乙型肝炎病毒转基因小鼠

乙型肝炎病毒转基因小鼠对研究HBV基因结构和功能，基因表达的调控，HBV的复制和致肝细胞病变的关系，HBV感染和宿主免疫系统的应答以及HBV感染与肝细胞癌之间的相互关系等，都有极为重要的意义。本文对HBV转基因小鼠及其在研究HBV中的应用进用综述。     

对乙型肝炎病毒疫苗无应答性成人的HBV感染调查

<正> 据报道我国每年由乙型肝炎(简称乙肝)垂直传播可使80～100万新生儿成为乙肝病毒携带者。现在国家已将乙肝疫苗注射列入计划免疫,这是造福全国人民和子孙后代的具有深远意义的战略措施。但临床常遇到对疫苗无抗HBs应答反应者。为探讨无应答性的原因,我们对从数百名接种疫苗者中筛检出的10例无抗HBs应答者成人,用敏感的聚合酶链反应(PCR)试验检测其血清中HBV DNA,并分析其结果,试图为制定防治措施提供一些资料。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠研究现状

由于HBV感染具有明显的种属特异性，只感染人及黑猩猩等灵长类动物，使乙型肝炎的研究一直缺乏理想的动物模型。转基因小鼠出生前就能在内源性HBV启动子的控制下，主要在肝脏内持续转基因表达，在肝细胞内没有HBsAg积累，也没有肝细胞病变，HBsAg以亚病毒颗粒的形式以9000mg/ml的浓度分泌入血。这些小鼠对高水平的循环抗原耐受，不产生抗HBs，可被用作HBV慢性携带状态模型。本文对HBV转基因小鼠转基因表达、免疫耐受及打破免疫耐受的机理等作一简要综述。     

慢性乙型肝炎病毒携带合并非酒精性脂肪性肝病小鼠模型建立与观察CSCD

目的建立慢性乙型肝炎病毒（HBV）携带合并非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）小鼠模型。方法4周龄BALB／cHBV转基因小鼠100只,雌雄各半,高脂组70只予高脂饲料喂养,正常组30只予普通饲料喂养。16周末随机处死高脂组小鼠10只,肝组织及血清学检测确认目标模型建立。造模成功后高脂组再随机分为模型组和对照组,每组30只,模型组继以高脂饲料喂养,对照组改以普通饲料喂养,正常组维持原普通喂饲,连续72周（含造模16周）。第24、48和72周末每组分别随机处死小鼠10只,全自动生化仪检测血清ALT、AST、TC、TG、FBG,荧光定量PCR法检测HBV—DNA,化学发光法检测HBsAg,肝组织切片后HE染色评价组织学变化,观察小鼠模型的动态演变情况。结果①高脂饲料喂养16周后,小鼠体质量增加,血清ALT、AST、TC、TG、FBG等各项生化指标升高,HBV．DNA阳性,肝组织HE染色示肝细胞明显大泡性脂肪变性和小叶内淋巴细胞浸润,NAFLD活动度评分（NAS）接近NASH,慢性HBV携带合并NAFLD小鼠模型建立成功。②模型组血清TC和TG值在各观察点均高于对照组和正常组。③24周和72周各组间HBV—DNA值存在明显差异,且差异具有统计学意义（P〈0．05）。④48周和72周各组间NAS存在明显差异,且差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论①高脂喂养HBV转基因小鼠可建立慢性HBV携带合并NAFLD小鼠模型。②NAFLD在一定程度上促进HBV携带小鼠的肝病进展。     

乙型肝炎病毒转基因小鼠C57-TgN(adr2.0)SMMU品系的免疫病理研究

目的: 研究乙型肝炎病毒 (HBV)转基因小鼠C57 TgN(adr2. 0型)SMMU品系的免疫病理学特征, 并与临床人慢性乙肝相比较。方法: 以 20只SPF级肝脏有明显病变的HBV转基因小鼠为研究对象, 用间接免疫荧光法通过流式细胞仪, 分别检测转基因小鼠及正常C57BL/6小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8表达的水平, 同时取其肝组织和5例本院病理科存档确诊为慢性中度乙型肝炎患者的肝组织石蜡标本, 用EnVision免疫组化染色法检查肝组织内T细胞亚群的分布。结果: 转基因小鼠外周血淋巴细胞表面CD3、CD4和CD8表达的水平低于正常对照组小鼠; 肝组织内浸润的单个核细胞多数为CD3 CD4 细胞, 未发现CD57 、CD8 细胞。慢性乙型肝炎患者的肝组织内浸润的单个核细胞主要为CD3 CD4 或CD3 CD8 细胞和少量CD57 细胞。结论: C57 TgN(adr2. 0型 )SMMU的HBV转基因小鼠外周血及肝组织中CD的表达与人慢性乙肝患者的外周血及肝组织有明显不同。     

