肠埃希菌对RAW264.7细胞TLR4 mRNA和蛋白的上调作用,降低NF-κB的活化,减少TNF-α的分泌,抑制作用呈现黄芩苷剂量依赖性.结论:黄芩苷对ESBLs大肠埃希菌体外直接抑菌作用虽然较弱,但可通过抑制TLR4及其介导的信号转导途径减少炎性因子的生成,从而发挥抗炎作用.     

槐定碱2种加药方式对LPS激活的RAW264.7巨噬细胞TLR4-JNK通路的影响

目的:观察槐定碱预处理和预混合2种给药方式对脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬细胞Toll样受体4(TLR4)及下游c-jun氨基末端激酶(JNK)、c-jun表达的影响,探讨槐定碱抗LPS的分子机制。方法:将RAW264.7细胞分为5组:RAW264.7细胞对照组加入未加血清的DMEM培养基;LPS组加含100μg/L LPS的DMEM培养基;槐定碱药物组加含31.25 mg/L槐定碱的DMEM培养基;槐定碱预处理组以含31.25 mg/L槐定碱的DMEM培养基孵育细胞24 h弃去槐定碱,而后加入100μg/L LPS的DMEM培养基继续孵育细胞;槐定碱预混合组以终浓度为31.25 mg/L槐定碱与100μg/L LPS预先混合1 h的DMEM培养基孵育细胞。上述5组处理完毕后于5、30、60、120 min收集细胞,以RT-PCR技术检测RAW264.7细胞TLR4、JNK、c-jun mRNA表达,免疫细胞化学和Western blot检测细胞c-jun的蛋白的表达。结果:RAW264.7细胞对照组与槐定碱药物组各项指标差异无统计学意义(P0.05);LPS组RAW264.7细胞的TLR4、JNK、c-jun mRNA及c-jun蛋白表达均显著高于RAW264.7细胞对照组(P0.01或P0.05),但各指标显著升高的时间点有所不同;槐定碱预处理组与槐定碱预混合组RAW264.7细胞TLR4、JNK、c-jun mRNA及c-jun蛋白表达均显著低于LPS组(P0.01或P0.05),但各指标显著降低的时间点有所不同。结论:槐定碱可通过调控TLR4-JNK信号转导通路发挥抗LPS作用,其不同加药方式显示的效应表明其作用可能是多环节的。     

基于TLR4-NF-κB/MAPK-炎症轴的槐果碱药理作用研究进展

槐果碱为喹诺里西啶类生物碱,是从豆科槐属植物苦参、山豆根等中草药中提取而来。研究表明,槐果碱在多种疾病的进展中能抑制TLR4-NF-κB/MAPK通路,减少各类炎症因子如IL-6、IL-1β、IL-8、TNF-α、PGE2和MCP-1等的释放,调节免疫细胞的分泌,抵抗炎症对机体的损害,进而发挥保护肝脏、改善心血管和抗自身免疫性疾病等多种药理作用。基于TLR4-NF-κB/MAPK-炎症轴对近年来槐果碱的多种药理作用作以综述,以期为槐果碱新药进一步研究提供参考。     

槲皮素对脂多糖刺激巨噬细胞炎症因子释放的影响

目的 观察槲皮素对脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞炎症因子释放的影响.方法 采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)法测定不同浓度槲皮素对RAW264.7细胞活性的影响.将细胞分为五组:A组(对照组)、B组(LPS干预组)、C组(LPS+槲皮素50 μmol/L)、D组(LPS+槲皮素150 μmol/L)和E组(LPS+槲皮素250μmol/L).real-time测定各组细胞Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(Myd88)、NF-κB (p65) mRNA的表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)测定各组细胞上清液白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌水平.结果 槲皮素在0～250 μmol/L浓度范围内对RAW264.7细胞活性没有影响.同对照组相比,槲皮素可有效降低LPS引起的TLR4、MyD88、NF-κB (p65)的mRNA表达和细胞上清液中IL-6、TNF-α分泌水平,并呈剂量依赖性(P＜0.01).结论 槲皮素可能通过抑制TLR-Myd88-NF-κB传导通路的活化,减少巨噬细胞炎症因子的分泌.     

