特布他林对肺泡Ⅰ型和Ⅱ型细胞钠水转运机制的影响

目的 探讨特布他林对肺泡Ⅰ型细胞(AT Ⅰ)和Ⅱ型细胞(ATⅡ)上Na+转运机制的影响.方法 分离ATⅡ,采用膜片钳全细胞记录模式,应用全细胞钠通道(ENaC)阻断剂amiloride和环核苷酸门控阳离子通道(CNG)阻断剂ZnCl2观察ATⅡ ENaC和CNG电流及特布他林对两者的影响.结果 ATⅡ全细胞电流主要为amiloride敏感电流和Zn2+敏感电流,两者比例无差别(P>0.05);特布他林可使amiloride敏感电流和Zn2+敏感电流明显增加(P<0.05),amiloride敏感电流所占比例约为Zn2+敏感电流的1.7倍(P<0.05).结论 急性分离ATⅡ上存在功能性ENaC和CNG,并且Na+转运以两者为主.特布他林增强肺水吸收主要通过增加AT Ⅰ和ATⅡ上ENaC和CNG通道的Na+转运实现.     

油酸肺损伤时肺泡II型细胞钠转运功能的变化

目的观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及β2受体激动剂特布他林对其的影响。结果ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱,但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

油酸肺损伤时肺泡Ⅱ型细胞钠转运功能的变化

目的 观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法 建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及B2受体激动剂特布他林对其的影响。结果 ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱。但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论 ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

ARDS状态下大鼠肺泡Ⅱ型细胞水通道蛋白1表达的变化

目的观察大鼠ARDS状态下Ⅱ型细胞水通道蛋白1(AQP1)表达的变化,为ARDS发病机制的研究提供新的实验和理论依据。方法运用免疫组化、Western bloting和图像分析技术,对正常大鼠和ARDS大鼠Ⅱ型细胞AQP1的表达水平进行对比观察,分析变化。结果Western blot分析显示ARDS大鼠肺泡Ⅱ型细胞AQP1蛋白条带较对照组明显减弱,免疫组化及Western blot经图像分析结果为ARDS状态下Ⅱ型细胞上水通道蛋白1的表达较对照组有明显的下降(P<0.05)。结论AQP1对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

ARDS状态下大鼠肺泡II型细胞水通道蛋白1表达变化的研究

[摘要] 目的　观察大鼠ARDS状态下II型细胞(水通道蛋白1)AQP1表达的变化,为ARDS发病机制的研究提供新的实验和理论依据。方法　运用免疫组化、Western Bloting和图像分析技术,对正常大鼠和ARDS大鼠II型细胞AQP1的表达水平进行对比观察,分析变化。结果　Western blot分析显示ARDS大鼠肺泡II型细胞AQP1蛋白条带较对照组明显减弱,免疫组化及Western blot经图像分析结果为ARDS状态下II型细胞上水通道蛋白1的表达较对照组有明显的下降。结论　ARDS状态下肺泡II型细胞AQP1的表达较对照组有显著的下降（P<0.05）,提示AQP1对呼吸系统水转运起到重要作用。     

油酸肺损伤时肺泡内液体清除和肺泡II型细胞内cAMP、cGMP水平的变化

目的 观察油酸致大鼠急性呼吸窘迫综合症(ARDS)模型中肺泡Ⅱ型细胞cAMP、cGMP水平的变化及特布他林的作用.方法 随机将SD大鼠分为对照组、ARDS组、特布他林组.用放射免疫分析法测定肺泡Ⅱ型上皮细胞内cAMP、cGMP水平;应用重力法测定血管外肺水含量(EVLW).结果 ARDS组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞内cAMP明显降低.cGMP水平升高,EVLW明显增多.给予特布他林治疗后,EVLW下降,肺泡Ⅱ型细胞内cAMP含量升高,cGMP变化不明显.结论 油酸致ARDS时,肺水清除能力下降.特布他林可通过提高肺泡Ⅱ型细胞内cAMP水平提高肺水清除能力.肺泡Ⅱ型细胞内cAMP、cGMP水平变化参与急性肺损伤的分子生物学发病机制.     

