pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的观察细胞穿透肽PEP-1介导CAT转导入在体大鼠心肌组织的能力,探究PEP-1-CAT融合蛋白对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法以生理盐水为对照,分别从SD大鼠尾静脉注射500μgPEP-1-CAT和CAT融合蛋白,在0.5,1,2,4,8,24h时将其处死,取其心脏,免疫荧光检测CAT的转导能力,用试剂盒检测心肌CAT的酶活性。40只SPF级雄性SD大鼠,随机分为5组,假手术组,心肌缺血再灌注组,100μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组,300μgEP-1-CAT融合蛋白预处理组,500μgPEP-1-CAT融合蛋白预处理组。结扎冠状动脉前降支1h,再灌注2h末,检测血中的LDH和CK活性以及心肌组织内的MDA含量。结果生理盐水组以及CAT组,荧光显微镜下均未见到绿色荧光;PEP-1-CAT各组均可观察到绿色荧光,且8h时强度最大;酶活性检测显示,CAT组与生理盐水对照组差别没有统计学意义（P〉0.05）,而PEP-1-CAT组随着时间的延长,心肌组织中CAT的活性逐渐增加,在8h时达到峰值,为对照组的4.20倍。PEP-1-CAT各剂量组均能显著减少血清中LDH和CK活性和心肌组织的MDA含量（P〈0.01）。结论PEP-1能够介导CAT以时间依赖的方式转导入在体大鼠心肌组织,转导入大鼠心肌组织内的CAT具有相应的酶活性;PEP-1-CAT融合蛋白预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,为临床应用PEP-1-CAT融合蛋白防治心肌缺血再灌注损伤奠定了实验基础。     

PEP-1-CAT抑制氧化应激条件下大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

目的:研究PEP-1-CAT融合蛋白转导入大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,MSC)的能力,以及其预处理对MSC在氧化应激损伤条件下凋亡的影响及其机制。方法:采用流式细胞仪检测MSC表面标记物CD29、CD90、CD45、CD34,并检测成脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化能力。采用免疫荧光染色和Western blot检测融合蛋白His-CAT和His-PEP-1-CAT转导入MSC的能力。DAPI染色和流式细胞仪检测细胞的凋亡率,采用相应的试剂盒分别检测丙二醛(MDA)含量、乳酸脱氢酶(LDH)活性的改变和线粒体膜电位的变化。结果:MSC低表达CD34(1.78%)、CD45(1.41%),高表达CD29(94.3%)、CD90(95.5%),具有成脂、成骨多向分化的潜能。PEP-1-CAT转导入MSC中呈现时间和剂量依赖性特征,而His-CAT不能进入细胞内。与His-CAT组相比较,PEP-1-CAT融合蛋白预处理组MSC的凋亡率明显降低,LDH和MDA含量明显下降,减轻了因氧化应激引起的线粒体膜电位的下降。结论:PEP-1-CAT融合蛋白通过清除活性氧,维持线粒体膜电位的稳定,显著抑制了MSC在氧化应激损伤情况下的凋亡。     

PCR产物靶向克隆法构建原核表达载体pET15b-CAT

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT.方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2( )-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增.将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6:1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经Xho Ⅰ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.结论:PCR产物靶向克隆法是一种简便、高效地将PCR产物定向克隆于目标载体的方法,而无需对PCR产物进行酶切、末端抹平、载体去磷酸化及连接反应,适用于任何载体、任何插入片段和任意酶切位点.     

PEP-1肽介导入过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的：采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株（CRL-1730），研究PEP-1肽介导入过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法：构建原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT，将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”（His—tag）的重组蛋白，并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化，然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞，通过Western　blot来分析其转导能力。结果：测序分析证实，原核表达质粒pET15b—PEP-1-CAT重组成功。SDS—PAGE和Western blot结果表明，PEP-1-CAT在E．coli中获得了高效表达，经Ni^2＋ -NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT，并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性，活性值为77．1U／g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中，发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内，并能保持酶活性达48h。结论：PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞，为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。     

人白介素—1β转换酶的克隆及重组质粒构建

白介素－1β转换酶（nitereukin－1β－conver－tingenzyme，ICE）是半胱氨酸蛋白酶家族中的一员。研究提示，ICE可能在哺乳类细胞凋亡过程中起重要作用。为进一步了解该基因在凋亡诱导中的作用，以及潜在的临床应用价值，我们克隆了人ICE的CDNA序列，并构建了相应的真核?..     

