RNA干扰对慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNAi)效应对慢性粒细胞白血病(CML)bcr／abl融合基因表达的抑制作用。方法体外化学合成针对bcr／abl融合基因的小干扰RNA(siRNA)，并用电穿孔方法将siRNA转染K562细胞株，以未转染的细胞及非特异性的siRNA转染细胞作对照；同时转染带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体作为阳性对照，流式细胞术检测其绿色荧光以确定转染效率；实时定量RT—PCR及Western blot法检测siRNA的抑制效应。MTT法检测细胞增殖抑制率。膜联蛋白V(Annexin V)及碘化丙锭双染法测细胞凋亡率。结果电穿孔的转染效率可达70％；化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因在mRNA和蛋白水平的表达；特异性siRNA可以抑制细胞增殖，转染24h细胞增殖抑制率达47％，48h达56％；特异性siRNA转染细胞24h组凋亡率为15．05％．48h组为19．47％，与对照组(1．00％)比较明显提高。结论在细胞水平上，化学合成的siRNA可以抑制bcr／abl融合基因的表达，为利用RNA干扰作为基因治疗的研究奠定基础。     

bcr/abl融合基因和慢性粒细胞白血病

bcr/abl融合基因酪氨酸激酶活性异常在慢性粒细胞白血病发病分子机制中起重要作用,其表达物bcr/abl融合蛋白是慢性粒细胞白血病分型的重要依据,检测此基因对慢性粒细胞白血病的诊断、治疗和病情观察具有重要临床意义.     

bcr/abl融合基因检测在慢性粒细胞白血病诊断及残留病灶监测中的应用

目的探讨bcr/abl融合基因检测在诊断慢性粒细胞性白血病(CML)和监测CML残留病灶中的意义。方法采用巢式逆转录PCR(RT-PCR)检测337例CML患者bcr/abl融合基因的表达,并对所有患者进行残留病灶的动态监测,共检测632人次。其中移植(包括外周血干细胞移植、骨髓移植和脐血移植)患者26例;服用格列卫的患者22例;其它治疗方案患者289例。结果在337例CML初诊患者中bcr/abl基因表达阳性者325例,阳性率为96.4%;其中b3a2型转录本占58.5%(190/325),b2a2型转录本占41.2%(134/325),b3a3型转录本占0.3%(1/325)。未发现b2a3型转录本。移植患者bcr/abl融合基因转阴率为88.5%(23/26),时间在30~201 d之间,中位数为55 d;服用格列卫患者融合基因总转阴率59.1%(13/22),转阴时间在用药后90~365d之间,中位数为210 d;其它治疗组患者转阴12例,转阴率为4.1%(12/289)。结论bcr/abl融合基因的检测及动态观察,对CML的临床诊断、疗效及预后判断具有重要意义。     

反义bcr／abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的研究

反义ｂｃｒ／ａｂｌ寡核苷酸诱导Ｋ５６２细胞凋亡的研究戴木水罗绍凯戴丽君洪文德彭爱华慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）细胞表达ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，其引起ＣＭＬ发病的机制可能是抑制髓系细胞的凋亡，因而如何抑制ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ的表达，诱导髓系细胞的凋亡是...     

bcr/abl反义RNA片段对Ph~ 人白血病细胞系致瘤性和存活的影响(英文)

构建了表达2、3和4个相同241bp b3/a2型bcr/abl融合基因的反义RNA片段的重组质粒,酶切电泳和以241bp bcr/abl基因片段为探针进行的菌落原位杂交证实各目的片段已插入逆转录病毒表达载体,分别命名为pDAB2、pDAB3和pDAB4。用脂质体介导的方法将pDAB3导入Ph~ 人白血病细胞系(K562和BV173细胞),48小时后用G418进行抗性筛选,观察了对靶细胞增殖的影响。结果表明,外源质粒在靶细胞内表达的反义RNA片段,使细胞致瘤性消失及诱发凋亡。探讨了可能的作用机理。     