芪冬活血饮对LPS致炎巨噬细胞炎症反应的作用及机制探讨

目的:通过观察芪冬活血饮大鼠药物血清对NF-κB抑制巨噬细胞炎症细胞因子及TLR4、Cav-1、NF-κBp65 mRNA表达的影响,探讨其炎症调控的机制。方法:将巨噬细胞分为空白对照组(UT组)、LPS组、NF-κB抑制组(NI组)、NF-κB抑制+LPS组(NL组)、LPS加空白血清组(LB组)、LPS加药物血清组(LD组)、NF-κB抑制+LPS+空白血清组(NLB组),NF-κB抑制+LPS+药物血清组(NLD组)8组。巨噬细胞予阻断剂阻断0.5 h后加入LPS致炎,并予药物血清干预,LPS处理12 h后测定各组细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-10水平,及TLR4、Cav-1、NF-κBp65 mRNA相对表达量。结果:LD组TNF-α、IL-1β、IL-10水平及NF-κBp65、Cav-1、TLR4 mRNA相对表达量均低于LB组和LPS组,比较有统计学意义;NLD组TNF-α、IL-1β、IL-10水平及NF-κBp65、Cav-1、TLR4mRNA相对表达量均低于NL组,两组TNF-α、IL-1β有显著统计学差异,NF-κBp65mRNA、IL-10比较差异无统计学意义,Cav-1、TLR4mRNA比较差异有统计学意义。结论:芪冬活血饮药物血清可减轻LPS刺激的巨噬细胞炎性反应;除TLR4/Cav-1/NF-κBp65途径外,芪冬活血饮还可以通过非NF-κBp65途径降低炎症反应。     

苜蓿素对哮喘小鼠肺泡巨噬细胞TLR4/MyD88/NF-κB通路的抑制作用

目的观察苜蓿素对低剂量脂多糖(LPS)诱导的哮喘小鼠气道炎症的抑制作用。方法采用低剂量LPS+卵白蛋白(OVA)建立BALB/c小鼠哮喘气道炎症反应模型,随机分为哮喘模型组、苜蓿素组、地塞米松(阳性药)组,另设空白对照组。ELISA法对小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)炎症介质NO、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)水平进行检测;HE染色观察小鼠肺组织病理情况;RT-PCR法和Western blot法对小鼠肺泡巨噬细胞的Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(My D88)、核因子κB p65(NF-κB p65)mRNA及蛋白表达进行检测。结果苜蓿素可显著降低哮喘小鼠BALF液中NO、TNF-α、IL-1β水平,有效改善哮喘小鼠肺部炎症,显著下调肺泡巨噬细胞的TLR4、My D88、NF-κB p65 mRNA和蛋白相对表达量。结论苜蓿素对哮喘小鼠气道炎症有抑制作用,其机制可能与干预TLR4/My D88/NF-κB通路有关。     

五味子乙素对内毒素诱导脓毒症模型的抗炎作用及机制研究

目的:探讨五味子乙素对内毒素(LPS)诱导的脓毒症模型的抗炎作用及机制。方法:将浓度为0～16μmol/L不等的五味子乙素预处理RAW 264.7细胞1 h后,1μg/mL LPS诱导脓毒症,分为模型组(单用LPS)及不同浓度(2、4、8、16μmol/L)五味子乙素组。Griess法测定一氧化氮(NO)水平,MTT法测定细胞存活率,实时PCR法测定细胞TLR4/NF-κB/MyD88通路的mRNA表达。并考察五味子乙素对注射LPS小鼠生存率及血清IL-1β、TNF-α含量的影响。结果:五味子乙素可抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌PGE_2、NO、IL-1β、TNF-α、IL-6、HMGB1,下调MyD88、TLR4 mRNA及蛋白的表达,降低LPS激活的RAW 264.7细胞中MAPKs的磷酸化,并能提高LPS作用下小鼠存活率和降低小鼠血清IL-1β、TNF-α的含量。结论:五味子乙素对LPS诱导的炎症和脓毒症具有抗炎作用,其通过TLR4/NF-κB/MyD88信号通路防治内毒素诱导的脓毒症,可能是一种新型的抗炎和免疫抑制药。     

