40001/间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学研究

背景：大块软骨损伤目前临床上尚无方法治疗,干细胞技术出现后为解决这一难题提供了理论支持。采用新型的支架材料“壳聚糖-胶原蛋白”结合干细胞诱导分化移植给动物模型是一种较新的尝试。 目的：观察壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用软骨诱导分化培养基对P2代细胞进行成软骨诱导。同时制备“壳聚糖-胶原蛋白”支架和兔关节软骨缺损模型。缺损用含有骨髓间充质干细胞的壳聚糖-胶原凝胶填充,另一条关节用没有细胞的支架或不做处理。其中12个关节作为实验组(接受骨髓间充质干细胞+支架),8个关节作为空白对照组(不做处理),8个关节作为单纯支架组(未植入细胞)。造模后于2,4,8,16周进行组织学评分并处死动物行组织学染色。 结果与结论：造模后16周移植的细胞一致分化为软骨细胞,大部分软骨缺损区被新生软骨修复,组织学评分实验组关节修复良好。提示应用骨髓间充质干细胞结合“壳聚糖-胶原蛋白”复合物可以修复关节软骨缺损。 关键词：壳聚糖-胶原凝胶;兔;骨髓间充质干细胞;软骨缺损;组织学变化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.006     

动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

摘要 背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。 目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。 方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05)。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。 关键词：动物源性;支架;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;修复;缺损 中国组织工程研究与临床康复, 2011,15 (12): 2265-2269.     

自体骨膜复合骨髓间充质干细胞移植修复兔关节软骨缺损

背景：自体骨髓间充质干细胞及骨膜移植等方法可促进关节软骨缺损的修复,但其各自的成软骨能力有限,治疗效果欠佳。 目的：观察自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植修复软骨缺损的疗效。 设计、时间及地点：随机分组对照动物实验,于2005-08/2007-03在山西医科大学第二医院骨科实验室完成。 材料：6~8月龄新西兰白兔18只,按随机数字表法分为3组,即骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组及空白对照组,每组6只12个膝关节标本。 方法：骨膜复合骨髓间充质干细胞组采用胰酶消化法采集骨髓间充质干细胞进行贴壁培养,加入转化生长因子β1向软骨细胞进行诱导分化,同时进行PKH-26细胞膜免疫荧光标记。在全部兔双侧股骨内侧髁造成直径3 mm,深度3 mm的全层软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组、单纯骨膜组取同侧胫骨上段内侧骨膜,骨膜生发层朝向骨髓腔覆盖软骨缺损,骨膜复合骨髓间充质干细胞组先期缝合3针,向缺损区注入1×109 L-1骨髓间充质干细胞细胞悬液20 μL,植入细胞后缝合最后1针。单纯骨膜组只进行单纯骨膜覆盖缺损处理;空白对照组只钻孔不作任何处理。 主要观察指标：术后6,12周时,对缺损部位进行大体观察、组织学观察、Wakitani评分以及Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交检测。 结果：所有缝合骨膜未发现脱落,骨膜复合骨髓间充质干细胞组6周时,软骨缺损已由透明软骨样修复组织填充,12周时修复组织进一步改建,且修复组织中细胞主要为带有PKH-26荧光标记的植入细胞。单纯骨膜组缺损区修复组织为乳白色,表面光滑稍微凹陷,与周围正常软骨组织之间界限清晰;空白对照组缺损区多数比较凹陷,或缺损部位形状不规则,周围软骨组织断裂。术后6,12周时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组Wakitani组织学评分均优于单纯骨膜组和空白对照组(P < 0.05),单纯骨膜组的评分优于空白对照组(P < 0.05)。 同时,骨膜复合骨髓间充质干细胞组修复组织内细胞周围基质Ⅱ型胶原免疫组化及原位杂交染色阳性,证实修复组织内的细胞为植入细胞。 结论：自体骨膜复合向软骨细胞诱导的骨髓间充质干细胞移植可形成透明软骨样修复组织修复关节软骨缺损。     

重组增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体示踪转染的脐血间充质干细胞移植治疗兔股骨头缺血性坏死

