环7肽库筛选胃癌耐药细胞特异性结合短肽

目的获得与胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR特异结合的抑制耐药短肽,作为提高胃癌化疗效果的先导化合物。方法以SGC7901/VCR细胞为靶细胞,胃粘膜永生化上皮细胞GES,胃癌药敏细胞SGC7901为吸附细胞对噬菌体7肽库进行消减筛选,用细胞ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序,利用竞争抑制试验确定阳性克隆的结合部位是否为外源性肽段。结果经4轮筛选,从随机挑选的30个噬菌体克隆中得到14个能特异性与SGC7901/VCR结合而不与胃癌药敏细胞结合的阳性克隆,确定其氨基酸序列分别为SY1和SY2(筛选所得安基酸序列正在专利申请中),含SY1为阳性克隆。结论用噬菌体环7肽库成功筛选到能特异性结合胃癌耐药细胞株的短肽,为肿瘤治疗或药物靶向治疗奠定基础。     

宫颈癌HeLa细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

背景与目的:宫颈癌的分子靶向治疗具有很好的疗效,同时可以显著减少抗癌药物对人体自身的损伤,因此备受关注。本研究利用噬菌体体内展示技术筛选及鉴定宫颈癌特异性结合肽,将有可能成为化疗药物的靶向载体,为宫颈癌靶向药物治疗奠定基础。方法:体外培养宫颈癌HeLa细胞接种裸鼠,建立肿瘤动物模型。将随机肽库尾静脉注入裸鼠体内,循环15 min,心脏灌注后回收肿瘤组织噬菌体扩增、纯化并以此作为起始物进行第2轮的筛选,如此进行3轮体内筛选后挑取噬菌体克隆,进行免疫组化及ELISA实验,初步鉴定噬菌体克隆对宫颈癌细胞的亲和力及特异性,并将具有强亲和力的克隆进行测序。结果:ELISA结果显示,随机挑选10个噬菌体单克隆中8个克隆对HeLa细胞具有很强的亲和力,将这8个克隆进行测序,获得相同短肽序列LLRSTGF。结论:利用噬菌体展示技术筛选出与宫颈癌细胞HeLa特异性结合的短肽,进一步与化疗药物结合,为宫颈癌靶向治疗提供新的方法。     

胃癌腹膜高转移细胞特异性结合噬菌体多肽的筛选及鉴定

目的寻找能够与胃癌腹膜高转移细胞GC9811-P特异性结合的噬菌体多肽,探索治疗胃癌腹膜转移的新方法。方法运用噬菌体呈现肽技术,先后用胃癌的腹膜高转移细胞系GC9811-P和其亲本细胞GC9811对噬菌体12肽库进行消减性的全细胞淘洗．经过3轮筛选,随机挑选40个噬菌体单克隆C1～G40。用ELISA法选取能够与GC9811-P特异性结合的单克隆。将选出的单克隆分别注入裸鼠腹腔,采用免疫组化法排除与正常组织亦高结合的阳性单克隆。对筛选出的噬菌体克隆进行DNA序列测定,并推导其外源性氨基酸序列,进行同源性分析。结果经过3轮淘洗,噬菌体克隆得到理想富集。C9、C18、C23、C29、C34和C37可与GC9811-P特异性结合,经免疫组化证实,这6个单克隆均不与裸鼠腹腔内正常组织结合。测序结果大致展示了两种外源性多肽,即TLNINRLIIPRT和SMSIxSPYIxxx。结论筛选出6个可与GC9811-P细胞特异性结合的噬菌体多肽;这两个肽序列能否阻断GC9811-P细胞向腹膜转移尚待进一步确定。     

利用体内噬菌体展示技术筛选肝癌组织特异性结合肽

目的 筛选人源肝癌组织特异性结合短肽。方法 体外培养人源肝癌细胞株BEL-7402,建立荷瘤裸鼠模型。尾静脉注射噬菌体12肽文库至荷瘤裸鼠体内,循环20min后回收肿瘤组织中噬菌体,同时取正常对照组织进行噬菌体效价测定和免疫绀化观察。将同收的噬菌体扩增、纯化,并以此作为起始物进行下一轮筛选。经过3轮体内筛选,得到与肝癌组织或细胞特异结合的肽段。随机挑选噬菌体单克隆进行测序,分析序列㈣源性后进行体外细胞酶联免嫂吸附试验（ELISA）和体内回输实验,验证噬菌体克隆的导向性。结果 经过3轮体内筛选,瘤组织中噬菌体的回收率逐步提高,回收量随着输入量的增加迅速增加,而每轮筛选肝组织中的噬菌体回收晕始终保持在一个恒定范围,并不随输入量的增加而增加。免疫组化结果硅示,第3轮筛选后,瘤组织中的噬菌体得到高水平富集,同时其他组织的非特异性结合降至最低,肝癌细胞特异性结合最强的是A54号单克降,A67、B2号单克隆次之。B2的导向效果最好,A54次之。通过对噬菌体单克隆的序列分析,初步确定了PSS／FTT基序。结论 利用体内噬菌体展示技术,可以成功筛选到与肝癌细胞或组织特异结合的噬菌体肽。     

