人MT2A基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的 用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人金属硫蛋白2A(MT2A)真核表达载体,用其转染HEK 293T,COS-7细胞观察MT2A在增殖细胞内的表达和定位.方法 设计带FLAG-tag的引物,以人MT2A全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增MT2A全长序列,然后插入pCDNA 3.1中构建pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;脂质体法转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察MT2A表达的蛋白在细胞内定位.结果 正确构建了pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;其在HEK 293T细胞中能有效地表达;免疫荧光实验表明在COS-7细胞中,MT2A主要分布在细胞质内.结论 该研究结果为了解MT2A 在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础.     

pEGFP-N1-PP1α真核表达载体的构建及其在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人PP1α基因真核表达载体, 并观察其在人骨肉瘤细胞株(U-2OS)中的表达,为进一步研究PP1对骨肉瘤细胞凋亡影响提供基础.方法 提取U-2OS细胞中总RNA,RT-PCR扩增PP1α并克隆至pEGFP-N1载体,鉴定出阳性克隆送测序, 以重组质粒转染U-2OS细胞,通过Western blot检测转染细胞中PP1α的表达.结果 成功扩增PP1α基因大小片段,重组质粒pEGFP-N1-PP1α的酶切鉴定及测序结果均证明PP1α基因成功克隆到真核表达载体中,Western blot结果证实转染重组质粒后的U-2OS细胞PP1α蛋白表达水平增强.结论 实验将pEGFP-N1-PP1α质粒转染到U-2OS细胞,可以在U-2OS细胞中获得PP1α蛋白增强表达.     

RNA干扰抑制血管平滑肌细胞MT1-MMP基因表达的实验研究

目的 探讨膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)shRNA真核表达载体(pGenesil-1-MT1-MMP)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)MT1-MMP基因mRNA表达及蛋白表达的影响.方法 构建质粒表达载体pGenesil-1-MT1-MMP和pGenesil-1-HK;实验分为3组:空白对照组,阴性对照组(加入pGenesil-1-HK),RNA干扰(RNAi)组(加入pGenesil-1-MT1-MMP).用脂质体瞬时转染VSMC,48 h后通过荧光显微镜观察转染效果,流式细胞仪检测转染效率.于转染后72 h采用RT-PCR方法检测MT1-MMP mRNA表达水平,用Western blot方法检测MT1-MMP蛋白质表达水平.结果 瞬时转染VSMC 48 h后通过流式细胞仪检测转染效率高达85.5%,转染pGenesil-1-MT1-MMP质粒72 h后,RNAi组MT1-MMP mRNA及蛋白质水平明显下调(P<0.05).结论 靶向MT1-MMP的短发夹RNA质粒能够高效地转染入VSMC,并能有效下调MT1-MMP基因mRNA和蛋白的表达.     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

APC不同功能区域对结肠癌细胞株HT-29中β-连环蛋白表达的影响

目的:探讨含有APC蛋白不同功能区域的pEGFP-N3-APC重组质粒对结肠癌细胞株HT-29中β-连环蛋白表达的影响.方法:脂质体介导重组质粒pEGFP-N3-APC1～5转染HT-29,采用绿色荧光及RT-PCR验证重组质粒在细胞中的表达.以Western免疫印迹检测转染后HT-29细胞中β-连环蛋白的表达,以SPSS 13.0软件分析电泳条带的灰度值.结果:重组质粒转染HT-29细胞后,绿色荧光及RT-PCR结果显示5个APC蛋白不同功能区域多肽可在细胞中表达.Western免疫印迹结果显示,重组质粒pEGFP-N3-APC1,pEGFP-N3-APC2和pEGFP-N3-APC3对β-连环蛋白表达无影响,而pEGFP-N3-APC4和pEGFP-N3-APC5均可降低结肠癌细胞株HT-29中β-连环蛋白的表达水平,其中以pEGFP-N3-APC5的抑制程度最强.结论:含有APC蛋白中15氨基重复序列+SAMP重复序列的APC5基因片段既可有效降低β-连环蛋白的表达,同时又是相对长度较短的可用于基因治疗的最优片段.     

