人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

hTERT基因片段真核表达质粒载体的构建

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的基因表达载体,为人们建立永生化的细胞系提供材料,为临床细胞移植的实验研究和疾病治疗奠定实验基础.方法 根据hTERT全长cDNA序列设计引物进行PCR扩增,扩增用的模板是人胎脑cDNA文库,PCR扩增产物与pGEM-T载体连接后进行测序鉴定.结果 PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功.产物测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.87%,氨基酸序列的同源性为99.67%.结论 成功构建了hTERT真核表达质粒.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

正反义人Tankyrase基因真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人Tankyrase正义和反义真核表达载体．方法：用EcoRⅠ从TT20质粒上切下约3．44kb的Tankyrase cDNA片段，然后连入pcDNA3．1／Zeo的EcoR Ⅰ酶切位点上，经BamH Ⅰ酶切鉴定出正义和反义表达载体．结果：经BamH Ⅰ酶切后，正义质粒形成5．0 3．4kb两条带，而反义重组质粒为8．2 0．2kb两条带，与理论计算值完全一致．结论：成功构建了人Tankyrase的正、反义真核表达载体。     

βhCG-CTP/pcDNA3重组真核表达载体的构建及表达

目的克隆并表达βhCG-CTP基因片端,探讨采用βhCG-CTP基因片段免疫小鼠进行免疫避孕的可能性.方法采用化学合成法得到含有βhCG-CTP基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,然后转化大肠杆菌DH5α,利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒表达载体转染到COS-7细胞,免疫组化法检测βhCG-CTP基因在哺乳动物细胞中的表达情况.结果重组质粒经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切和测序证实插入序列与预期设计完全一致;利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒表达载体导入COS-7细胞,获得了βhCG-CTP的瞬时表达.结论成功构建了βhCG-CTP真核表达载体pcDNA3/βhCG-CTP,该载体能在哺乳动物细胞中正确表达,表达产物βhCG-CTP能够被抗βhCG抗体所识别.     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体转染骨髓间充质干细胞的表达

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)真核表达载体转染骨髓间充质干细胞(MSCs)后的表达情况。方法：应用脂质体介导的基因转移技术将bFGF真核表达载体导入MSCs,用抗药性标志选择方法筛选出阳性克隆后,用免疫细胞化学检测bFGF表达分泌情况。结果与结论：经转染bFGF真核表达载体的MSCs细胞呈阳性,说明经转染的MSCs表达并分泌bFGF蛋白。MSCs有望成为bFGF基因治疗中枢神经系统疾病的理想载体。     

人血栓调节蛋白基因真核表达质粒的构建

目的：构建人血栓调节蛋白(human thrombomodulin，hTM)基因的真核表达质粒，为研究hTM在抗血栓、抗炎症、抗血管增生等方面的作用及其临床应用奠定基础。方法：用PCR法扩增出hTMcDNA表达片段。把载体质粒pcDNA3．1( )／neo和hTM片段用EcoRⅠ HindⅢ双酶切，T4DNA连接酶进行连接。结果：重组质粒在大肠杆菌菌株DH5α内扩增。提取、纯化后用HindⅢ、EcoRⅠ酶切鉴定及测序鉴定证明hTMcDNA表达片段已被完整、正确的插入到pcDNA3．1( )／neo质粒中。结论：成功构建了hTM基因的真核表达质粒pcDNA-hTM。     

人P^15基因真核表达重组体的构建和鉴定

将含人p15 cDNA质粒pBS-SK-pl5以EcoRI和XhoI进行双酶切，再与真核表达载体pCRTM3经相同酶切点连接，转化感受态细菌，筛选，鉴定得到可在真棱细胞中表达人p15基因的重组质粒pCR-hpl5。     

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建四环素诱导性人肝细胞生长因子（HGF）真核表达载体。方法 运用基因重组技术,将人HGF cDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluⅠ和SalⅠ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果 重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论 本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。     