胃癌细胞特异性结合肽的筛选及鉴定

目的 筛选与胃癌细胞特异性结合的多肽。方法 以正常细胞为吸附细胞,胃癌细胞为筛选靶细胞对噬菌体随机12肽库进行消减筛,用细胞酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫细胞和组织化学法及裸鼠正常组织结合实验鉴定阳性克隆并进行DNA测序。结果 经三轮筛选,利用ELISA从随机挑选的24个噬菌体克隆中得到8个与胃癌细胞具有高结合力的噬菌体阳性克隆,经免疫细胞化学及裸鼠正常组织结合试验鉴定,发现第20、24两个克隆能与胃癌细胞特异性结合,而不与正常细胞和裸鼠组织结合,噬菌体阳性克隆氨基酸序列无同源性。结论 得到两个序列不同的特异性结合胃癌细胞的噬菌体克隆,这可为进一步的研究提供实验依据。     

体内噬菌体展示技术筛选人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽及其性质、结合效果研究

目的探讨体内噬菌体展示技术筛选的人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合肽的性质和结合效果,为乳腺癌早期诊断提供分子靶向探针。方法制备人髓样乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型,采用噬菌体环七肽库进行3轮体内筛选。免疫组织化学法检测筛选的噬菌体在肿瘤及正常组织中的分布情况。酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定单克隆噬菌体对Bcap-37细胞的亲合力。提取阳性单克隆噬菌体DNA并测序,选取重复率高的序列合成多肽,制备光学分子探针,应用荧光分子成像验证合成的多肽在荷瘤小鼠体内对乳腺移植瘤的特异性和靶向性。结果第3轮体内筛选的噬菌体回收率为第1轮的107.2倍。免疫组织化学结果显示,随筛选轮次增加,肿瘤组织中结合的噬菌体依次增加;肿瘤组织结合的噬菌体多于正常组织(肺脏、骨骼肌、肝脏、肾脏),肿瘤组织切片扫描图像的吸光度(A)值均较正常组织高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。ELISA结果显示,随机选取的50个单克隆噬菌体中,22个为阳性(亲合力≥2)。阳性单克隆噬菌体DNA测序分析后,得到4条有重复的氨基酸序列,选择重复率最高的氨基酸序列CSPLNTRFC,化学合成异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CSPLNTRFC多肽。Bcap-37细胞荷瘤裸鼠模型体内验证实验显示,FITC-CSPLNTRFC多肽能明显富集在乳腺移植瘤组织。结论利用体内噬菌体展示技术能够筛选出可与人髓样乳腺癌Bcap-37细胞特异性结合的多肽CSPLNTRFC,有助于进行乳腺癌早期诊断的体外研究。     

胃癌耐药细胞特异性结合小肽对多药耐药的影响

目的 研究环九肽（SY1）与胃癌耐药细胞（SGC7901／VCR）的结合特性及其对胃癌耐药性的逆转作用。方法 将细胞分为SGC7901和SGC7901／VCR2组培养。以无关噬菌体、阴性噬菌体为对照组,用免疫荧光技术检测含有SY1的阳性噬菌体与SGC7901／VCR的结合特性;通过体外药敏试验（MTT）分析含有SY1的阳性噬菌体和化学合成的SY1对SGC7901／VCR耐药性的改变;应用流式细胞仪检测在SY1作用下SGC7901／VCR细胞内阿霉素（ADM）的蓄积和储留。结果 （1）免疫荧光分析的结果显示,含有SY1的阳性噬菌体能够结合于SGC7901／VCR的膜表面,而不与亲本细胞SGC7901结合,无关噬菌体和阴性噬菌体均不与SGC7901／VCR结合,表明SY1可与SGC7901／VCR特异性结合。（2）MTT试验结果显示,在含有SY1的阳性噬菌体及化学合成的SY1的作用下,SGC7901／VCR的存活率显著降低（P〈0．05）,其对长春新碱的耐药性降低。（3）在化学合成的SY1作用下,SGC7901／VCR细胞内ADM的储留蓄积高于对照组（P〈0．05）。结论 利用环七肽库差减筛选得到的环九肽SY1不仅能与SGC7901／VCR特异性结合,而且可部分逆转其对长春新碱的耐药性。这可能为胃癌多药耐药的逆转提供新思路。     

