芯片毛细管电泳检测平台的建立及其应用

目的采用芯片毛细管电泳检测基因点突变,为β-地中海贫血产前基因诊断提供一种快速、灵敏的检测技术。方法通过多重引物延伸反应扩增β-地中海贫血常见的突变位点,并采用芯片毛细管电泳双通道检测扩增产物,以辨别样品的基因型。结果建立了β-地中海贫血常见基因型的芯片毛细管电泳检测方法,对39例β-地中海贫血患者和5例产前诊断病例的检测结果符合试剂盒检测结果。结论芯片毛细管电泳检测β-地中海贫血具有快速、样品量少等优点,为产前遗传病的检测提供了一种新的技术手段。     

毛细管电泳多重PCR诊断杜氏/贝氏进行性肌营养不良

目的用毛细管电泳技术结合多重PCR方法分析DMD基因缺失位点,以建立一种快速、准确、适用于临床的DMD的诊断技术.方法将对缺失热区18对引物分成两套,用毛细管电泳分析7个DMD/BMD家系中的7名患者的二步多重PCR产物.结果毛细管电泳能快速、准确分离18对引物多重PCR产物,判断出DMD基因缺失位点.结论毛细管电泳定量PCR方法能高效、准确、快速诊断缺失型DMD患者,具有很好临床应用价值.     

优化PCR体系结合毛细管电泳技术检测FMR1基因前突变与全突变

目的 通过优化PCR并结合毛细管电泳,建立高扩增效率、高分辨率的FMR1基因CGG重复序列异常扩增检测体系.方法 选择标准样本和经Southern印迹技术确定(CGG)n的正常、前突变、全突变男性和女性样本15例,进行PCR检测体系的优化.优化的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳等多种方法进行结果比较.结果 经优化的PCR体系可以检测出(CGG)n大于260个拷贝的全突变男性和(CGG)n达到183个拷贝的前突变女性.毛细管电泳能够清晰分辨出相差1个CGG的两个等位基因,结果具有良好的可重复性.结论 该PCR检测体系大幅度提高了普通PCR方法的扩增效率和分辨率,明显降低了对于Southern印迹技术的依赖,可以作为临床筛查FMR1基因突变的首选方法.     

基于毛细管电泳的单基因病扩展性携带者筛查技术的建立及临床评估

目的 建立并评估一种基于毛细管电泳技术的单基因病扩展性携带者筛查方法。 方法 采用多个基于毛细管电泳的技术检测 1 099 例样本中 24 个基因相关的 20 种疾病中的 448 个致病变异并进行验证。 结果 毛细管电泳检测结果与其他方法验证的结果完全一致。 在 1 099 例受检者中, 检出 190 例携带者, 总体携带率为17. 3 % (190 / 1 099), 检出变异个数最多的是 GJB2 基因。 在检测的1 075 例女性样本中, 共 检出 8 例为 X 连锁遗传病致病基因的携带者, 携带率为 7. 4 ‰ (8 / 1 075)。 结论 成功建立了一种基于毛 细管电泳的扩展性携带者筛查技术。     

应用毛细管电泳技术进行高效、准确的微卫星位点自动基因组扫描

目的 探索适用于大规模基因组扫描的、真正自动化的微卫星基因分型实验方法。方法 应用多重PCR将多个微卫星位点同时扩增，产物通过MegaBACE毛细管电泳测序仪进行电泳，其结果由Genetic Profiler软件自动分析。观察PCR效率不同时以及PCR体系中盐离子对分型结果的影响。结果 通过1次PCR和电泳能得到96个样品10个位点的分型结果，且自动分型的结果精确、可靠。其基因分型的效率是平板电泳的两倍。结论 应用毛细管电泳和Genetic Profiler自动分析软件进行微卫星基因组扫描效率高，节省了人力，有效地避免了人为差错，适用于基因作图、尤其是多基因疾病的基因定位、法医学及人类进化等研究。     

应用毛细管无胶筛分电泳诊断缺失型杜氏肌营养不良基因

毛细管电泳是一项新兴的分离、分析技术,它以高效、快速、重复性好、自动化及微量等优点,在核酸分离分析的各方面均较以往的方法更具优势。本工作应用毛细管无胶筛分电泳与多重ＰＣＲ技术相结合对缺失型杜氏肌营养不良的病人进行了直接基因诊断。与传统方法相比,本技术在分离速度、分辨率及灵敏度方面均有较大改善。毛细管电泳技术将广泛用于遗传病基因诊断。     