MafA真核表达载体的构建及在人肝癌细胞中的表达

目的:构建肌腱膜纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)真核表达载体pEGFP-N2/MafA,pEGFP-C1/MafA,观察MafA在人肝癌细胞HepG-2细胞内的表达.为研究Mafa基因功能和作用机制奠定基础.方法:提取胰腺总RNA,经RT-PCR获得MafA基因片段,在两端分别引入Hind Ⅲ和Sal Ⅰ的酶切位点.重组至有增强绿色荧光蛋白标记的真核表达载体pEGFP-N2,pEGFP-C1中,用脂质体方法转染至人肝癌细胞HepG-2细胞中,通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测MafA基因和insulin Ⅱ基因的表达.结果:通过RT-PCR获取了MafA基因并成功克隆人载体,转染的细胞有绿色荧光蛋白表达及MafA基因表达,但没检测到insulin Ⅱ基因表达.结论:成功构建质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,并成功表达MafA 基因,但没有insulin Ⅱ基因的表达.     

pEGFP-N1-BMP2真核表达载体的构建及其经超声微泡介导转染HPDLFs后的表达

目的 构建pEGFP-N1-BMP2真核表达质粒,并检测其经超声微泡转基因技术转染人牙周膜成纤维细胞(HPDLFs)后的瞬时表达情况.方法 从人胎盘滋养层细胞系中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的 基因人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,连接pMD19-T载体并测序正确后与真核荧光表达载体pEGFP-N1连接,酶切鉴定后利用超声微泡转基因技术转染入HPDLFs中,通过荧光显微镜和RT-PCR检测目的 基因在HPDLFs中的表达.结果 成功克隆人BMP2基因,重组质粒pEGFP-N1-BMP2经PCR及双酶切鉴定均证实hBMP2基因已与pEGFP-N1正确重组.pEGFP-N1-BMP2经超声微泡转染HPDLFs后,通过绿色荧光观察和RT-PCR检测证实hBMP2能够在体外培养的HPDLFs内有效的转录和瞬时表达.结论 成功构建pEGFP-N1-BMP2真核表达载体,通过超声微泡转基因技术成功转染入HPDLFs并得到有效表达,为进一步研究该质粒与超声微泡转基因技术在牙周再生基因治疗中的应用提供实验基础.     

重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN对胃癌SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响

目的 构建人细胞外金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）重组质粒,观察其在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞侵袭和迁移的影响。方法 从结肠癌细胞株SW-480中提取总RNA,通过RT-PCR获得EMMPRIN基因,连接至载体pEGFP-N1,构建重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN,通过脂质体Lipofectamine 2000转染胃癌SGC-7901细胞;RT-PCR和Western blotting分别检测EMMPRIN mRNA和蛋白在SGC-7901细胞中的表达,Transwell实验检测EMMPRIN对SGC-7901细胞侵袭和迁移的影响。结果 重组质粒pEGFP-N1-EMMPRIN构建成功,并在SGC-7901细胞中表达,RT-PCR和Western blotting检测示转染后SGC-7901细胞中EMMPRIN mRNA和蛋白表达均增加,Transwell实验检测示转染后SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力均显著增强。结论 EMMPRIN可显著增强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。     

pEGFP-N1-亚麻苦甙水解酶重组真核表达载体的构建及亚麻苦甙水解酶在SGC-7901细胞中的表达

目的:构建携带亚麻苦甙水解酶(lis)基因的重组真核表达载体,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,导入SGC-7901细胞中表达。方法:提取木薯总RNA,PCR扩增lis目的基因,将该基因全长定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。用电穿孔法转染体外培养的SGC-7901细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察lis-EGFP融合蛋白在细胞中的表达。用PCR检测lis转录水平的表达,用Western blot法验证lis蛋白水平的表达。结果:酶切和测序证实pEGFP-N1-lis重组质粒构建正确,重组质粒载体在SGC-7901细胞中获得了表达,表达的融合蛋白具有lis和EGFP的双重活性。结论:通过基因克隆方法成功地构建了pEGFP-N1-lis重组质粒载体,并且在SGC-790细胞中稳定表达。     