胃癌多药耐药逆转短肽GMBP42的活性鉴定

目的:鉴定短肽GMBP42与胃癌多药耐药细胞(SGC7901/VCR和SGC7901/ADR)的结合特异性及其多药耐药逆转活性。方法:体外培养胃癌亲本细胞SGC7901及多药耐药细胞(SGC7901/VCR和SGC7901/ADR)。免疫细胞化学染色技术鉴定短肽GMBP42与多药耐药细胞的结合特异性。体外药物敏感实验测定短肽GMBP42对多药耐药细胞化疗药物敏感性的影响。结果:免疫细胞化学染色结果显示:短肽GMBP42能够与胃癌多药耐药细胞(SGC7901/VCR和SGC7901/ADR)结合,亚细胞定位于核周胞浆及胞膜,而与亲本细胞无明显结合。体外药物敏感试验结果显示:与对照组相比,短肽GMBP42处理组胃癌多药耐药细胞(SGC7901/VCR和SGC7901/ADR)对化疗药物的IC50值及细胞存活率均降低(P<0.05)。结论:短肽GMBP42能特异结合于多种胃癌多药耐药细胞,短肽GMBP42可提高胃癌多药耐药细胞对阿霉素的敏感性,部分逆转多药耐药细胞对阿霉素的耐药表型。     

胃癌多药耐药逆转短肽GMBP42的活性鉴定

目的：鉴定短肽GMBP42与胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）的结合特异性及其多药耐药逆转活性。方法：体外培养胃癌亲本细胞SGC7901及多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）。免疫细胞化学染色技术鉴定短肽GMBP42与多药耐药细胞的结合特异性。体外药物敏感实验测定短肽GMBP42对多药耐药细胞化疗药物敏感性的影响。结果：免疫细胞化学染色结果显示：短肽GMBP42能够与胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）结合,亚细胞定位于核周胞浆及胞膜,而与亲本细胞无明显结合。体外药物敏感试验结果显示：与对照组相比,短肽GMBP42处理组胃癌多药耐药细胞（SGC7901/VCR和SGC7901/ADR）对化疗药物的IC50值及细胞存活率均降低（P〈0.05）。结论：短肽GMBP42能特异结合于多种胃癌多药耐药细胞,短肽GMBP42可提高胃癌多药耐药细胞对阿霉素的敏感性,部分逆转多药耐药细胞对阿霉素的耐药表型。     

胃癌干样细胞向内皮细胞分化的研究

目的:研究胃癌肿瘤干样细胞(cancer stem like cells,CSLC)向内皮细胞的分化,以期发现抗肿瘤血管治疗新靶点,并降低抗血管靶向治疗的耐药性。方法:用长春新碱(VCR)筛选胃癌低分化腺癌SGC7901细胞系,加生长因子无血清培养的方法诱导胃癌CSLC,并对其在血管内皮细胞生长因子(VEGF)的刺激下向内皮细胞分化的生物学行为进行观察。结果:成功诱导绿色荧光蛋白(GFP)标记的胃癌CSLC。Western blot、immunofluorescence检测证实:内皮细胞的分子标记物CD31,CD34在经血管内皮细胞生长因子刺激后的CS-LC中呈阳性表达。成管实验结果显示CSLC在内皮环境中培养后较SGC7901细胞和无刺激的CSLC具有明显的成管能力。SGC7901和CSLC分别裸鼠皮下成瘤后,移植瘤免疫组化分析检测证实,肿瘤干样细胞移植瘤的组织切片用人源性血管内皮标志CD31、CD34抗体行免疫组化染色,可明确观察到人源性微血管形成。结论:胃癌CSLC具有向内皮分化的潜能;裸鼠移植瘤中含有人源性内皮细胞,提示胃癌CSLC可能参与胃癌肿瘤血管生成过程。     