小鼠内皮抑素基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠内皮抑素（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）ｃＤＮＡ的真核表达载体并将其在体外培养的脑胶质瘤细胞内表达。方法 将带有分泌信号的小鼠ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎｃＤＮＡ克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＣＭＶ启动子控制的载体ｐｃＤＮＡ－ｓＥｎｄｏ,并将上述载体转染体外培养的脑胶质瘤细胞（ＳＨＧ４４）,采用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定其表达,应艇牛微血管内皮细胞抑制实验检测其活性,结果 成功地构建了真核表达     

pcDNA3.1-hTERT真核表达载体的构建及其抗肿瘤效应

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)真核表达载体pcDNA3.1-hTERT,并观察其对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应.方法:用RT-PCR方法扩增出带有Hind Ⅲ, BamHⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,酶切获得目的片段,与pcDNA3.1载体连接,构建pcDNA3.1-hTERT表达载体.将真核表达载体pcDNA3.1-hTERT注射移植性H22肝癌模型C57BL/6小鼠,并设PBS组及转染空质粒pcDNA3.1组,观察3组的抗肿瘤效应.结果与结论:成功构建pcDNA3.1-hTERT真核表达载体.该载体中的hTERT基因片段全长为951 bp,可编码相对分子量为37 000、由317个氨基酸构成的多肽.该基因片段与GenBank公布的相应基因进行同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,编码产物的氨基酸序列的同源性为99.68%.该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pcDNA3.1-hTERT组肿瘤生长受到抑制,且该组生存期分别长于PBS组及pcDNA3.1组 (P<0.05);pcDNA3.1- hTERT组的IL-2、IFN-γ细胞因子水平也均高于PBS组与pcDNA3.1组(P<0.05).提示该真核表达载体在受试动物体内可有效地诱导特异性抗肿瘤免疫应答.     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肝癌细胞转染

目的构建正义和反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肝癌细胞株MHCC97-L及高转移细胞株MHCC97-H和HCCLM6.方法采用基因重组技术,用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肝癌细胞株MHCC97-L,反义真核表达载体转入人高转移肝癌细胞株MHCC97-H和HCCLM6,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3kb和1.7kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5kb和O.5kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的肝癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肝癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肝癌细胞的转移能力的影响奠定了基础.     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：构建人血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGF-C)基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF-C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF-C的cDNA序列，设计合成一对5′端分别含有EcoR I和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人乳腺癌细胞MDA-MB-231中的VEGF-C cDNA(1．26Kb；回收PCR产物(1．28Kb），并将其连接至克隆载体pMDl8-T中；重组的pMDl8-T在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF-C cDNA全长的酶切片断(1．27Kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1(-)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT-PCR产物合有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pMDl8-T中含有正确的人VEGF-C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1（-)中含有人VEGF-C cDNA全长序列。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体VEGF-C／pcDNA3．1（-)。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达

【目的】构建以β-淀粉样蛋白为靶单价及二价真核表达载体pcDNA3．1-Aβ1-42、pcDNA3．1-AB42x，并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】PCR法扩增编码B一淀粉样蛋白的目的基因，利用基因克隆技术构建单价及二价真核表达载体；应用酶切及测序鉴定真核表达载体构建成功后，用Western blot和细胞免疫组化染色检测其在真核细胞中的表达。【结果】相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段（分别为137bp和269bp），测序未发现突变；Western blot结果可见两条约为4ku和8ku的条带，细胞免疫组化染色可见阳性细胞。【结论】单价及二价真核表达载体构建成功；真核表达载体能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

人白细胞介素12双亚基共表达真核载体的构建

目的：为满足基因治疗的需要构建人白细胞介素12(hIL－12)双亚基共表达质粒。方法：先从人胚肾组织的逆转录产物中用PCR方法扩增出它的两个亚基P40和P35的cDNA全长，分别克隆入真核表达载体pcDNA3．1( ／-)中构建单亚基质粒——P( )／P40和P(-)／P35，然后再将二者串联克隆入真核表达载体poDNA3．1( )中得到P( )／IL-12质粒。脂质体转染HepG2后24，48h ELISA检测细胞培养上清内hIL-12蛋白质表达。结果：P( )／IL-12质粒经酶切和测序证明两亚基连接方向正确，序列无突变；ELISA检测细胞上清结果证实可表达hIL-12蛋白质。结论：成功构建P40和P35双亚基真核共表达质粒——P( )／IL-12，为模拟hIL-12生理表达方式，简化hIL-12基因治疗操作奠定了基础。     

人hTRT正反义真核表达载体的构建及初步鉴定

目的 构建人端粒酶蛋白催化亚单位（ｈＴＲＴ）正、反义真核表达载体。方法 采用分子克隆技术将ｈＴＲＴ ｃＤＮＡ正向及反向克隆到真核表达载体ｐｃｌ－ｎｅｏ中。结果 Ｎｏｔ Ⅰ酶切后,正义重组基因为８．８ｋｂ一条带,反义重组基因为３．４ｋｂ和５．４ｋｂ二条带,与理论计算相符。结论 成功构建了ｈＴＲＴ正反义真核表达载体。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。