急性分离的肺泡Ⅱ型细胞的钠转运及调节

目的观察急性分离的肺泡Ⅱ性细胞全细胞钠电流及调节特性。方法应用膜片钳技术全细胞记录模式记录分离后5h内的大鼠ATII的全细胞钠电流,并观察阿米洛利和特布他林对其的影响。结果可以记录到阿米洛利敏感性钠电流,应用特布他林后电流明显增大。结论可以利用急性分离的ATII细胞进行钠通道电生理研究,为病理状态下的研究开拓了新的视野。     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化，绎过特殊染色及电镜鉴定，用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4存该单细胞上的表达。结果大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白1—4呈强阳性，免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论水通道蛋白-4存存于分离的大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上，对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的 观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法 对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,经过特殊染色及电镜鉴定,用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4在该单细胞上的表达。结果 大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白-4呈强阳性,免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论 水通道蛋白-4存在于分离的大鼠肺泡II型细胞膜上,对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

大鼠油酸性急性肺损伤初期水通道蛋白4在肺水代谢的实验研究

目的 测定油酸造成急性肺损伤(ALI)初期损伤程度及肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上水通道蛋白4(AQP-4)的表达量以评估病理状态下ATⅡ细胞水通道水转运能力的状况.方法 血气分析、观察肺组织病理学、用重力法测定血管外肺水(EVLW)含量检测早期肺损伤的程度;急性分离纯化大鼠油酸ALI模型的ATⅡ细胞,显微镜及电子显微镜观察形态病理变化:免疫组化了解肺组织AQP-4的表达,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞AQP-4的m-RNA表达的情况.结果 血气分析、光镜下肺损伤评分及EVLW油酸组严重程度显著高于对照组,显微镜下肺泡Ⅱ型上皮细胞的数量较对照组无明显减少,但电镜下细胞的超微结构改变,板层小体排空,线粒体损伤等改变;肺组织免疫组化观察到AQP-4明显表达增强,肺泡Ⅱ型上皮细胞AQP-4的m-RNA表达增多,AQP-4由胞浆向胞膜转运,胞膜的表达增多(P<0.05).结论 在肺损伤初期就有了肺损伤水肿的病理生理的改变,AQP-4在肺泡Ⅱ型上皮细胞上m-RNA及细胞膜的表达上调.很大程度调节肺泡腔及肺泡上皮细胞的水转运,在钠通道功能下降的情况下发挥了重要的代偿作用.     

肺泡上皮钠水主动转运功能的分子基础研究

肺泡上皮由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞组成。Ⅰ型细胞构成肺泡壁 ,数量较少只有Ⅱ型细胞的一半 ,但却覆盖着肺泡总面积的 95 %。肺泡上皮细胞除了参与气体交换外 ,还具有主动转运钠水的能力。肺泡上皮细胞转运系统由上皮细胞上的钠通道 (epithelialsodiumchannel,ENaC)、Na+ K+ ATP酶 (Na ,K adenosinetriphosphatase ,NKA)、水通道 (aquaporin ,AQP)组成 ,即由肺泡上皮Ⅰ型和Ⅱ型细胞的肺泡腔侧钠通道摄取Na+ ,然后经基底侧表面的NKA将Na+ 泵至肺间质 ;由于NKA将Na+ 泵至细胞外 ,在细胞内造成了显著的电化学梯度 ,利于Na+ 通过细胞膜…     

Vimentin， CTGF和AQP5在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化模型中的表达

［摘要］目的　观察波形蛋白（ Vimentin）、结缔组织生长因子（ conective tissue growth factor, CTGF）和水通道蛋白5（Aquaporin5,AQP5）在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞（ ATⅡ）恶性转化模型中的表达．方法　以永生化ATⅡ（RLE-6TN细胞株）为实验对象,分为高剂量染毒组、低剂量染毒组和空白对照组．高、低剂量染毒组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养．从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性．采用透射电镜观察细胞超微结构,以免疫印迹法及免疫组织化学法观察各组细胞肺表面活性蛋白 SP（-B）、 SP-C、波形蛋白（Vimentin）、结缔组织生长因子（CTGF）、水通道蛋白5（AQP5）表达．结果　从形态改变、软琼脂克隆形成实验及肺泡表面活性蛋白（SP）-B、SP-C的表达上发现经烟尘诱导,RLE-6TN细胞超微结构会发生改变,且高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义（P＜0.01）,但与烟尘染毒水平相关性无统计学意义（P＞0.05）．免疫组织化学显示高、低剂量染毒组第30代细胞CTGF阳性、SP-B阴性,空白对照组CTGF阴性、SP-B阳性．Western blot示高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞及空白对照组Vimentin和AQP5均为阴性． 结论　云锡炼厂烟尘导致ATⅡ恶性转化模型中CTGF表达阳性,但Vimintin及AQP5的表达呈阴性.     