总丹参酮抑制LPS诱导巨噬细胞炎症反应的作用机制研究

目的:探讨总丹参酮抑制脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症反应的潜在分子机制。方法:MTT检测1、2、4μg/mL总丹参酮对RAW264.7细胞活力的影响;ELISA和qRT-PCR检测1、2、4μg/mL总丹参酮对LPS诱导RAW264.7细胞合成分泌细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影响;Western blot检测1、2、4μg/mL总丹参酮对LPS诱导RAW264.7细胞iNOS、COX-2及NF-κB、TLR4/MyD88/TAK1通路蛋白表达影响。结果:不同浓度总丹参酮(1、2、4μg/mL)对RAW264.7细胞活力无明显影响;2、4μg/mL总丹参酮显著抑制了LPS诱导RAW264.7细胞中iNOS、COX-2表达及细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β合成分泌增加,阻断了TLR4/MyD88/TAK1/NF-κB信号传导。结论:总丹参酮能通过阻断TLR4/MyD88/TAK1/NF-κB信号级联反应发挥抗炎作用,提示总丹参酮是一种用于治疗炎性疾病的潜在药物。     

复方佛耳草合剂对慢性阻塞性肺疾病大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响

目的 探讨复方佛耳草合剂对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响。方法 大鼠随机分为空白组(10只)和造模组(50只),造模组连续12周采用香烟烟雾联合气管注射LPS建立COPD大鼠模型。将造模成功的大鼠随机分为模型组、地塞米松组(0.5 mg/kg)和复方佛耳草合剂低、中、高剂量组(6.8、13.6、27.2 g/kg),每组10只。给药干预24周后,采用动物肺功能仪检测大鼠肺功能,HE染色法观察肺组织病理变化,ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平及SOD活性,RT-qPCR法检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB及caspase-3 mRNA表达,Western blot法检测肺组织TLR4、MyD88、NF-κB及TNF-α蛋白表达。结果 与空白组比较,模型组大鼠存在肺通气功能障碍,肺组织和支气管受损明显,SOD活性降低(P<0.01),血清TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平升高(P<0.01),肺组织TLR4、MyD88、NF-κB、caspase-3 mRNA表达和TLR4、MyD8...     

化脂复肝颗粒通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3减轻Kupffer细胞炎症改善非酒精性脂肪性肝病机制研究

目的:探讨化脂复肝颗粒在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中对Kupffer细胞(KCs)TLR4/MyD88/NF-κB/NLRP3信号通路的影响。方法:将分离培养的KCs随机分为空白组、LPS干预组、LPS+空白血清组、LPS+化脂复肝组、高糖+对照组、高糖+LPS干预组、高糖+LPS+空白血清组、高糖+LPS+化脂复肝组,LPS干预浓度为100 ng/ml,高糖干预为于KCs培养基中另加入葡萄糖30 mmol/L。用CCK-8法检测各组KCs增殖情况; 酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组KCs培养基上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量; 反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组KCs中TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β的基因表达情况。结果:CCK-8检测显示,空白及高糖培养对照组KCs细胞不断增殖,长势良好; LPS+化脂复肝组与高糖+LPS+化脂复肝组KCs缓慢增殖,非高糖组KCs均较含高糖组KCs增殖速率更快; 而LPS或高糖+LPS诱导模型组及各加空白血清组KCs于第6小时开始出现凋亡,含高糖组KCs均较非高糖组KCs凋亡速率更快。非高糖各组与含高糖各组中促炎因子TNF-α、IL-1β含量以及炎症相关基因(TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB/p-65、TNF-α、IL-1β、IL-18)表达水平均呈相同变化趋势,且含高糖各组上述促炎因子及炎症相关基因表达水平均较非高糖组高。以非高糖组为例,LPS诱导模型组和LPS+空白血清组的促炎因子TNF-α与IL-1β含量均显著高于对照组(P<0.05),炎症相关基因TLR4、MyD88等的mRNA表达水平也均显著高于对照组(P<0.05),而LPS诱导模型组与LPS+空白血清组间上述各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05); 与LPS诱导模型组或LPS+空白血清组比较,LPS+化脂复肝组促炎因子TNF-α与IL-1β含量均显著降低(P<0.05),炎症相关基因TLR4、MyD88等的mRNA表达水平也均显著降低(P<0.05)。结论:化脂复肝颗粒含药血清可改善KCs活力,有效减轻KCs炎症反应,减少KCs细胞焦亡的发生,具有显著的抗炎、抗氧化损伤及保肝作用,其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65/NLRP3信号通路的激活相关。     