两种不同Y染色体AZF微缺失检测方法比较

目的比较多重聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳检测法(检测15个位点)和实时荧光定量PCR检测法(检测6个位点)检测Y染色体AZF微缺失。方法对575例不育症患者随机选择两种不同检测法进行检测(电泳法检测300例,荧光PCR法检测275例)。结果电泳法检测出AZF微缺率为8.33%(25/300),荧光PCR法检出AZF微缺率为5.82%(16/275);使用电泳法检出1例患者仅缺失AZFb(sy133、sy145),该位点为荧光PCR法不涉及,同时患者染色体核型为46,XY,del(Y)(q11.23)。结论虽然电泳法检出率高于荧光PCR法,同时检测染色体核型可弥补荧光PCR漏检率。     

毛细管电泳分析核酸的方法及应用

毛细管电泳是一门速发展的分离技术。根据分离同制不同,毛细管电泳分离核酸的方法有:胶束电动力学毛细管色谱(MEKC)、毛细管区带电泳(CZE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。毛细管电泳主要用于核酸纯度的鉴定、定量分析、测序,片段大小多态性分析、构象多态性分析和蛋白与核酸相互作用的研究。     

应用多重PCR进行微卫星荧光标记-半自动基因组扫描

目的为适应大规模基因组扫描技术的需要，建立一种以ＴａｑＳｔａｒｔ抗体为酶保护剂、退火温度在一定范围内递降的多重ＰＣＲ体系。方法在５μｌ的总体积内，加５～１５对ＰＣＲ引物，用不同颜色的荧光标记（或相同荧光标记但其扩增片段相差５０ｂｐ以上），多个微卫星位点可同时得到扩增，并可通过ＤＮＡ测序仪进行电泳及数据分析。结果多个微卫星位点在５μｌ的体积内同时得到扩增。电泳条带图象清晰，获得了满意的基因分型结果。结论多重ＰＣＲ反应高产量、低成本，适用于人类基因组计划，尤其是基因作图、基因定位、法医学及人类进化等研究     

新疆地区2718例子宫内膜癌构成及临床病理特征

目的 探讨新疆地区子宫内膜癌(endometrial cancer, EC)的流行病学特点及不同方法检测微卫星稳定性结果存在差异的原因。方法 收集2011～2021年2 718例EC流行病学资料，采用免疫组化EnVision法检测4种错配修复(mismatch repair, MMR)蛋白表达，分析其与临床病理特征的关系；采用多重荧光PCR-毛细管电泳法检测微卫星不稳定(microsatellite instability, MSI)的一致性，分析两种检测结果不一致的原因。结果 2 718例EC好发于51～60岁，11年间患者平均年龄和中位年龄分别下降1.3、3岁；组织学类型以子宫内膜样癌G1级为主，其他类型较少见。MMR蛋白表达总缺失率为24.2%,其中MLH1、MSH2、MSH6和PMS2表达缺失率分别为12.7%、5.5%、6.9%和15.2%;dMMR组与pMMR组在患者年龄、组织学类型、FIGO分期、脉管内瘤栓及淋巴结转移等参数，差异均有统计学意义(P<0.05);MSH2在维吾尔族和哈萨克族中缺失比例最高，MSH6缺失易发生于>50岁(P=0.033)、维吾尔族...     

生熟鲩鱼过敏原粗浸液总蛋白不同毛细管电泳方法的分析

目的 研究毛细管电泳在生熟鲩鱼食品过敏原粗浸液分析中的应用. 方法 未涂层熔硅毛细管65 cm(有效长度50cm)×75 μm;选择醋酸溶液 (pH2.5)和硼酸缓冲液(pH9.5)作为毛细管区带电泳(CZE)的运行缓冲液,另外选择Tri s-H3PO4/SDS缓冲液(pH8.7)作为毛细管束胶电动色谱(MECC)的运行缓冲液,分别对鲩鱼在生熟状态下的总蛋白提取物进行毛细管电泳,并与其十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳进行比较. 结果 三种不同缓冲液的电泳方法均能用于生熟鲩鱼总蛋白的分析,而且Tris-H3PO4/SDS缓冲液 (pH8.7)的效果最好、检测峰最多(生鲩鱼14个,熟鲩鱼13个),接近SDS-PAGE蛋白区带总数(生鲩鱼17条,熟鲩鱼15条).结论 毛细管电泳可以用于生熟鱼类食品过敏原粗浸液的分析.     