EGFP-N1/hNGF β逆转录病毒载体的构建及其表达

目的 构建高表达含人神经生长因子β基因(hNGF-β)的逆转录病毒栽体,并检测其在施万细胞中的表达情况.方法 从含有hNGF-β的pAAV-SP质粒中克隆出hNGF-β,连接到pEGFP-N1载体中,形成重组逆转录病毒载体pEGFP-N1-NGFβ.用重组体转染施万细胞,经G418筛选出阳性克隆后,用ELISA法检测NGF的表达量.结果 hNGF-β的RT-PCR产物约750bp,双酶切鉴定重组载体为正确重组子.荧光显微镜下观察证实转染的施万细胞表达EGFP,ELISA检测证实转染的施万细胞分泌hNGF β升高.结论 应用体外连接法成功构建了hNGF-β逆转录病毒载体,而且施万细胞能够高效表达NGF β.     

MT2A基因多态性与2型糖尿病的关系

目的:探讨16号染色体长臂（16q）金属硫蛋白(metallothionein,MT)基因多态性与中国北方汉族人群2型糖尿病的关系。方法:采用PCR技术和限制性片段长度多态性(RFLP)的方法检测129名糖尿病患者(病例组)和115名正常对照者（对照组）的MT基因家族中的MT2A基因rs10636位点单核苷酸多态性。结果:rs10636 3种基因型GG、GC和CC的频数分布符合Hardy-Weinberg平衡;MT2A的3种基因型GG、GC和CC的频数分布在病例组和对照组中无统计学意义(χ²=0.202,P>0.05),等位基因G和C的频数分布在病例组和对照组中也无统计学意义(χ²=0.136,P>0.05)。结论:MT2A基因rs10636位点可能与2型糖尿病无关。     

EOLA1与MT2A相互作用及其上下游关系的确定

目的 研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)与金属硫蛋白2A(MT2A)的相互作用关系,明确其相互作用位点及上下游关系.方法 构建EGFP-EOLA1融合表达载体,转染HUVEC细胞,应用免疫荧光共定位成像技术观察EOLA1和MT2A在HUVEC中的共定位情况;应用截短突变和酵母双杂交确定EOLA1和MT2A的相互作用位置;应用RNAi技术建立EOLA1/MT2A上调和下调的HUVEC细胞模型,观测模型细胞EOLA1/MT2A的表达情况.结果 EOLA1和MT2A在HUVEC中存在共定位现象,共定位主要发生在核膜周围;酵母双杂交和免疫共沉淀实验结果显示,EOLA1的截短突变体1～77氨基酸(aa)片段和MT2A无结合活性,1～115aa片段及1～158aa片段和MT2A有结合活性.EOLA1上调/下调表达时MT2A同时相应上调/下调表达,MT2A的上调和下调表达对EOLA1表达无明显影响.结论 EOLA1和MT2A在HUVEC细胞内存在相互作用,相互作用位点位于EOLA1ORF的100～113功能域,EOLA1可以调控MT2A在HUVEC中的表达.     

吗啡依赖和戒断小鼠海马MT1、MT2基因表达的变化

【目的】探讨吗啡依赖和戒断小鼠海马金属硫蛋白（metallothionein，MT）MT1、MT2 mRNA表达的变化。【方法】剂量递增法皮下注射吗啡建立吗啡依赖小鼠模型，腹腔注射盐酸纳络酮诱发戒断症状。根据小鼠戒断反应中出现的跳跃次数、体重下降等指标评定戒断反应的强度。采用半定量逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法，观察实验小鼠海马MT1、MT2 mRNA的变化情况。【结果】吗啡依赖组MT1、MT2 mRNA表达水平高于对照组和吗啡戒断组（P〈0．05），吗啡戒断组MT1、MT2 mRNA表达水平高于对照组（P〈0．05）。【结论】吗啡依赖小鼠海马MT1、MT2 mRNA表达增加，纳络酮戒断能够抑制吗啡依赖引起的MT1、MT2表达增加，表明海马MT的表达变化参与了吗啡依赖和戒断过程。     