雷公藤多苷抗巨噬细胞炎症及对TLR4/NF-κB调控炎症作用的研究

为研究雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii polycoride,TWP)对LPS诱导巨噬细胞炎症反应时,对炎症因子TNF-α,IL-1β的抑制作用,对TLR4/NF-κB调控炎症作用的干预研究,同时观察其对TLR4/NF-κB调控炎症作用的影响。采用噻唑蓝(MTT)法检测受试药物TWP、地塞米松(DXM)及硫唑嘌呤(AZA)对细胞生长的影响,选择合适的药物浓度。通过LPS诱导小鼠RAW264.7细胞株产生炎症反应,ELISA法检测TNF-α及IL-1β的释放,Westen blotting法检测TLR4及NF-κB p65蛋白表达水平,荧光定量PCR(RT-PCR)测定TLR4及NF-κB的表达。实验结果显示TWP剂量依赖性抑制巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α,IL-1β的释放,TWP各剂量组作用均逊于DXM,但TWP高剂量组与AZA组作用比较,对TNF-α作用其优于AZA组;对IL-1β作用其相当于AZA组。对TLR4/NF-κB调控炎症作用的影响,TWP剂量依赖性下调TLR4及NF-κB p65的表达,其作用相当于或优于DXM及AZA。最终得出结论:该项研究显示TWP具有抑制TNF-α及IL-1β的作用,下调TLR4,NF-κB p65受体的表达是其作用的机制之一。     

槲皮素对LPS诱导小鼠RAW264.7细胞炎症的保护作用

目的研究槲皮素对脂多糖(LPS)诱导小鼠RAW264.7细胞炎症的保护作用。方法 CCK-8法检测细胞活力,Griess法检测NO释放,RT-PCR法检测TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2、MCP-1、TLR2、TLR4、MyD88 mRNA表达,Western blot法检测iNOS、COX-2、TLR4、IκBα、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达。结果不同浓度(0～50μmol/L)槲皮素对细胞活力无明显影响(P0.05)。与LPS组比较,槲皮素组(25、50μmol/L)显著抑制NO释放(P0.05);槲皮素组(5、15、25μmol/L)显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、COX-2、MCP-1、TLR4、MyD88 mRNA表达和iNOS、COX-2蛋白表达(P0.05,P0.01),并呈浓度依赖性;槲皮素组(25μmol/L)显著下调TLR4、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达(P0.05),显著上调IκBα蛋白表达(P0.05)。结论槲皮素可抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞炎症,其机制可能与调节TLR4/NF-κB信号通路有关。     