乙型肝炎病毒HBcAg免疫优势CTL表位多肽在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能研究

目的 探讨基于乙型肝炎(Hepatitis bvirus ,HBV)核心抗原免疫优势细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位的治疗性多肽抗原组分、结构以及在HBV转基因小鼠体内的免疫学功能。方法 用分子设计的理论和方法，设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre—S2B细胞表位及破伤风类毒素通用TH表位的治疗性多肽疫苗候选分子，经Merri—field固相多肽合成技术合成，经高效液相色谱(HPLC)纯化、鉴定。以HBV转基因小鼠为试验对象，进行体内免疫学功能研究。结果 所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CD8^ T细胞应答和适度的抗体反应，并抑制HBV特异性抗原的分泌和乙型肝炎病毒复制。结论 提示所设计基于HBV核心抗原免疫优势性CTL表位、Pre-S2 B细胞表位及破伤风类毒素通用TH表位的多肽分子可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗候选分子。     

拉米夫定耐药后的抗乙型肝炎病毒治疗

目的探讨拉米夫定耐药后慢性乙型肝炎患者采用α2b干扰素或α2b干扰素加α1胸腺肽进行后续抗病毒的疗效。方法共66例拉米夫定耐药患者,分治疗组A、治疗组B和对照组。治疗组A26例,单用α2b干扰素治疗1个月后停用拉米夫定,然后继续单用α2b干扰素治疗5个月;治疗组B10例,α2b干扰素和α1胸腺肽联合治疗1个月后停用拉米夫定,然后继续两药联合治疗5个月;对照组30例,直接停用拉米夫定,不用其他任何抗病毒药。定期进行血清肝功和病毒学指标检测。结果治疗组A和治疗组B的HBVDNA阴转率和HBeAg/HBeAb转换率均明显高于对照组。结论慢性乙型肝炎患者拉米夫定耐药后采用α2b干扰素或α2b干扰素加α1胸腺肽进行后续抗病毒治疗可能是有益的。     

CpG-ODN体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的:探讨CpG-ODN体外对HBV复制和HBV抗原表达的抑制作用。方法:CpG-ODN体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC),用ELISA检测培养液中IFN-α及IFN-γ的水平。将不同比例的PBMC培养上清与HepG2. 2. 15细胞共孵育 2、4、6、8d后,用ELISA和荧光定量PCR法,分别检测培养上清液中HB sAg、HBeAg和HBVDNA的水平。结果:CpG-ODN可诱导PB MC分泌IFN-α和IFN-γ。CpG-ODN本身虽不能直接抑制HBV的复制,但经刺激活的化的PBMC的培养上清,却能显著抑制 2. 2. 15细胞产生HBsAg、HBeAg和HBVDNA,在培养的第 8天,抑制率最高分别达 90. 8%、31. 3%和 32. 2%。结论:CpG-ODN作为一种新型的免疫调节剂,可诱发机体的免疫效应,抑制HBV复制和HBV抗原的表达。     

乙型肝炎病毒生物标志物的研究进展及其临床意义

乙型肝炎病毒（HBV）感染可导致慢性肝炎、肝纤维化甚至肝硬化或肝癌等严重后果,有效的抗病毒治疗可以减缓疾病进展。乙肝病毒生物标志物在慢性乙型肝炎（CHB）患者全程动态化管理中具有重要作用,而经典乙肝病毒标志物（如乙肝两对半、HBV DNA）尚不能完全满足临床需求。本文综述了HBsAg定量、抗-HBc定量、HBV RNA和HBV核心相关抗原等HBV标志物的最新研究,总结了这些标志物在CHB患者抗病毒治疗中的使用、疗效预测和停药后复发风险预测,以及疾病进展风险评估等方面的作用。     

新型CpGODN对乙型肝炎病毒复制的抑制作用

目的:探讨我室自行设计的CpG ODN(CpG BW001)在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的抑制作用.方法:CpG BW001刺激人外周血单个核细胞(PBMC)48小时,用VSV病毒保护实验及ELISA法检测培养上清的病毒保护能力及其中的IFN-α含量.将上述CpG BW001刺激人PBMC的上清与HepG2.2.15细胞共孵育12天后收集培养上清,用放射免疫法检测该培养上清液中HBsAg及HBeAg的含量,用点杂交法检测HBV DNA的含量.结果:CpG BW001刺激人PBMC产生以IFN-α为主的抗病毒物质;CpG BW001刺激人PBMC的培养上清作用于HepG2.2.15细胞后,HepG2.2.15细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量明显减少,且细胞内HBV DNA的含量也显著降低.结论:CpG BW001能通过刺激细胞产生抗病毒物质如IFN-α等,从而在体外抑制HBsAg和HBeAg的表达及HBV的复制.     