β-catenin在慢性粒细胞白血病中的表达及与bcr/abl的关系

本研究检测β-catenin在慢性粒细胞白血病(CML)各期中的表达情况,并与bcr/abl的表达变化相比较,为进一步探讨β-catenin在CML急性变中的意义提供依据。首先分离CML各期患者及正常供者骨髓单个核细胞(BMMNC),提取总RNA,逆转录为cDNA,用实时定量PCR的方法检测β-catenin的表达情况,同时检测部分标本bcr/abl的表达情况,分析二者在CML进展过程中的表达变化及两者的相关性。结果表明:β-catenin在CML急性变期BMMNC的表达明显高于慢性粒细胞白血病(CML)慢性期(p<0.001)、加速期(p=0.016)及正常人(p=0.004),而在后三者之间未见统计学差异。急性变期bcr/abl的表达明显高于慢性期(p=0.001)。β-catenin的表达量与bcr/abl表达水平有明显的相关性(r=0.620,p<0.001)。结论:CML急性变期β-catenin的表达明显升高,并与bcr/abl的表达量有相关性。β-catenin的表达增高可能与CML急性变有关。     

RT—PCR一步法检测慢性粒细胞白血病bcr／abl融合基因

应用ＲＴ－ＰＣＲ一步法检测了４２例慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）患者的ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因，均显示ｂｃｒ／ａｂｌ基因阳性，其中２１例为１６８ｂｐ扩增带，１８例为９３ｂｐ扩增带，３例同时具有１６８ｂｐ和９３ｂｐ二条扩增带。ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因检测，对ＣＭＬ的诊断、治疗及预后判断均有重要意义。ＲＴ－ＰＣＲ一步法特异性好，敏感性高，简单快速，可节省试剂，值得推广应用。     

自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA

目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。     

Ph染色体bcr/abl融合基因在诊断慢性粒细胞白血病中的意义

目的 慢性髓系白血痛(CML)的细胞遗传学特征是具有Ph染色体,即t(9;22)(q34;q11),其结果在分子水平上形成bcr/abl融合基因探讨慢性髓性白血病Ph染色体及bcr/abl融舍基因检测对CML早期诊断、分型诊断及指导治疗的临床意义.方法 用直接法或24h短期培养法常规G显带后分析,观察有无Ph染色体,PCR方法检测bcr/abl融合基因,结合形态学特征对51例CML进行分型诊断.结果 51例患者中Ph+/bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+共48例诊断为典型慢性粒细胞白血病(CGL)占94%,其中1例为妊娠合并慢拉白血病;Ph-/bcr/abl-3例占6%,其中2例为非典型慢性粒细胞白血病(a-CML),1例为慢性粒单棱细胞白血病(CMML).结论 Ph染色体及ber/abl融合基因检测将CML患者进一步区分为三型:典型(Ph+/ bcr/abl+或Ph-/bcr/abl+)慢性粒细胞白血病(CGL)、非典型(Ph-/bcr/abl-)慢性粒细胞白血痛(a-CML)、慢性粒单核细胞白血病(CMML).对慢性髓系白血病的明确诊断、早期有效治疗具有重要的临床意义.     

Real Time PCR监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的临床意义

目的通过Real Time PCR实时监测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的表达,探讨其在诊断及预后评价价值。方法采用荧光定量Real Time PCR反应技术检测39例慢性粒细胞白血病及其它血液系统疾病20例的bcr/abl融合基因表达水平。结果骨髓原始、外周血原始与bcr/abl融合基因拷贝数有显著相关性,初诊慢性粒细胞的bcr/abl融合基因表达水平普遍明显增高,经羟基脲±干扰素治疗后表达明显下降,复发或加速期患者可提前2-4个月左右早期发现,格列卫或移植治疗后,多数bcr/abl融合基因可转阴性。结论 bcr/abl融合基因检测对诊断慢性粒细胞白血病有重要价值,同样是慢性粒细胞白血病治疗和预后观察的决定性指标。     