青少年特发性脊柱侧凸患者骨髓间充质干细胞褪黑素受体表达的研究

目的:比较体外培养的青少年特发性脊柱侧凸(AIS)患者组和正常对照组骨髓间充质干细胞(BMSCs)褪黑素受体表达的差异性,并探讨其意义。方法:分别从患者髂前上棘处穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝。采用密度梯度离心法分离BMSCs,体外培养并传至P3代,进行表型鉴定。抽提细胞的总RNA,采用RT-PCR方法检测2组褪黑素受体MT1、MT2 mRNA的表达水平。结果:分离的单个核细胞经培养至P3代,使用流式细胞仪进行细胞表型鉴定,体外培养细胞的表型与BMSCs的表面标志相符。AIS组MT1、MT2 mRNA的表达水平与正常对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论:AIS患者BMSCs褪黑素受体MT1、MT2的表达无异常。在干细胞水平,褪黑素受体与AIS的发病可能没有明显的相关性。     

人脑胶质瘤组织中MT1-MMP、MMP-2 mRNA的表达

目的 :分析MT1 MMP、MMP 2mRNA的表达与脑胶质瘤恶性程度和侵袭性之间的关系及其意义。方法 :采用原位杂交方法检测 4 2例人脑胶质瘤和 8例正常脑组织中MT1 MMP、MMP 2mRNA的表达。结果 :MT1 MMP、MMP 2mRNA的表达水平与肿瘤的级别呈正相关 (r=0 .875、0 .86 5 ,P <0 .0 1 ) ;Ⅲ～Ⅳ级脑胶质瘤组织与正常脑组织、Ⅰ～Ⅱ级脑胶质瘤组织之间标记指数差异有统计学意义 (P <0 .0 1 ) ;且MT1 MMPmRNA表达与MMP 2mRNA表达呈正相关 (r=0 .882 ,P <0 .0 1 )。结论 :MT1 MMP表达与脑胶质瘤的恶性程度和侵袭性有明显的关系 ;MT1 MMP与MMP 2在脑胶质瘤的侵袭过程中密切相关     

氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织MT3-MMP及TIMP2 mRNA表达的影响

目的 观察糖尿病大鼠肾组织膜3型基质金属蛋白酶(MT3-MMP)及组织2型金属蛋白酶抑制物(TIMP2)mRNA表达的变化及氯沙坦对它们的影响。方法 建立糖尿病大鼠模型并将之分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)、糖尿病+氯沙坦组(C组)。饲养18周后取出肾脏以RT-PCR法检测MT3-MMP、TIMP2及TGF-β1mRNA的表达,电镜观察大鼠肾小球基底膜厚度及系膜基质密度(系膜基质面积/系膜面积),收集24h尿检测尿白蛋白。结果 B组大鼠肾组织MT3-MMPmRNA、TIMP2mRNA和TGFβ1mRNA表达以及均显著高于A组,C组显著低于B组,但与A组无显著差异。B组尿白蛋白、基底膜厚度及系膜基质密度显著高于A组,C组均显著低于B组。P<0.05。结论 氯沙坦治疗可延缓糖尿病肾病的发生,并可抑制糖尿病大鼠肾组织MT3-MMP及TIMP2mRNA表达。     

MT1和MT5-MMPmRNA在肾细胞癌中的表达及其意义

目的 :探讨MT1-MMPmRNA和MT5 -MMPmRNA在肾细胞癌组织中的表达情况及其意义。方法 :采用原位杂交方法对 2 6例肾细胞癌 (RCC)组织中两种基因的表达进行检测。结果 :MT1-MMP和MT5 -MMPmRNA在RCC中的表达明显高于正常组织并且同肿瘤的分期密切相关 ,不同病理组织类型之间的表达无显著差异。结论 :MT1-MMP ,MT5 -MMP在RCC的进展中起到了一定的作用 ,不同病理类型肿瘤组织之间两种基因的表达无显著差异。     