反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断乙肝病毒C基因表达

目的 探讨针对乙肝病毒C基因反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断病毒基因表达的效果.方法 各实验组经尾静脉给药后,采用real-time PCR、时间分辨免疫荧光技术、免疫组织化学法等技术分别检测血清HBV DNA、HBeAg含量及肝细胞内HBcAg的表达情况.结果 注射锁核酸后,对乙肝病毒核酸的复制和乙肝病毒e抗原的合成均有较强的抑制作用,注射后1、3 和5 d,HBV DNA的平均抑制率分别19.24％、39.20％和44.47％;HBeAg的平均抑制分别为30.71％、51.14％和63.46％;小鼠肝细胞的HBcAg阳性细胞数也较对照组明显减少.结论 针对乙肝病毒C基因的反义锁核酸在转基因小鼠体内能有效抑制病毒基因的复制和表达,提示C基因可作核酸药物治疗的有效靶位.     

乙肝疫苗增强细胞因子诱导的杀伤细胞对于转乙型肝炎病毒基因小鼠的治疗作用

目的 观察乙肝疫苗是否增强细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对于乙型肝炎病毒转基因小鼠(hepatitis B virus transgenic mice,HBV-Tg)的抗病毒作用.方法 给予HBV-Tg腹腔注射CIK细胞,皮下注射乙肝疫苗,用荧光定量PCR检测外周血中HBV DNA水平变化,流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群,并用HE染色观察肝脏的组织病理改变.结果 CIK细胞降低了HBV-Tg鼠外周血中病毒载量,血中CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞增多,乙肝疫苗和CIK细胞联合应用后,这种作用增强.结论 乙肝疫苗增强了CIK对于HBV-Tg小鼠的治疗作用,这种增强作用是否通过增加体内CD3~+、CD4~+及CD8~+细胞,尤其是CD8~+细胞而实现,有待进一步研究.     

Hepatitis B virus (HBV)-transgenic mice as an investigative tool to study immunopathology during HBV infection

An overview is given regarding the use of hepatitis B virus (HBV) transgenic mice as an animal model of the HBV-carrier state. Initially, we show how HBV-transgenic mice have contributed insights into the immunopathobiological processes during HBV infection and later, we show how this new information from the experiments with HBV-transgenic mice could be used to develop new methods to combat HBV infection. By microinjecting the full or selected parts of the HBV-genome into the fertilized eggs of inbred mice, different laboratories have developed different lines of HBV-transgenic mice, which express products of the HBV genome and also show signs of HBV replication. Studies in HBV-transgenic mice have provided insights into the process of destruction of hepatocytes, the critical role of cytokines in controlling HBV replication and gene expression, mechanisms underlying the immune response defect in chronic HBV-carriers and the critical role of antigen presenting cells (APC), especially that of antigen presenting dendritic cells in persistent HBV infection. All this new information has given us a better understanding about HBV immunopathobiology, and has led to the development of new therapeutic approaches to combat HBV infection.     

Involvement of mitochondrial permeability transition in hepatitis B virus replication

The HBx protein of human hepatitis B virus (HBV) activates a calcium-dependent kinase pathway which is essential for the viral replication. In this study, we found that HBx expression in the absence of other HBV proteins and in the context of HBV replication decreased the mitochondrial calcein-AM/CoCl₂ signals by 10% and 14% in HepG2 cells and by 15% and 10% in Huh7 cells, respectively. This indicates that HBx can induce mitochondrial permeability transition (MPT) and cause calcium effusion into the plasma. In addition, RNA interference of Cylophilin D decreased HBx-induced MPT and suppressed HBV DNA replication by 41% in HepG2 cells. Our results suggest that HBx expression can induce MPT and facilitate HBV DNA replication.     