天麻素对毛果芸香碱诱发的癫痫大鼠TLR4/NF-κB信号通路影响的研究

目的:探讨天麻素对毛果芸香碱诱发的癫痫大鼠的脑保护作用及其作用机制。方法:72只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、天麻素组、Toll样受体4 (TLR4)激活剂脂多糖(LPS)组、天麻素+LPS组,每组12只。采用腹腔注射毛果芸香碱建立癫痫大鼠模型。双抗体夹心酶联免疫法检测大鼠血清和海马组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与白细胞介素-1β(IL-1β)水平,TUNEL染色法检测海马组织细胞凋亡数,Western blot分别检测海马组织活化半胱氨酸基天冬氨酸酶-3 (CleavedCaspase-3)、B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、TLR4、兔抗大鼠p-核因子-κB亚基p65亲和肽(p-NF-κBp65)和磷酸化核因子κB抑制蛋白α(p-IκB-α)表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠脑电频率显著降低(P<0.05),波幅显著升高(P<0.05);血清和海马组织TNF-α和IL-1β水平,海马组织细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Bax、TLR4和p-NF-κBp65蛋白明显升高(P<0.05);IL-10水平,Bcl-2和p-IκB-α蛋白表达显著降低(P<0.05)。与模型组比较,阳性药组、天麻素组和天麻素+LPS大鼠脑电频率显著升高(P<0.05),波幅显著降低(P<0.05),血清和海马组织TNF-α和IL-1β水平,海马组织细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Bax、TLR4和p-NF-κBp65蛋白明显降低(P<0.05),IL-10水平,Bcl-2和p-IκB-α蛋白表达显著升高(P<0.05);LPS组大鼠脑电频率、血清及海马组织IL-10水平、Bcl-2蛋白显著降低(P<0.05),血清与海马组织TNF-α与IL-1β水平、海马组织细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Bax、TLR4、p-NF-κBp65和p-IκB-α蛋白表达明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,天麻素+LPS组大鼠脑电频率显著升高(P<0.05),波幅显著降低(P<0.05);血清及海马组织TNF-α与IL-1β水平、海马组织细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3、Bax、TLR4、p-NF-κBp65蛋白表达均明显降低(P<0.05),IL-10水平、Bcl-2及p-IκB-α蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论:天麻素可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路对毛果芸香碱诱发的癫痫大鼠发挥脑保护作用。     

制首乌中大黄素对泡沫细胞NF-κB、TNF-α及IL-1β表达的影响

目的探讨大黄素对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞NF-κB、TNF-α及IL-1β表达的影响。方法选用RAW264.7细胞株作为实验对象,ox-LDL诱导其泡沫化并分为空白组,阳性对照组,激动剂组,阻断剂组,大黄素高、中、低剂量组。采用Real-time PCR法检测NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表达。结果与空白组相比,大黄素各剂量组均能影响NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表达(P0.01)。结论大黄素可能通过NF-κB信号转导途径调节RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞NF-κB、TNF-α、IL-1βmRNA的表达。     

中药黄龙汤对CPL大鼠回肠组织中TLR4/NF-κB信号通路调控的实验研究

目的:通过检测中药黄龙汤干预后CPL模型大鼠中血清中IL-1β、TNF-α含量,回肠组织TLR4、Myd88、NF-κB表达水平,探讨中药黄龙汤通过调控TLR4/NF-κB通路途径的抗炎作用机制。方法:SD大鼠70只,采用盲肠结扎穿孔术复制CPL大鼠模型,并经口给予中药黄龙汤干预,连续干预3 d。末次给药后1 h,采集全血,分离血清,同时取回肠组织冻存。采用ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α含量;Western-blot法检测回肠组织中TLR4、Myd88、NF-κB表达水平。结果:与假手术组比较,模型对照组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著升高,回肠组织中TLR4、Myd88、NF-κB表达水平显著上调;与模型对照组比较,西药组和黄龙汤联合西药组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量显著降低,回肠组织中TLR4、Myd88、NF-κB表达水平显著下调;与西药组比较,黄龙汤联合西药组大鼠血清IL-1β、TNF-α含量及回肠组织中TLR4、Myd88、NF-κB表达水平显著下调,差异有统计学意义。结论:黄龙汤联合西药美罗培南对CPL模型大鼠具有抗炎作用,能够显著抑制血清IL-1β、TNF-α的表达,该作用可能是通过调控回肠组织中TLR4/NF-κB信号通路活化实现的。     