背景：目前国内外已有关于人脐血间充质干细胞移植修复鼠脊髓损伤、脑肿瘤、心肌梗死等的报道,将其在特定的条件下向成骨细胞诱导分化的研究也已有报道,但尚未有将脐血间充质干细胞移植治疗动物骨坏死的研究报道。 目的：观察重组增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体示踪转染的脐血间充质干细胞移植修复兔股骨头缺血性坏死的效果。 方法：含骨形态发生蛋白2基因质粒与携带重组增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体与脐血间充质干细胞共培养;制作兔股骨头缺损模型,随机分为3组,正常组未作任何处理,对照组骨缺损未进行填充;实验组骨缺损填充重组增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体示踪转染的脐血间充质干细胞;分别于治疗4周和8周时股骨头行影像学和组织学观察。 结果与结论：影像学和组织学检查显示实验组治疗4周时即有明显的成骨反应和新骨形成,8周时基本修复股骨头的骨缺损区;对照组治疗4周时骨缺损为纤维结缔组织填充,8周时股骨头缺损周边骨质硬化,骨缺损处充填纤维结缔组织,股骨头骨小梁紊乱。结果显示重组增强型绿色荧光蛋白慢病毒载体示踪转染的脐血间充质干细胞有较强的诱导成骨作用,可以成功的修复股骨头缺损性坏死。     

多孔丝素蛋白/羟基磷灰石复合脂肪间充质干细胞修复兔关节软骨及软骨下骨缺损

背景：丝素蛋白/羟基磷灰石是细胞立体培养的良好支架,是临床常用的骨缺损修复材料,具有良好的生物相容性。脂肪干细胞具有向骨及软骨细胞分化的潜能,适合骨软骨缺损修复。 目的：观察转化生长因子β1和胰岛素样生长因子1联合成软骨诱导脂肪干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石复合后修复兔关节软骨及软骨下骨缺损的效果。 方法：取新西兰大白兔56只,2只用于传代培养脂肪间充质干细胞,以3×109 L-1浓度接种到丝素蛋白/羟基磷灰石。其余54只新西兰大白兔,在股骨髁间制备软骨缺损模型,随机分为细胞复合材料组、单纯材料组和空白对照组,细胞复合材料组植入复合脂肪间充质干细胞的丝素蛋白/羟基磷灰石;单纯材料组植入丝素蛋白/羟基磷灰石;空白对照组不作任何植入。从大体、影像学、组织学观察比较缺损的修复情况。 结果与结论：12周时大体观察、CT、磁共振和组织学检查细胞材料复合组软骨及软骨下骨缺损区完全被软骨组织修复,修复组织与周围软骨色泽相近,支架材料基本吸收,未见明显退变和白细胞浸润,所有标本均未见丝素蛋白残留。单纯材料组缺损区缩小、部分修复,且呈纤维软骨样修复。空白对照组缺损无明显修复。提示复合脂肪间充质干细胞的丝素蛋白/羟基磷灰石修复兔关节软骨及软骨下骨缺损能力优于单纯丝素蛋白/羟基磷灰石材料。丝素蛋白/羟基磷灰石复合脂肪间充质干细胞可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,重建关节的解剖结构和功能,可作为新型骨软骨组织工程支架。     

独活寄生汤结合骨髓基质干细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损☆

背景：实验表明,骨髓基质干细胞复合脱细胞真皮基质能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量。 目的：进一步验证独活寄生汤对骨髓基质干细胞复合体修复兔关节软骨缺损的影响,评价修复效果。 方法：取兔骨髓基质干细胞进行体外增殖后,复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上,植入到兔膝关节软骨缺损,并以中药独活寄生汤灌胃为独活寄生汤+干细胞组,并设立独活寄生汤组、单纯复合体组、空白组为对照组。于4,8,12周后分别对修复组织进行形态学观察及组织学检查。 结果与结论：术后12周, 独活寄生汤+干细胞组的缺损由透明软骨样组织充填,软骨及软骨下骨组织基本修复,修复的软骨组织在组织形态学上优于其他各组。结果证实,骨髓基质干细胞复合体能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量。     