水通道蛋白3介导过氧化氢转运对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移的作用研究*

目的 探讨水通道蛋白3（AQP3）介导肿瘤微环境中过氧化氢（H2O2）转运对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移的作用。方法 应用宫颈癌HeLa细胞,构建AQP3 shRNA慢病毒稳定转染宫颈癌细胞系,通过克隆形成、CCK-8、细胞平板克隆形成、Western blotting等比较H2O2处理前后细胞表型的差异。结果 成功构建AQP3-464- shRNA慢病毒稳定转染HeLa细胞系,AQP3 shRNA抑制肿瘤微环境中H2O2转运,抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移,AQP3 shRNA抑制肿瘤微环境中H2O2转运调控下游信号蛋白激酶B（PKB）。结论 AQP3介导宫颈癌HeLa细胞中H2O2跨膜转运,激发细胞内依赖第二信使H2O2的下游信号PKB,促进HeLa细胞的增殖、迁移。     

特布他林短时间作用增强急性肺损伤大鼠肺泡液清除的机制与αENaC的相关性

目的 探讨β2受体激动剂特布他林短时作用增强成体大鼠肺泡液清除的机制与肺泡上皮钠离子通道α亚基(αENaC)的相关性.方法 建立油酸急性肺损伤(ALI)大鼠模型;以PaO2、氧合指数,肺组织HE染色,血管外肺水含量(EVLW)为指标验证特布他林经气管给药作用1h促进ALI大鼠肺泡液重吸收的效果:通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot测定各组大鼠肺组织的αENaC mRNA、αENaC蛋白的表达并比较它们的差异.结果 特布他林治疗组大鼠的PaO2、氧合指数、EVLW较ALI组有显著差异;各组大鼠αENaC mRNA、αENaC蛋白表达差异无统计学意义.结论 特布他林经气管给药作用1 h能显著促进ALI大鼠肺泡液重吸收;特布他林短时作用增强成体大鼠肺泡液清除没有通过αENaC基因表达实现.     

油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡液体清除能力的室验研究

目的 探讨油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡内液体的清除能力。方法 油酸静脉注射复制急性肺损伤模型。清洁级雄性大鼠51只随机分为正常组、急性肺损伤组和特布他林治疗组。动脉血气、肺组织病理学检测评估肺损伤程度,电镜下观察急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞的变化,重力法测定血管外肺水量（EVLWI）。结果 急性肺损伤组大鼠肺损伤评分（6.37±1.26）分、血管外肺水量（4.02±0.69）mL/g显著高于正常组[(1.39±0.5)分和（2.73±0.50）ml/g,均P< 0.0５];特布他林治疗后大鼠肺损伤评分（5.23±1.14）分和血管外肺损伤量（3.50±0.45）mL/g较急性肺损伤显著下降（均P< 0.0５）。电镜下观察急性肺损伤组肺泡Ⅱ型上皮细胞细胞形状不规则,染色质边集,线粒体肿胀,板层小体排空及空泡化等;经特布他林治疗后,电镜观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀程度及板层小体排空程度较急性肺损伤组轻。结论 油酸致急性肺损伤大鼠肺泡液体清除能力下降,特布他林可以减轻肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤,提高肺水清除能力。     

Vimentin,CTGF和AQP5在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞恶性转化模型中的表达

目的 观察波形蛋白(Vimentin)、结缔组织生长因子(conective tissue growth factor,CTGF)和水通道蛋白5 (Aquaporin5,AQP5)在烟尘诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)恶性转化模型中的表达.方法 以永生化ATⅡ(RLE-6TN细胞株)为实验对象,分为高剂量染毒组、低剂量染毒组和空白对照组.高、低剂量染毒组分别使用终浓度为200、50 mg/L的烟尘悬浊液在第1、3、5、7、9代对细胞染毒,同代对照组不加烟尘悬浊液同步培养.从第10代起,高、低剂量染毒组常规传代直至软琼脂克隆形成检测实验呈阳性.采用透射电镜观察细胞超微结构,以免疫印迹法及免疫组织化学法观察各组细胞肺表面活性蛋白SP(-B)、SP-C、波形蛋白(Vi-mentin)、结缔组织生长因子(CTGF)、水通道蛋白5(AQP5)表达.结果 从形态改变、软琼脂克隆形成实验及肺泡表面活性蛋白(SP)-B、SP-C的表达上发现经烟尘诱导,RLE-6TN细胞超微结构会发生改变,且高、低剂量染毒组克隆形成率与染毒培养代数相关性有统计学意义(P＜0.01),但与烟尘染毒水平相关性无统计学意义(P＞0.05).免疫组织化学显示高、低剂量染毒组第30代细胞CTGF阳性、SP-B阴性,空白对照组CTGF阴性、SP-B阳性.Western blot示高、低剂量染毒组第25、30、35代细胞及空白对照组Vimentin和AQP5均为阴性.结论 云锡炼厂烟尘导致ATⅡ恶性转化模型中CTGF表达阳性,但Vimintin及AQP5的表达呈阴性.     