特异性免疫磁珠联合毛细管电泳技术检测蛋白质的方法探讨

目的 尿液蛋白的检测在疾病的诊断、监测和疗效评估中发挥着重要作用.目前常用的蛋白检测方法无法检测尿液低浓度蛋白.为了实现对尿液低浓度蛋白的检测,使其应用到临床诊断等方面,本实验室尝试应用特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白.本实选择β-actin单克隆抗体来制备特异性免疫磁珠对该方法进行可行性探讨和方法学研究.方法 将β-actin单克隆抗体以共价偶联的方式包被到羧基磁珠表面,用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭磁珠,获得特异性β-actin免疫磁珠.使用pH 10.0的0.02mol/L硼砂溶液对β-actin免疫磁珠进行洗脱,将洗脱液进行毛细管电泳,验证免疫磁珠是否制备成功.结果 β-actin免疫磁珠洗脱液的毛细管电泳图中可见到β-actin抗体峰和BSA峰,结果表明β-actin抗体与羧基磁珠偶联成功以及BSA封闭羧基磁珠成功.结论 本实验成功的制备了特异性β-actin免疫磁珠,并应用毛细管电泳方法进行相关验证,此实验为特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白奠定了基础.     

多重荧光PCR和Bin/Panel片段分析微卫星不稳定

我们应用ABI3100．Avant型遗传分析仪对54例肿瘤患者和36名正常人进行多片段的多重荧光PCR微卫星不稳定（MSI）检测,单道毛细管同时检测5个颜色长短不同的DNA片段,利用GeneMapper软件分析Bin／Panel片段数据,可提高对MSI诊断的速度。同时我们对影响基因自动分型的一些技术因素进行了分析和改进。     

定量荧光多重PCR快速诊断21-三体

目的 探讨多重定量荧光PCR(QF-PCR)技术在快速诊断21-三体中的应用价值.方法 抽取外周血样本90份,其中21-三体患者22例,经常规染色体核型分析排除21-三体的患者68例,包括智低儿,正常体检者,染色体平衡易位携带者,有流产史的夫妇,其中45,X;45,X/46,X,del(X);46,XX,t(4;13)各1例,47,XXY 3例.应用QF-PCR方法进行多重扩增,毛细管电泳法检测并分析结果.所有样本同时进行染色体核型分析.结果 染色体核型分析中阳性组中有22例21-三体(其中有3例是易位型,46,XX(Y),t(21;21)各1例,46,XX,dup(21)1例,余为标准型);21例显示21-三体电泳图谱,68例阴性对照组全部显示为阴性结果.结论 成功建立了QF-PCR诊断21-三体染色体异常疾病的方法.定量荧光PCR诊断结果与染色体核型诊断结果具有同一性.     

不同长度poly(A)尾对mRNA体外表达的影响及转录模板在大肠埃希菌中的传代稳定性

目的探索不同长度poly(A)尾对mRNA体外表达的影响以及含poly(A)尾转录模板在大肠埃希菌中的传代稳定性。方法设计并构建含38、60、103、125 nt和60 nt+6 nt间隔序列+60 nt(简称126 nt)poly(A)尾的模板质粒, 利用单酶切将其线性化并以此作为转录模板进行体外转录反应制备增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)-mRNA。将含有不同长度poly(A)尾的EGFP-mRNA转染293T细胞, 流式细胞术检测EGFP表达情况。将poly(A)尾长度为125 nt和126 nt的模板质粒分别转化至大肠埃希菌TransStbl3感受态细胞以及Top10感受态细胞中, 各挑取7个单克隆进行培养并提取质粒, 质粒经双酶切后进行毛细管电泳检测。分别从中选取3个测序正确的单克隆于37℃条件下进行连续传代, 每两代提取一次质粒, 双酶切后进行毛细管电泳检测。同时将poly(A)尾长度为125 nt的两组单克隆再分别于30℃条件下进行连续传代, 每两代提取一次质粒并进行双酶切鉴定和毛细管电泳检测。结果成功构...     

用SYBR-Q-PCR结合融解曲线分析及mPCR检测江西籍三种常见的缺失型α-Thal基因

目的 用自动化、高通量、准确快速技术检测江西省缺失型α-Thal基因.方法 用实时荧光定量聚合酶链反应(SYBR-Q-PCR)结合融解曲线(D.C)分析及用单管多重聚合酶链反应(mPCR)技术检测-SEA、-α3.7和-α4.2缺失型α-Thal基因.结果 SYBR-Q-PCR结合融解曲线分析较mPCR结合琼脂糖凝胶电泳法高出16倍以上,用SYBR-Q-PCR结合D.C、mPCR技术检测出--SEA、-α3.7和-α4.2.19例江西籍α-Thal检出-SEA/-α4.2 -SEA/-α3.7 -α3.7/-α3.7 -α4.2/-α4.2 -α3.7/-α4.2.结论 SYBR-Q-PCR和mPCR能简单、省时、经济、准确的检测3种常见α-Thal缺失基因的方法.SYBR-Q-PCR结合融解曲线分析技术是一种高敏感、快速、自动化程度高、高通量,并不需要荧光标记探针.     