生物玻璃活性陶瓷复合人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓间充质干细胞

摘要 背景：目前已有将体外培养的骨髓来源间充质细胞与支架复合后修复骨缺损的临床报道,但是由于该类复合材料中缺乏骨生长因子作用,其原位的成骨作用并不十分理想。 目的：观察人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合材料在修复兔颅骨缺损中的原位成骨作用。 方法：复苏冻存的人骨形态发生蛋白2基因修饰的骨髓间充质干细胞,与生物活性玻璃陶瓷复合培养获得人工植骨材料;制备兔双侧颅骨全层骨缺损模型,实验组将人工植骨材料植入骨缺损区,并设置空白质粒转染的骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、骨髓间充质干细胞+生物活性玻璃陶瓷、空白组作对照,术后第4,8,12周对植骨区进行大体观察、X射线摄片、组织化学检测和生物化学检测。 结果与结论：转染人骨形态发生蛋白2 的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养的人工植骨材料植入后第4周,骨缺损外周骨质与复合材料之间大部分被高密度阴影充填;第12周,完全被高密度阴影充填;第8周,骨小梁大部分相连成片;第12周,骨小梁粗大,骨髓再生。生物化学检测结果与组织化学检测结果一致,并且成骨效果及成骨活性明显优于对照组。说明携带人骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合构成的人工植骨材料基本符合骨组织工程学的要求,在骨缺损区原位具有良好的成骨作用。 关键词：骨髓间充质干细胞;基因转染;生物活性玻璃陶瓷;骨缺损;移植;兔;生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.005     

骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨

背景：骨髓间充质干细胞在不同诱导条件下具有向中胚层组织细胞如成骨细胞、成软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等分化的能力。 目的：验证用组织工程方法诱导分化骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨损伤的效果。 设计、时间及地点：随机对照动物实验,于2005-05-03/2007-12-30在沈阳医学院临床中心实验室完成。 材料：20只两三月龄的健康新西兰白兔,雌雄不限。 方法：①诱导分化体外培养的兔骨髓间充质干细胞。实验组加入地塞米松、碱性成纤维细胞生长因子、维生素C培养1周,再将转化生长因子β替换碱性成纤维细胞生长因子培养3周;以不加诱导剂细胞做对照。②取20只兔,建立膝关节软骨缺损模型,随机分为3组。实验组10只膝关节内植入经诱导的骨髓间充质干细胞;对照组植入未经诱导的骨髓间充质干细胞;空白对照组植入生理盐水。分别于术后2,4,6,8周时处死实验组处死2只,对照组和空白对照组各处死1只进行各项指标检测。 主要观察指标：①细胞形态学。②碱性磷酸酶活性的测定。③大体标本观察。④X射线观察。⑤组织切片观察。 结果：①经诱导的骨髓间充质干细胞,细胞形态发生明显变化,逐渐由长梭形变为多角形,类似于软骨细胞样形态。②骨髓间充质干细胞经诱导4周后,其碱性磷酸酶活性明显增强(P < 0.05)。③术后8周,实验组标本修复组织表面光滑,与周围软骨间界限模糊不清;X射线表现为关节间隙变宽,软骨下骨质囊变得到改善;组织切片观察显示与正常软骨细胞基本上一致。 结论：自体间充质干细胞移植可修复关节软骨损伤。     

结合有TGF—β1的肝素化胶原／壳聚糖支架复合脂肪干细胞修复兔关节软骨缺损的研究

目的】探索结合有TGF—β1的肝素化胶原／壳聚糖支架与脂肪干细胞进行兔软骨缺损的修复的可行性。【方法】取兔的脂肪间充质干细胞，行体外扩增培养至第3代，达到一定数量后接种于结合有TGF—β1的肝素化胶原／壳聚糖支架上，2天后置于兔膝全层软骨缺损区。于12周取材，从大体和组织学方面观察软骨修复情况，并进行统计学分析。【结果】实验组缺损区大部分被修复，缺损区被软骨组织充填，组织学检查提示形成典型的透明样软骨结构。而对照组未见明显软骨修复。【结论】结合有TGF—β1的肝素化胶原／壳聚糖支架与脂肪干细胞复合能较好修复软骨缺损。     

丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合骨髓间充质干细胞构建组织工程化软骨

背景：随着组织工程的兴起,软骨损伤的修复可能性显著地提高,但单一的支架材料均不能符合理想支架,有一定的局限性。 目的：观察骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石构建组织工程化软骨的可行性。 方法：体外分离培养骨髓间充质干细胞,并定向诱导成软骨细胞,与丝素蛋白/羟基磷灰石复合培养,构建膝关节胫骨平台全层关节软骨缺损。54只大白兔单侧膝关节全层软骨缺损模型后随机抽签法分为3组,复合组植入细胞-丝素蛋白/羟基磷灰石复合物;材料组植入单纯丝素蛋白/羟基磷灰石,对照组不行任何植入。植入后8,12周CT检查及组织学检查观察软骨缺损修复情况。 结果与结论：植入后8周,复合组关节面不平整,关节间隙增大,形成新生类软骨细胞,基质丰富。材料组关节面塌陷,软骨细胞少量增殖。植入后12周,复合组关节面平整,关节间隙如常。大量软骨细胞出现,与周边软骨色泽一样,支架材料完全降解。材料组关节面不平整,软骨细胞不完全充填,支架材料部分降解。对照组未见修复。提示用骨髓间充质干细胞复合丝素蛋白/羟基磷灰石可形成透明软骨修复动物膝关节全层软骨缺损,显示了丝素蛋白/羟基磷灰石材料作为关节软骨组织工程支架材料的良好生物相容性。     

点种法移植软骨细胞修复关节软骨缺损

背景：生物性的重建虽能达到修复缺损,重建关节面的目的,但功能上难以与正常软骨一致。应用可降解的聚合物把移植的软骨细胞包埋起来进行移植,可能获得真正意义上的透明软骨。 目的：观察以同种异体兔软骨细胞胶原包埋后,点种法移植软骨细胞修复关节软骨缺损的效果。 方法：新西兰纯种兔制备膝关节全层软骨缺损后分为3组：分别进行胶原包埋软骨细胞点种法移植、单纯软骨细胞点种法移植和仅在大面积软骨缺损的软骨下钻孔。 结果与结论：术后2,4,12,24周观察组织学动态变化,发现胶原包埋软骨细胞点种法移植组能获得透明软骨修复,而软骨细胞点种法组和单纯软骨下骨钻孔组缺损区仅为纤维组织填充,并且胶原包埋软骨细胞点种法移植组兔各期平均组织学和组织化学得分均高于其他两组(P < 0.01)。说明胶原包埋点种法软骨细胞移植能获得透明软骨修复,尤其适用于大面积软骨缺损。     

脂质体介导骨保护素基因转染大鼠骨髓基质干细胞及其表达*

背景：基因修饰骨组织工程种子细胞,可提高对骨缺损的修复能力。 目的：构建含有骨保护素的真核表达载体并检测转染骨髓基质干细胞后的表达。 方法：取4周龄SD大鼠胫骨和股骨行骨髓基质干细胞的分离和培养,分为载体组、空载体组、对照组。空载体组转染plRES2-EGFP载体,载体组转染plRES2-EGFP-OPG。 结果与结论：转染后激光扫描共聚焦显微镜观察可见骨髓基质干细胞内绿色荧光蛋白表达;RT-PCR检测结果可见质粒载体组在1 200 bp有明显条带,空载体组及对照组未见表达;免疫细胞化学检测骨髓基质干细胞内骨保护素蛋白呈阳性;MTT法检测各组细胞增殖活力无明显改变(P > 0.05)。证实应用plRES2-EGFP-骨保护素质粒转染大鼠骨髓基质干细胞,可获得外源性骨保护素的基因及蛋白表达。     