胃癌细胞uPA表达与腹膜种植潜能的相关性研究

目的探讨不同胃癌细胞系尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子(uPA)的表达及其与腹膜种植能力的关系。方法采用半定量RT-PCR、Western blot和ELISA方法,比较不同胃癌细胞系(AGS、SGC7901、MKN45和MKN28)uPA表达和uPA活性的差异。将胃癌细胞直接注入裸鼠腹腔,建立腹膜种植模型,通过观察裸鼠生存时间等方法,比较不同胃癌细胞系的腹膜种植潜能。结果uPA表达以SGC7901细胞最高,uPA活性以MKN45细胞最高,AGS细胞uPA表达和活性均最低。AGS未发生腹膜种植肿瘤;SGC7901和MKN45均出现大小不等的腹膜种植肿瘤;MKN28出现伴有血性腹水且大小相似的腹膜种植肿瘤;但MKN45最早形成腹膜种植肿瘤,并且该组裸鼠的生存时间最短。结论各株胃癌细胞的uPA表达在转录和翻译水平相一致,但uPA的表达量和uPA活性大小有明显差异,并且这二者与腹膜种植能力呈正相关。     

Claudin-1蛋白在胃癌组织和细胞中的表达及促进其表达后对癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的:研究紧密连接跨膜蛋白(Claudin-1)在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞生物学行为及裸鼠皮下成瘤能力的影响。方法:收集50例胃癌患者的癌组织及其癌旁组织,采用RT-qPCR和免疫组化检测Claudin-1的表达;RT-qPCR和Western Blot检测Claudin-1在人胃癌细胞株MKN45、SGC7901、MKN28及正常人永生化胃上皮细胞GES-1中的表达水平;通过慢病毒转染技术在人胃癌细胞株SGC7901中过表达Claudin-1,细胞分为Control组(未转染)、NC组(转染慢病毒载体)和Claudin-1组(转染Claudin-1过表达慢病毒);分别采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、Transwell实验和划痕实验检测胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力;采用Western Blot和免疫荧光实验检测Claudin-1对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)的表达变化影响;10只4周龄雄性BALB/c裸鼠皮下注射Claudin-1过表达慢病毒处理的SGC7901细胞构建移植瘤模型,研究过表达Claudin-1对皮下移植瘤的影响;Kaplan-Meier网站在线分析Claudin-1对胃癌患者预后的影响。结果:免疫组化结果显示Claudin-1在胃癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.05);过表达Claudin-1能够显著抑制SGC7901细胞的增殖、侵袭和迁移能力(P<0.05),同时增加E-cadherin的表达,降低N-cadherin的表达。裸鼠移植瘤模型内过表达Claudin-1能够明显抑制皮下移植瘤的生长(P<0.05)。Claudin-1高表达患者生存时间高于Claudin-1低表达患者。结论:Claudin-1在胃癌组织中低表达,过表达Claudin-1抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及EMT过程并抑制裸鼠皮下成瘤的能力,且Claudin-1高表达促进患者良好预后。     

人血管生成素-1基因转染对胃癌细胞体内致瘤力及血管生成的影响

目的　研究人血管生成素 1 (Ang1 )基因转染人胃癌细胞系SGC790 1后 ,对肿瘤细胞生物学特性以及对小鼠体内致瘤力和血管生成的影响 ,探讨其在胃癌发生及血管生成中的作用。方法构建重组正、反义Ang1真核表达载体 ,采用脂质体转染法 ,将重组载体转染人胃癌细胞系SGC790 1 ,分别得到正、反义载体稳定转染的细胞株 7Ang1 +和 7Ang1 - ,并以半定量PCR及Westernblot方法鉴定转染效果。以MTT比色试验绘制生长曲线 ;以流式细胞仪检测细胞周期分布。通过裸鼠成瘤实验 ,比较转染前后小鼠体内成瘤能力的差别 ,并检测肿瘤组织微血管密度 (MVD) ,判定血管生成程度。结果　 7Ang1 -组细胞Ang1在蛋白及mRNA水平的表达均下调。体内成瘤实验结果显示 ,空载体对照组、7Ang1 +组和 7Ang1 -组瘤体的平均重量 ( x±s)分别为 6 2 4 .0 0± 77.78,6 5 2 .6 7± 1 32 .0 7和2 93.0 0± 95 .5 4 ,7Ang1 -组的细胞成瘤性显著低于 7Ang1 +组和空载体对照组 (P <0 .0 1 )。空载体对照组、7Ang1 +组和 7Ang1 -组肿瘤组织的MVD( x±s)分别为 8.4 4± 1 .33,8.78± 1 .92和 6 .0 0± 1 .73,7Ang1 -组细胞的血管生成显著减少 (P <0 .0 1 )。结论　Ang1在胃癌形成和发展中可能通过诱生血管起促进作用 ,通过反义技术可部分阻断这种作用。     