DNA疫苗诱导健康小鼠细胞免疫及HBV转基因小鼠抗-HBs产生

目的 :在HBVDNA疫苗成功地诱导健康小鼠体液免疫应答的基础上 ,探讨其作为抗 HBV治疗的可行性及作用机理。方法 :应用基因重组技术 ,构建编码HBV中蛋白 (preS2 +S)及人白细胞介素融合蛋白基因的真核表达质粒pS2 .S及pFP ,继经肌注免疫健康Balb C及HBV转基因 (Tg)小鼠并观察健康小鼠细胞免疫应答及HBVTg小鼠HBsAg的血清转换。结果 :1 体外HBsAg对DNA疫苗免疫后的T细胞的刺激呈浓度相关 ,HBsAg 30 μg ml时刺激pS2 .S免疫小鼠脾细胞增殖指数(5 6± 0 9)明显较pcDNA3 1组 (2 0± 0 5 )高。细胞培养上清液细胞因子水平检测结果 :免疫实验组IL 2及IFN γ的分泌水平明显较对照组高 ,而IL 4水平于各组影响不明显。 2 pS2 .S免疫小鼠局部引流淋巴结DCs诱导HBsAg致敏的T 细胞增殖指数(4 2 0 )较pcDNA3.1组 (2 5 5高 )。 3 高剂量的pS2 .S组与联合pFP组各有一只Tg小鼠分别于 2、4w开始发生HBsAg血清转换 ,且其抗体水平随时间而增长。结论 :结果表明HBVDNA疫苗能有效诱导HBsAg特异性的细胞免疫应答 ;HBV Tg小鼠初步实验结果为治疗型HBVDNA疫苗的深入研制提供了实验依据。     

人工合成免疫刺激DNA联合HBsAg DNA疫苗在HBV转基因鼠的免疫应答研究

目的 :探讨免疫刺激DNA序列联合基因免疫在HBV转基因鼠的免疫应答。方法 :用人工合成硫代修饰的免疫刺激DNA寡核苷酸 (CpGODN)与HBVS区基因真核表达载体 (V HBs)联合免疫HBsAg转基因鼠 ,通过ELISA观察小鼠血清HBsAg及抗 HBs抗体水平 ,并用免疫组化 (SP法 )及病理HE染色观察小鼠肝组织HBsAg表达量的改变及肝组织炎症活动度。结果 :V HBs联合CpGODN组 6只免疫鼠中有 2只血清抗 HBs抗体阳性 ,其平均效价为 (5 6 2 1± 15 16 )mU ml,血清HBsAg浓度在免疫后第 8周时有 2只转阴 ,而单用V HBs组及V 10 12对照组小鼠血清抗 HBs抗体均阴性、HBsAg含量无明显降低。V HBs +CpGODN组肝组织HBsAg的表达量低于V HBs组及对照组 ,并可见大量炎细胞浸润 ,炎症组织活动度积分明显高于V HBs组及对照组。结论 :CpGODN联合V HBs可增强其免疫应答及抗病毒效应。     

尿液中乙肝病毒DNA对HBV相关肾炎患者的诊断效果

目的 了解尿液中乙肝病毒DNA对HBV相关肾炎患者的诊断效果,为更好的诊断HBV相关肾炎(HBV-GN)提供依据.方法 选取于2013年10月～2014年10月在我院肾内科就诊的HBsAg阳性或血清HBV-DNA阳性者60例作为Ⅰ组、HBsAg阴性且清HBV-DNA阴性者60例作为Ⅱ组、同期在我院健康体检中心体检的健康者60例作为Ⅲ组.采用PCR方法检测各组研究对象尿中HBV DNA水平.结果 Ⅰ组中有38例(63.33％)患者尿HBV DNA呈阳性,Ⅱ组、Ⅲ组中无患者尿HBV DNA呈阳性.尿HBV DNA、血HBsAg和血HBeAg联合检查诊断HBV-GN的灵敏度和特异度均是最高的,其次为尿HBV DNA检测.结论 联合检测尿HBV DNA、血HBsAg和血HBeAg诊断HBV-GN效率比较高,尿HBV DNA可能作为HBV-GN的一种简单、无创、患者容易接受的辅助诊断指标.     

Increased liver pathology in hepatitis C virus transgenic mice expressing the hepatitis B virus X protein

Transgenic mice expressing the full-length HCV coding sequence were crossed with mice that express the HBV X gene-encoded regulatory protein HBx (ATX mice) to test the hypothesis that HBx expression accelerates HCV-induced liver pathogenesis. At 16 months (mo) of age, hepatocellular carcinoma was identified in 21% of HCV/ATX mice, but in none of the single transgenic animals. Analysis of 8-mo animals revealed that, relative to HCV/WT mice, HCV/ATX mice had more severe steatosis, greater liver-to-body weight ratios, and a significant increase in the percentage of hepatocytes staining for proliferating cell nuclear antigen. Furthermore, primary hepatocytes from HCV, ATX, and HCV/ATX transgenic mice were more resistant to fas-mediated apoptosis than hepatocytes from nontransgenic littermates. These results indicate that HBx expression contributes to increased liver pathogenesis in HCV transgenic mice by a mechanism that involves an imbalance in hepatocyte death and regeneration within the context of severe steatosis.