常染色体显性小脑性共济失调致病基因动态突变位点三核苷酸重复变异的研究

目的 探讨毛细管电泳技术在动态突变位点检测中的技术问题,并分析常染色体显性小脑性共济失调(autosomal dominant cerebellar ataxias,ADCA)患者与正常对照人群脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia,SCA)1,2,3,6,7亚型的致病基因动态突变位点三核苷酸重复数的分布范围,以期为今后标准化ADCA基因检测技术及中国人群制定相关基因动态突变量化标准提供依据.方法 以263个ADCA家系的先证者及261个无亲缘关系的正常对照为对象,应用荧光PCR-毛细管电泳及DNA测序技术进行上述SCA致病基因内动态突变位点基因分型,统计分析不同对照下各基因动态突变位点毛细管电泳检测重复数与DNA测序结果的差异,以及各基因三核苷酸重复特点及重复次数分布范围.结果 以DNA测序所确定的重复次数为标准,SCA各致病基因动态突变位点的PCR产物在毛细管电泳中,迁移率均大于GC含量相对均衡的分子量内标片段,其中SCA2、6、7亚型基因位点尤为明显.以各基因已知CAG重复数片段为外标计算受检标本CAG重复数,可将误差缩小至±1个拷贝.在各基因CAG正常重复范围内,PCR产物毛细管电泳迁移率主要与CAG拷贝数相关,而与CAG拷贝数变异所致PCR产物GC含量变化的关系不明显.在263个ADCA家系中,发现SCA1家系6个(2.28%),SCA2家系8个(3.04%),SCA3家系81个(30.80%),未发现SCA6和SCA7家系.排除上述突变基因后,正常等位基因重复次数变异范围在SCA1为17～36次,杂合率为76.1%,SCA2为13～30次,杂合率为17.7%,SCA3为14～39次,杂合率为74.4%,SCA6为6～16次,杂合率为72.1%,SCA7为6～13次,杂合率为41.3%.突变等位基因重复次数变化范围在SCA1为49～56次,SCA2为36～41次,SCA3为59～81次.未发现单一位点纯合突变或两位点双重杂合突变患者.结论 通过设置有限数量的已知拷贝数对照,进行荧光PCR-毛细管电泳检测,可以准确地计算出SCA致病基因动态突变位点CAG重复次数.本研究结果支持中国人群中SCA3致病基因突变是导致ADCA的最常见病因.SCA1,2,3,6,7亚型致病基因正常与突变的CAG重复数资料可为中国人ADCA动态突变量化标准的建立提供参考.     

非水毛细管电泳法研究进展

非水毛细管电泳作为毛细管电泳法的重要分支已成为研究热点,近年来被广泛应用。综述了非水溶剂的特性及其分子间的相互作用。总结了非水毛细管电泳法中调节和增强选择性的方法和常用检测方法,以及近年来非水毛细管电泳法应用于生物样本代谢产物及药物等方面的研究进展,并展望了其广泛的应用前景。     

毛细管电泳的最新进展

毛细管电泳是近年发展最快的分离分析技术之一。它具有高灵敏度、高分辨率、高速度等优点 ,广泛应用于各个领域。随着毛细管电泳技术的不断发展 ,逐渐出现了非水毛细管电泳 ,毛细管阵列电泳 ,毛细管电泳免疫分析 ,毛细管电色谱手性拆分等分支     

AllGlo探针4重荧光定量PCR技术同时检测4种疱疹病毒

目的 探讨多重荧光定量PCR技术的优化条件,建立基于AllGlo探针技术荧光定量法检测4种疱疹病毒新方法.方法 分别采用单重和多重定性PCR扩增临床常见4种疱疹病毒[单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、HSV-2、Epstein-Barr病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)]并测序鉴定,然后分别采用AllGlo探针和TaqMan探针的单重和多重定量PCR技术对4种疱疹病毒进行单种和多种病毒同时定性定量检测.结果 TaqMan探针和AllGlo探针单种疱疹病毒检测阳性率和特异性均为100％,AllGlo探针单重定量PCR检测比4重探针单种定量PCR的检测Ct值高1～3,AllGlo探针4重定量PCR可以同时检测4种疱疹病毒,相同样品AllGlo探针4重定量PCR检测与单探针单重定量PCR分别检测的结果符合率100％.结论 AllGlo探针荧光定量PCR技术的通量、灵敏度和特异性均高于TaqMan探针,应用前景广阔.