融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效果

观察融合穿膜肽的HSP70基因联合CIK细胞对裸鼠胃癌移植瘤的治疗效应。方法：采用编码11个精氨酸（11R）的穿膜肽序列融合HSP70基因序列,构建重组腺病毒载体AdCMV-HSP70s、AdCMV-HSP70（无穿膜肽对照）和AdCMV-EGFV（空载体对照）。Western blotting、ELISA法检测重组腺病毒介导的HSP70基因在胃癌SCG-7901细胞中的表达,MTT检测重组腺病毒感染后HSP70分泌性表达对胃癌细胞的抑制作用。裸鼠移植瘤模型的抗瘤实验检测HSP70基因联合CIK细胞对胃癌移植瘤的抗瘤效应。结果：与AdCMV-HSP70感染细胞比,AdCMV-HSP70s感染细胞的HSP70表达量明显增加[胃癌SGC-7901细胞：（360.72±20.89） vs（121.01±15.94）ng/ml,P<0.05 ;胃黏膜上皮GES-1细胞：（188.62±10.82） vs（135.00±13.96） ng/ml,P<0.05]。融合11R的HSP70蛋白能够穿膜并分泌到细胞外后对胃癌细胞产生一定的增殖抑制作用[MOI=100 pfu/cell时,细胞存活率（66.33±4.33）% vs（101.33±7.64）%,P<0.01]。AdCMV-HSP70s+CIK联合治疗对胃癌移植瘤的抑制率显著高于AdCMV-HSP70+CIK组[（66.5±7.3)% vs (43.6±5.6)%, P<0.05],该组移植瘤组织间质中CD3+T细胞浸润数量也明显多于后者。结论：融合穿膜肽可明显促进HSP70蛋白的表达和分泌,和CIK细胞联合治疗能增强抗瘤免疫效应,从而显著抑制裸鼠胃癌移植瘤。     

人类胃癌裸鼠原位移植模型的建立

 目的：探讨建立人胃癌裸鼠原位移植转移模型简便易行的方法，比较三种方法的成瘤率。方法：用人胃癌细胞SGC7901悬液接种于裸鼠皮下，形成稳定传代的皮下移植瘤，连续传八代。15只裸鼠随机分为三组，以第八代裸鼠皮下移植瘤组织为移植材料，分别用困扎法、医用OB胶法以及两种联合的方法把皮下肿瘤组织移植裸鼠胃浆膜下形成原位移植肿瘤。结果：6～7周后，处死全部裸鼠，捆扎组、医用OB胶组和联合组成瘤率分别为4／5、3／5和5／5，捆扎联合医用OB组成瘤率最高。结论：应用缝线困扎联合OB胶建立人胃癌裸鼠原位移植模型是一种简便易行的方法，值得推广和应用。     

羟基磷灰石纳米粒子抑制胃癌细胞生长的体内外实验研究

目的：观察羟基磷灰石纳米粒子（Hydroxyapatite nanoparticles,Nano—HAP）对胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MKN-28体外生长的影响及其对SGC-7901细胞皮下移植瘤裸鼠的抗瘤作用和药物毒性。方法：以不同浓度的Nano—HAP分别作用三种胃癌细胞48小时,MTT法检测其对胃癌细胞增殖的影响;以细胞划痕实验、黏附测定观察Nano—HAP对胃癌细胞侵袭力的影响;建立SGC-7901细胞皮下移植瘤裸鼠模型30只,随机分为对照组、Nano—HAP组和5-Fu组,观察每组移植瘤生长情况。结果：Nano—HAP可明显抑制胃癌细胞的增殖和生长,且呈剂量效应关系,并能降低胃癌细胞的体外侵袭和运动能力（P〈0．05）;同时可显著抑制SGC-7901细胞皮下移植瘤的生长,Nano—HAP组肿瘤体积明显小于对照组（P〈0．05）,肿瘤生长抑制率达47．96％;5-Fu组抑瘤率达54．30％,但表现出明显不良反应。结论：Nano—HAP在体外和体内均可显著抑制胃癌细胞生长,并降低胃癌细胞体外侵袭和运动能力。