慢性髓系白血病Ph染色体分析与bcr/abl mRNA检测

目的 为进一步明确慢性髓系白血病（ＣＭＬ）患者中Ｐｈ染色体阳性细胞与ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因表达之间的关系和比较细胞遗传学分的与聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法在ＣＭＬ应用中的优缺点,方法 用热变性姬姆萨Ｒ显带（ＲＨＧ）技术和逆转录筑巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎｅｓｔ－ＰＣＲ）对３３例ＣＭＬ患者的骨髓或外周血进行了分析,对其中１１例异基因骨髓移植（Ａｌｌｏ－ＢＭＴ）或α干扰素（ＩＦＮ－α）＋小剂量羟基脲（Ｈ     

不典型慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的RT-PCR研究

应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对30例慢性粒细胞白血病(CML)患者的bcr-abl融合基因进行了检测,并结合临床、血液学、细胞化学和细胞遗传学等指标对4例Ph~-CML进行了分析,其中的1例t(7;22)(q22,q24)易位为国内外首次报道。结果表明,Ph~-/bcr~ CML和具有变异型Ph染色体的CML与Ph~ CML之间有较多相近之处,如白细胞与血小板数较多,N-ALP较低,脾肿大明显,发病年龄较轻,易发生急变;Ph~-/bcr~-CML与Ph~ CML之间差异显著,如发病年龄较高,脾中度肿大,白细胞数多者较少,急变较少见。     

高三尖杉酯碱通过抑制P210^bcr／abl诱导K562细胞凋亡

为探讨高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ,ＨＨＴ）抗慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）的机制,以ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２细胞为对象,应用ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ双标志和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交技术,观察ＨＨＴ对细胞凋亡和Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ癌蛋白的影响。结果表明,５－２０ｎｇ／ｍｌ浓度的ＨＨＴ可诱导Ｋ５６２细胞凋亡,但随着药物浓度的增加细胞出现坏死性死亡,ＨＨＴ可使细胞内融合蛋白Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的含量约减少７０％,而对正常存在于细胞内的Ｐ１４５＾ｃ－ａｂｌ无影响,上述结果证实,ＨＨＴ通过对Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的定向抑制作用促进ＣＭＬ细胞凋亡,这可能是其抗ＣＭＬ的分子机制。本研究为ＨＨＴ在临床上的进一步应用提供了实验基础。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

吉西他滨对慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞G-CSFR及bcr/abl mRNA的影响

为了观察吉西他滨对慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓粒细胞集落刺激因子受体(G-CSFR)及bcr/ablmRNA的作用,收集CML慢性期、急变期患者的及骨髓象正常的非血液病患者骨髓液,分为吉西他滨组(加入吉西他滨,调整浓度为10μg/ml)和对照组,培养48小时后收集细胞。采用流式细胞术检测各组标本骨髓G-CSFR的表达率;采用RT-PCR技术检测各组标本bcr/abl mRNA的表达。结果表明:吉西他滨组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓G-CSFR的表达率分别为(50.72±8.57)%、(36.32±4.25)%和(59.42±7.62)%。对照组CML慢性期、急变期患者及骨髓象正常者骨髓粒系G-CSFR的表达率分别为(45.42±6.52)%、(30.58±5.68)%和(58.56±5.54)%。两组CML患者骨髓G-CSFR的表达率分别与骨髓象正常组比较,差异有显著性(p0.05),CML慢性期患者与急变期比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML患者G-CSFR的表达率与未加药组相应组别比较,差异有显著性(p0.05)。吉西他滨组CML慢性期、急变期患者bcr/abl mRNA表达水平比较,差异无显著性(p0.05)。吉西他滨组与对照组、CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关(p0.05)。结论:在体外培养下,吉西他滨可以提高CML慢性期、急变期患者骨髓G-CSFR的表达率,对bcr/abl mRNA表达的作用不明显,CML慢性期、急变期患者G-CSFR表达率与bcr/abl mRNA表达水平呈负相关。     