ATⅡ细胞在急性高原肺水肿中的作用及意义

目的探讨ATⅡ细胞在急性高原肺水肿中的作用及意义。方法wister大白鼠随机分高原1 d、3 d、7 d组,观察肺组织大体形态变化;H-E染色,观察肺组织学变化;电镜观察肺组织形态学变化;测定血流动力学和右室肥厚指数(RVHI)。结果光镜下,肺组织出现明显炎症反应,肺泡壁充血水肿,肺泡腔内有大量的炎细胞;电镜下,肺泡上皮细胞出现凋亡。血流动力学测定、右室肥厚指数测定结果显示表明:1 d、3 d和7 d组mPAP、mSAP和RVHI变化无显著性差异(P>0.05)。结论缺氧使ATⅡ细胞凋亡,肺水转运功能障碍,肺泡内液体大量聚集,从而引发肺水肿。     

油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡液体清除能力的实验研究

目的 探讨油酸诱导的急性肺损伤模型肺泡内液体的清除能力.方法 清洁级雄性大鼠51只随机分为正常组、急性肺损伤组和特布他林治疗组.油酸静脉注射复制急性肺损伤模型.动脉血气、肺组织病理学检测评估肺损伤程度,电镜下观察急性分离的肺泡Ⅱ型上皮细胞的变化,重力法测定血管外肺水量(EVLWI).结果 急性肺损伤组大鼠肺损伤评分为(6.37±1.26)分、血管外肺水量为(4.02±0.69)mL/g,显著高于正常组[(1.39±0.5)分和(2.73±0.50)mL/g],均P<0.05;特布他林治疗后大鼠肺损伤评分为(5.23±1.14)分,血管外肺水量为(3.50±0.45)mL/g,较急性肺损伤组显著下降(均P<0.05).电镜下观察急性肺损伤组肺泡Ⅱ型上皮细胞形状不规则,染色质边集,线粒体肿胀,板层小体排空及空泡化等;经特布他林治疗后,电镜观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体肿胀程度及板层小体排空程度较急性肺损伤组轻.结论 油酸致急性肺损伤大鼠肺泡液体清除能力下降,特布他林可以减轻肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤,提高肺水清除能力.     

小鼠胚胎成纤维细胞对体外培养肺泡上皮Ⅱ型细胞干性的维持作用

目的：探讨小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast cell,MEF）作为滋养细胞对体外培养肺泡上皮Ⅱ型细胞（alveolar epithelial type Ⅱ cells,ATⅡ）干性的维持作用。方法：通过分散酶（Dispase）、分散酶/胶原酶（colleganse/disapase）和脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅰ）联合消化小鼠肺组织,制备肺单细胞悬液,通过免疫黏附法纯化ATⅡ。高糖DMEM添加10%FBS、双抗（青霉素20 U/ml,链霉素20 U/ml）;将传代后的ATⅡ接种至丝裂霉素处理的MEF（inactivated MEF,iMEF）培养,并以肺泡表面活性蛋白C（surfactant protein C,SPC）和水通道蛋白5（aquaporins 5,AQP5）为标记蛋白进行鉴定。结果：平均每只成年小鼠可得到总有核细胞数为（1.7～2.0）×107。ATⅡ细胞传代接种于滋养细胞前3代都能维持在未分化状态,第4代分化成为肺泡上皮Ⅰ型细胞（alveolar epithelial type Ⅰ cells,AT Ⅰ）;而传代后没有接种在滋养细胞上的ATⅡ细胞在第1代就分化成ATⅠ细胞。结论：小鼠胚胎成纤维细胞在一定时段能够维持ATⅡ的干性。     

水通道蛋白1与肿瘤的研究现状

水通道蛋白（Aquaporin,AQP）是对水的通道,普遍存在于动、植物及微生物中,它所介导的水快速的跨生物膜转运,是水进出细胞的主要途径。最新观点认为AQP具有致癌特性,AQP全长cDNA的异位表达引起许多表现型的改变,包括细胞增殖活性加强、非依赖生长的增殖细胞固定等。