pGBKT7-hSOD1cDNA 重组质粒构建及鉴定

目的 构建 hSOD1cDNA- pGBKT7 重组质粒,并进行鉴定。方法 采用基因克隆技术克隆目的基因片段,利用基因重组技术构建 hSOD1cDNA- pGBKT7 重组质粒。 结果 重组质粒经双酶切鉴定,目的基因已与载体连接。重组质粒测序结果经 BLAST 比对,与已知目的基因序列及载体序列相符,证实了重组质粒构建的正确性。结论 重组质粒 hSOD1cDNA- pGBKT7构建成功。     

PEP-1介导过氧化氢酶对大鼠离体心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带过氧化氢酶(CAT)穿透大鼠离体心肌的能力,并探讨PEP-1-CAT融合蛋白预处理对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其机制。方法:建立大鼠离体心脏Langendorff灌流模型,随机分为5组(n=10):缺血-再灌注组(I/R组)行平衡30 min、停灌30 min与再灌注60 min,CAT组、PEP-1-CAT融合蛋白预处理组(A、B、C、D组)在平衡15 min后依次以10,5,10,20μmol/L的融合蛋白预处理15 min,停灌、复灌与I/R组相同。记录各组左室舒张末压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室内压最大变化速率(±dp/dtmax)及冠脉流量(CF)变化,测定平衡15 min时、再灌注15 min时冠脉流出液乳酸脱氢(LDH)活性。测定再灌注60 min时心肌丙二醛(MDA)含量。结果:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌组织并呈现剂量依赖性。在平衡15 min末,各组LVEDP、LVSP、±dp/dt max以及LDH活性比较差异无统计学差异(P>0.05)。与I/R组比较,B、C、D组在再灌注后各时间点LVEDP降低(P<0.01),LVSP、±dp/dt max以及CF升高(P<0.01),灌注15 min时冠脉流出液LDH活性降低(P<0.01),再灌注后60 min心肌MDA含量降低(P<0.01)。CAT处理组所有结果和对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效转导入离体心肌织并对大鼠离体心肌缺血-再灌注损伤具有明显的保护作用,将为其治疗心肌缺血再灌注损伤奠定坚实的实验基础。     

人WAF1基因表达质粒的构建

目的 :克隆人 WAF1基因 ,构建成 WAF1 - pc DNA3真核表达质粒。方法 :采用逆转录聚合酶链反应从 Hela细胞中扩增人 WAF1基因 ,并克隆到 pc DNA3真核克隆载体中。结果 :从 Hela细胞扩增的人 WAF1基因克隆至真核克隆表达载体 pc DNA3中 ,经 DNA直接测序 ,获得了 WAF1 -pc DNA3重组质粒。结论 :成功地构建人 WAF1表达质粒 WAF1 - pc DNA3,为进一步研究 WAF1基因表达及生物学效应奠定了基础。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

小鼠窖蛋白-1 基因重组腺病毒载体的构建

目的应用AdEasy重组腺病毒载体系统,构建携带小鼠窖蛋白-1(caveolin-1)编码区基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-caveolin-1。方法将质粒pTRE2-caveolin-1中的小鼠caveolin-1编码序列亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV中构建重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-caveolin-1,酶切线性化后转入已含有病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌中进行同源重组。筛得的病毒质粒pAd-caveolin-1经酶切鉴定后,在293细胞中包装成重组腺病毒。荧光显微镜观察绿色荧光表达。扩增并纯化病毒,测定病毒滴度和重组病毒插入片段的序列。结果重组腺病毒质粒经酶切鉴定证实成功构建了携带caveolin-1基因的重组腺病毒载体,转染293细胞后可出现明显的细胞病变效应,并观察到绿色荧光的表达,caveolin-1基因测序鉴定与GenBank中公布序列一致。重组腺病毒的滴度为:2×109pfu/mL。结论应用AdEasy系统成功地构建了重组腺病毒载体Ad-caveolin-1,通过该系统携带的绿色荧光蛋白(GFP)标记基因可直观检测靶细胞转染和外源基因表达的情况,为进一步研究caveolin-1在牙齿发育中的作用奠定了基础。     

大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1反义基因片段TA克隆载体的构建

目的：构建含大鼠金属蛋白酶组织抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)反义基因片段TA克性载体，为进一步研究TIMP-1在肾组织纤维化中的作用奠定基础。方法：本实验利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），从提取的大鼠肾组织总RNA中特异地扩增含313bp的TIMP-1cDNA片段，并将其克隆到TA载体。结果：用限制性内切酶鉴定313bp的TIMP-1cDNA片段插入方向，测序结果证实扩增片段为目的片段。结论：成功地构建了含大鼠TIMP-1反应基因片段TA克隆载体。