清瘟败毒饮对脓毒血症兔不同时相TLR4/NF-κB信号通路及炎症因子的影响

目的:探讨清瘟败毒饮对脓毒血症兔TLR4/NF-κB信号通路及下游炎症因子白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法:40只新西兰大耳白兔,随机选取10只作为空白组,其余30只造模,采用耳缘静脉注射大肠杆菌内毒素建立脓毒血症模型;将造模成功的30只兔随机分为模型组、清瘟败毒饮组、血必净注射液组,每组10只。分别予以相应药物干预,空白组、模型组予等量生理盐水灌胃,分别于造模24 h和48 h耳缘静脉采血,检测Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)及其下游炎症因子IL-6、TNF-α水平。结果:模型组、清瘟败毒饮组、血必净注射液组TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均高于空白组(P0.05),提示造模成功;给药24 h后,清瘟败毒饮组、血必净注射液组TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α水平均低于模型组(P0.05)。给药48 h后,清瘟败毒饮组TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α水平低于血必净注射液组(P0.05)。结论:清瘟败毒饮可通过TLR4/NF-κB信号通路减轻脓毒血症兔的全身炎症反应。     

蠲痹历节清方对痛风细胞模型中TLR4/NF-κB信号通路主要元件的影响

目的:研究蠲痹历节清方对痛风作用及对TLR4/NF-κB信号通路主要元件的影响。方法:实验分为两部分,①不添加TLR4受体抑制剂部分;②添加TLR4受体抑制剂部分。每部分利用单钠尿酸盐(MSU)结晶诱导巨噬细胞产生痛风模型,随机分正常对照组、模型组、蠲痹历节清方组,并分别干预。用Westen-blot法测定干预后巨噬细胞中髓样分化分子88(MyD88)、IκB激酶-β(IKK-β)、NF-κB抑制蛋白α(IκB-α)蛋白表达,RT-PCR测定干预后各组巨噬细胞中Toll样受体4(TLR4)基因表达;免疫荧光法检测巨噬细胞核转录因子kappa B(NF-κB)核移位情况;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。结果:不添加TLR4受体抑制剂部分:与正常对照组相比,模型组MyD88蛋白、IKK-β、TLR4 mRNA表达含量明显升高;TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显升高;IκB-α蛋白明显降低。与模型组比较,蠲痹历节清方组中MyD88蛋白、IKK-β、TLR4 mRNA表达含量明显降低;TNF-α、IL-6、IL-1β含量明显降低;IκB-α蛋白含量明显升高。正常对照组血清组中NF-κB p65主要集中在细胞浆,细胞核中表达较少,模型组中NF-κB蛋白表达呈猩红色明显增强,主要集中在细胞核中,细胞浆中较少,表明NF-κB核移位明显;蠲痹历节清方组NF-κB主要在细胞浆中,细胞核中相对较少,未出现明显NF-κB核移位情况。同步使用通路阻断剂TAK-242(TLR4受体抑制剂)进行试验对照,上述通路及其上下游各分子(因子)水平均受到明显抑制。各组巨噬细胞NF-κB表达明显受到抑制。结论:蠲痹历节清方可改善痛风细胞模型炎症因子情况,抑制TLR4 mRNA及MyD88、IKK-β蛋白表达和上调IκB-α蛋白表达、抑制NF-κB活化作用,因此推测蠲痹历节清方治疗急性痛风性关节炎局部组织炎症的部分作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路表达有关,可能是以通路中MyD88依赖性信号转导经典途径。     

丹参、黄芪、玄参对内毒素缓释致热大鼠TLR4/NF-κB信号通路活化的影响

目的:研究内毒素缓释致大鼠持续发热过程中TLR4/NF-κB通路信号分子变化,以深入了解该模型的病理生理机制,并尝试发现有代表性且相对稳定的生物学检测指标;研究丹参、黄芪及玄参等几种中药对低热阶段TLR4异常表达的影响,以尝试利用该模型进行温病后期治疗药物筛选。方法:以载内毒素的胶原水凝胶皮下注射建立大鼠持续发热模型,检测不同发热阶段动物肺组织及血浆中Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子88(MyD88)、核因子κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度;制备丹参、黄芪、玄参、玄参/丹参/黄芪复方及补中益气汤水提物,灌胃给予该模型低热阶段大鼠,观察其解热作用及对肺组织及血浆中TLR4、TNF-α的影响。结果:模型大鼠在注射载内毒素胶原水凝胶后不同时间,其肺组织和血液中TLR4/NF-κB通路信号分子及TNF-α可不同程度上调,且与发热程度呈正相关;三种受试单味药及两种复方的水提物30g生药/kg均可不同程度降低模型动物持续低热阶段肺组织和血液中TLR4及TNF-α浓度,其中玄参作用较弱,丹参及两种复方作用较强。结论:TLR4/NF-κB信号通路分子水平的变化可用以表征发热的不同阶段,其抑制可能是某种中药或复方表现解热功效的一个重要机制,但却并非是一种充分条件,其作用的解释也应当考虑多种因素。     