MT蛋奶粉对铅中毒大鼠的排铅作用

目的：观察富含金属硫蛋白（MT）的蛋奶粉对铅中毒大鼠的驱铅效果。 方法：将60只Wistar大鼠随机分为对照组（20只）、空白组（10只）和铅中毒组（30只）。铅中毒组大鼠饮服0.2％醋酸铅水溶液3周造成实验性铅中毒后,再分成铅中毒组（10只）和MT蛋奶粉处理组（20只）。灌服MT蛋奶粉3周后,采集血液、肝脏、肾脏、股骨、脑、粪便及尿液,分别用原子吸收分光光度法测定铅含量。 结果：与对照组大鼠比较,铅中毒组大鼠各组织铅含量均显著升高(P<0.01)。与铅中毒组比较,MT蛋奶粉组大鼠脑铅含量明显降低(P<0.01),肾铅、骨铅含量亦有降低趋势,但肝铅含量显著增加(P<0.01),粪排铅量显著增加(P<0.01),尿排铅量有增加趋势。结论：MT蛋奶粉能不同程度降低组织内铅含量,具有一定的驱铅效果。     

HES1、JAG1、MT2A和MAFA介导茶多酚抑制微卫星不稳定结直肠癌

目的:探讨茶多酚是否能特异性抑制结直肠癌微卫星不稳定及其可能机制。方法:使用茶多酚的水溶液处理LoVo细胞(MSH2基因缺失的结肠癌细胞株)和SW480细胞(错配修复基因正常的结肠癌细胞株),四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖,基因扫描法检测细胞的微卫星序列变化,基因芯片检测茶多酚处理后LoVo细胞基因表达的变化,实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测有变化的基因。结果:茶多酚对LoVo细胞和SW480细胞的抑制率随着药物浓度的增加而增加,随着时间的延长也呈逐渐上升趋势,但茶多酚对LoVo细胞的抑制率高于SW480细胞,在24、72h和1周时间点测得二者抑制率的差异有统计学意义。经过茶多酚处理后,LoVo细胞的微卫星序列有趋于稳定的趋势。基因芯片和实时荧光定量PCR检测结果提示茶多酚能抑制MT2A、MAFA、HES1和JAG1基因的表达,治疗前后基因表达差异均有统计学意义。结肠癌相关基因检查发现,茶多酚能上调BAX和抑制P38基因,治疗前后基因表达差异有统计学意义,但是对于核因子-κB抑制不明显。结论:茶多酚有使LoVo的微卫星状态趋于稳定的趋势,并可抑制MT2...     

大鼠心肌成纤维细胞合成金属硫蛋白

目的 :探讨脂多糖 (lipopolysaccharide ,LPS)、碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor ,bFGF)、氧化型低密度脂蛋白 (oxidizedlow densitylipoproteins ,oxLDL)及重金属物质ZnCl2 等刺激因素对大鼠心肌成纤维细胞金属硫蛋白 (metallothionein ,MT)合成的影响。方法 :用10 9Cd Hb饱和法测定细胞MT含量 ,用RT PCR法测定细胞MTmRNA含量。结果 :本实验中各种处理因素均可刺激心肌成纤维细胞MT含量的增加。 1和5mg·L-1LPS处理组成纤维细胞MT含量与对照组相比分别增加 94 %和 130 % (P <0 .0 1)。 0 .2和 1.0mg·L-1bFGF处理组分别增加 4 1%和 5 9% (P <0 .0 1)。oxLDL亦可以促进心肌成纤维细胞MT的合成 ,2和 10mg·L-1oxLDL组MT含量较对照组分别增加 2 3% (P <0 .0 5 )和 4 1% (P <0 .0 1)。 1,2 ,5mg·L-1ZnCl2 呈浓度依赖性刺激心肌成纤维细胞MT含量的增加 ,与对照组相比分别增加 6 6 %、99%和 14 9% (P <0 .0 1) ,2～ 8mg·L-1ZnCl2 诱导MT1mRNA含量增加 6 9%～ 12 9% (P <0 .0 1) ,MT2mRNA含量增加 31%～ 6 0 % (P <0 .0 1)。但 10mg·L-1ZnCl2 不能进一步增加细胞MT含量 ,仅较对照组增加 91% ,可能与高浓度ZnCl2 致细胞损伤 ,细胞存活率降低有关。结论 :LPS、bFGF、oxLDL、ZnCl2 等多