模拟微重力培养骨髓间充质干细胞定向诱导复合改良纤维蛋白原支架修复

背景：模拟微重力培养系统通过模拟细胞生存的体内微重力环境,使细胞承受较低的剪切力, 提高细胞内外、细胞间物质传递效率,从而提高细胞分化质量。 目的：观察微重力培养环境在构建组织工程模块修复关节软骨缺损中的作用。 设计、时间及地点：体外实验采用自身对照;体内实验采用随机分组比较,于2007-12/2008-06在广东省构建与检测实验室及南方医院动物实验中心进行。 材料：3 周普通级龄新西兰兔1只用于骨髓间充质干细胞培养;3 月龄新西兰兔48只用于体内验证实验。 方法：以纤维蛋白胶粉、凝血酶、氯化钙、抑肽酶、氨甲环酸制备纤维蛋白原支架。体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞3 周,使之吸附于改良纤维蛋白原支架上在微重力环境下三维立体培养3周。48只兔做软骨钻孔制备软骨缺损动物模型,每只兔4孔。实验分为4组,每组48孔,微重力培养组在孔内植入微重力培养下的软骨细胞组织模块;普通培养组在孔内植入普通培养下的软骨细胞组织模块;单纯支架组在孔内植入空白支架;空白组孔内不植入任何材料,分别于2,6,12 周处死动物,取相应标本。 主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学检测微重力培养环境在三维立体培养对软骨细胞增殖及功能的影响,以及用组织工程学评分检测微重力环境下培养的软骨模块对缺损的修复效果。 结果：模拟微重力培养条件下构建的模块体外培养3周,细胞数量明显增多,并分泌较多的细胞基质,包裹在软骨细胞周围。组织工程学评分显示微重力培养组修复软骨缺损的效果明显好于其他组。 结论：模拟微重力培养环境对三维立体培养软骨细胞模块有比较良好的效果。     

纳米晶羟基磷灰石胶原复合骨髓间充质干细胞修复骨缺损

背景：临床上对大范围骨缺损还没有很有效的治疗手段，而纳米晶羟基磷灰石胶原复合材料与天然骨骼的结构类似，具有较好的生物相容性，可能为修复骨缺损提供新的途径。 目的：观察纳米晶羟基磷灰石胶原材料复合骨髓间充质干细胞在修复骨缺损中的作用。 方法：分离培养人骨髓间充质干细胞，与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养；通过大体观察、组织学分析及电镜观察了解成骨情况，进一步临床应用于修复骨缺损。 结果与结论：人骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增，复合细胞的材料植入骨缺损处后，X射线摄片动态观察可见骨缺损处连接良好。说明骨髓间充质干细胞具有成骨细胞作用，纳米晶羟基磷灰石胶原材料是一种很好的构建组织工程骨的支架材料。 关键词：骨髓间充质干细胞；羟基磷灰石；纳米材料；组织工程；骨     

新鲜自体与异体骨软骨移植修复兔关节软骨缺损的比较

背景：骨软骨移植是修复关节软骨损伤的主要方法之一,但新鲜自体骨软骨移植与新鲜异体骨软骨移植相比效果尚无定论。 目的：探讨新鲜自体骨软骨移植与异体骨软骨移植修复兔关节软骨缺损的方法及疗效。 设计、时间及单位：动物实验观察,于2007-01/2008-05在解放军第四军医大学唐都医院骨科完成。 材料：新西兰大白兔9只,随机分为3组,3只/组,分别实施自体骨软骨移植、异体骨软骨移植、单纯软骨缺损3种手术。 方法：自体移植组：在股骨内侧髁负重关节面取直径3 mm骨软骨缺损,于非负重关节面取4块直径1 mm骨软骨柱移植;异体移植组：在股骨内侧髁负重关节面直径3 mm骨软骨缺损处植入相同直径的异体骨软骨柱;对照组：于股骨内侧髁负重关节面取直径3 mm全层软骨缺损,不做处理。 主要观察指标：术后12周取材,进行大体观察,组织学检查和半定量的改良Wakitani score评分。 结果：大体观察异体移植组修复面较自体移植组稍平整,光镜可见自体和异体移植软骨均已覆盖缺损,与正常软骨高度相当。绝大部分修复面为透明软骨,增殖活跃。软骨下骨、松质骨小梁均与骨床完全骨性愈合。自体移植组软骨浅表区细胞数目及排布更接近正常透明软骨,过渡区及辐射区细胞密度、厚度也明显优于异体移植组,基质染色丰富。 结论：自体与异体骨软骨移植的方法均可完成关节软骨缺损的透明软骨修复,自体骨软骨移植更优。