基于NF-κB通路的芒果苷干预脂多糖诱导的细胞炎症作用机制研究

目的研究芒果苷对小鼠巨噬细胞RAW 264.7的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法采用脂多糖(LPS)诱导RAW 264.7细胞炎症模型。实验分四步:(1)细胞存活率实验分5组,即:空白组、LPS组、LPS+不同浓度(50、100、150μg/mL)芒果苷组。MTT法检测细胞存活率。(2)一氧化氮(NO)、白介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白介素6(IL-6)分泌实验分6组,即:空白组、LPS组、LPS和不同浓度芒果苷(50、100、150μg/mL)组、LPS+BAY 11-7082[核因子κB(NF-κB)抑制剂]组。Griess法检测NO分泌量,ELISA法检测IL-1β、TNF-α及IL-6分泌量。(3)诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与环氧化酶-2(COX-2)mRNA及蛋白表达实验分组同细胞存活率实验。实时荧光定量PCR检测iNOS及COX-2 mRNA水平变化,Western blot检测iNOS及COX-2蛋白表达水平。(4)细胞质、细胞核中NF-κB表达实验分3组,即:空白组、LPS组、LPS+150μg/mL(终末浓度)芒果苷共处理组, Western blot检测细胞质、细胞核中NF-κB p65蛋白表达量。结果 (1)与空白组比较,LPS组显著降低RAW264.7细胞存活率(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理对RAW264.7细胞增殖无显著影响(P0.05)。(2)与空白组比较,LPS组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量显著升高(P0.05);与LPS组比较,除50μg/mL芒果苷预处理组NO、TNF-α分泌量无显著变化外(P0.05),其余各组NO、IL-1β、TNF-α、IL-6分泌量均显著降低(P0.05)。(3)与空白组比较,LPS组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达量均显著升高(P0.05);与LPS组比较,50～150μg/mL芒果苷预处理组iNOS、COX-2 mRNA及蛋白表达显著下降(P0.05)。(4)与空白组比较,LPS组细胞质中NF-κB p65蛋白量减少,细胞核中则增多(P0.05);与LPS组比较,150μg/mL芒果苷预处理组细胞质中NF-κB p65蛋白量升高,细胞核中蛋白量减少(P0.05)。结论芒果苷可能通过抑制NF-κB信号通路,而抑制iNOS、COX-2表达及相关炎症因子的分泌,干预LPS诱导的RAW264.7细胞炎症。     

小钻木脂素类化合物戈米辛R的体外抗炎机制研究

目的 通过脂多糖(LPS)诱导活化小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7建立炎症模型,探讨小钻木脂素类化合物戈米辛R对炎症细胞增殖及炎症因子分泌的影响,评价其抗炎活性及机制。方法 采用MTT比色法检测经LPS诱导的RAW264.7细胞存活率并计算半数抑制浓度(IC₅₀);采用ELISA法检测细胞上清液TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子含量;利用RT-PCR法检测细胞TNF-α、IL-1β、IL-6、IκB-α、NF-κB p65的mRNA表达量;Western blot法检测细胞IκB-α及NF-κB p65蛋白表达量。结果 与LPS模型组比较,戈米辛R可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞增殖;降低细胞分泌TNF-α、IL-1β及IL-6的含量;升高LPS所致降低的IκB-α mRNA的表达量同时降低LPS引起升高的TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65的mRNA表达量;升高IκB-α并降低NF-κB p65的蛋白表达量,显示出良好的剂量依赖性,具有统计学差异(P<0.05)。结论 戈米辛R可通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB p65的mRNA和NF-κB p65蛋白的表达,增加IκB-α mRNA和IκB-α蛋白的表达,减少致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放,从而发挥显著抗炎活性。