慢性粒细胞白血病患者Ph染色体变异易位的细胞遗传学特征与荧光原位杂交研究

本研究探讨慢性粒细胞白血病(CML)中变异Ph染色体易位的细胞遗传学特征并比较双色单融合(DC-SF)与双色双融合(DCDF)bcr／abl探针荧光原位杂交技术(FISH)在变异易位CML中的应用价值。应用常规细胞遗传学方法分析我院42例CML变异Ph易位患者，其中9例进行DC-SF-FISH和1l例进行DC-DF-FISH研究。结果表明：在642例Ph阳性CML中变异易位42例(6.5％)，简单变异易位42.9％(18／42)，复杂变异易位54.8％(23／42)，遮蔽的或隐匿的Ph易位1例。除4，6号染色体外，其余染色体均被累及。4种类型变异易位分别出现于至少2个病例中。变异易位伴附加异常15例(35.7％)。FISH检测bcr／abl阳性19例(95％)，阴性1例。DC-DF-FISH显示除1例患者部分细胞(8.8％)能检测到abl／bcr融合信号外，其他患者皆缺乏该融合信号。但在易位后的9号和参与变异易位的另外染色体上分别可以见到abl和bcr基因信号。DC-SF-FISH不能观察到信号的变异特征。结论：CML变异Ph易位广泛累及除9，22外其他染色体。部分类型属重现性异常；FISH检测能给予精确的分子诊断．而DC-DF-FISH可提供直观的、准确的分子变异特征分析。     

应用国产ES探针检测慢性髓系白血病的bcr/abl融合及der(9)中间缺失

本研究旨在验证国产LSI bcr/abl ES探针检测慢性髓系白血病(CML)bcr/abl融合基因及衍生9号染色体中间缺失的有效性。应用国产LSI bcr/abl ES探针对97例经骨髓细胞形态学及常规细胞遗传学显带分析确诊的CML患者进行FISH检测,对具有der(9)中间缺失的病例再进行ASS基因探针的FISH检测,并取同期129例染色体核型正常的除外血液肿瘤性疾病及骨髓增殖性疾病患者作为阴性对照。结果显示:97例CML患者中91例染色体核型分析具有经典的t(9;22),6例为变异易位。经FISH检测所有患者均具有bcr/abl融合信号,其中16例具有der(9)中间缺失,占16.5%,在16例der(9)中间缺失的病例中13例具有ASS基因的缺失。129例阴性对照患者均未检测出bcr/abl融合。结论:国产LSI bcr/abl ES探针能有效识别bcr/abl融合及der(9)中间缺失,无假阴性及假阳性结果,ES-FISH检测结果与G显带核型具有很好的一致性。     

102例慢性粒细胞白血病的遗传学诊断分析

目的 :观察Ph染色体 ,bcr/abl融合基因与慢性粒细胞白血病 (CML)的诊断指标。方法 :染色体制备采用骨髓细胞直接法和短期培养法 ,bcr/abl融合基因分析用RT -nest-PCR法。结果 :10 2例病例中 ,91例Ph染色体及bcr/abl融合基因均为阳性 ,Ph-、bcr/abl+6例 ,Ph-、bcr/abl-5例。结论     

急性淋巴细胞白血病bcr/abl融合基因表达及其与免疫表型的关系

采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测了M-bcr/abl和m-bcr/abl两种类型融合基因在48例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的表达,并且绝大多数病例同时进行了免疫表型和DNA倍体的流式细胞术分析。结果表明,25%(12/48)的病例M-bcr/abl或m-bcr/abl融合基因阳性,m-bcr/abl阳性率略高。分析bcr/abl阳性病例的免疫表型,发现大多数病例为B系标志阳性,但部分T系标志阳性的病例也检测出M-bcr/abl或m-bcr/abl,说明bcr/abl阳性ALL病例以B系标志阳性者居多,T系标志阳性的ALL病例也可为bcr/abl阳性。