淫羊藿苷诱导小鼠胚胎干细胞体外定向分化为心肌细胞方法学研究

 目的采用药物淫羊藿苷(icariin,ICA)改变小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)体外培养的微环境,建立一种药物介导提高ES细胞体外定向心肌细胞分化率的实验体系。方法采用悬滴培养法,构建ICA诱导ES细胞体外定向分化为心肌细胞的实验评价体系;并利用RT-PCR法和免疫荧光法鉴定心肌细胞。结果ICA在10^-7mol·L^-1浓度时,对ES细胞定向分化为心肌细胞呈现最佳诱导效应,分化率最高达84%(P<0.001)。ES细胞源心肌细胞表达心肌特异性基因肌球蛋白重链(α-MHC)和心室肌球蛋白轻链(MLC-2v),且心肌特异性肌小节α辅肌动蛋白(α-actinin)和肌钙蛋白T(troponin T)呈阳性表达。结论悬滴培养法结合药物改善微环境,可用于药物诱导ES细胞定向分化心肌细胞的实验体系。     

黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的:探索黄芪含药血清诱导骨髓间充质干细胞(MSC)分化为心肌样细胞的作用。方法:采用日本大耳白兔制备黄芪含药血清,分离SD大鼠MSC进行传代培养。用黄芪含药血清和5-Aza进行诱导分化,免疫组化法检测诱导后细胞心肌肌钙蛋白、结蛋白表达,RT-PCR反应测定α-MHC和β-MHC表达。结果:诱导后细胞心肌肌钙蛋白、结蛋白表达阳性,并可以表达心肌特异性的肌球蛋白。结论:黄芪含药血清可诱导MSC分化为心肌样细胞。     

温阳化饮益气活血法对慢性心功能不全大鼠心肌α-MHC、β-MHC基因表达的影响

目的:探讨温阳化饮益气活血法对慢性心功能不全大鼠心肌α- MHC、β-MHC基因表达的影响。方法:采用腹腔注射阿霉素法复制慢性心功能不全大鼠动物模型,利用RT-PCR技术检测心肌重构的相关调控因素α- MHC、β-MHC在慢性心功能不全发病中的作用,同时观察温阳化饮益气活血法对其干预作用。结果:慢性心功能不全大鼠模型组心肌组织α-MHC基因表达下调,β-MHC基因表达上调;温阳化饮益气活血法治疗组心肌组织α-MHC基因表达上调,β-MHC基因的表达下调。结论:温阳化饮益气活血法能上调慢性心功能不全大鼠α-MHC基因的表达,下调β-MHC基因的表达,为温阳化饮益气活血法的临床应用提供了实验依据,这可能是温阳化饮益气活血法防治慢性心功能不全的作用机制之一。     

参白注射液对病毒性心肌炎模型大鼠α-MHC基因表达的影响

目的:探讨参白注射液调节病毒性心肌炎心肌肌凝蛋白重链α-MHC基因表达的作用机制.方法:无菌分离、切取新生1～3天Wistar大鼠的心室肌,制备和培养心肌细胞,建立病毒性心肌炎(VMC)感染模型--体外培养大鼠心肌细胞感染柯萨奇B3(CVB3)病毒,通过免疫组化实验,检测参白注射液对α-MHC基因表达的影响.结果:正常组α-MHC基因表达可见明显阳性信号,病毒感染组蛋白阳性信号表达减少,病毒感染加参白注射液组能明显上调α-MHC基因的表达含量.结论:参白注射液通过减轻自身免疫损伤,使具有ATP酶活性的MHC表型发生变化的几率减少,从而上调α-MHC的表达,进而增强心肌收缩力.     

补中益气法对甲减大鼠心肌α-MHC和β-MHCmRNA表达的影响

目的:研究补中益气法对甲状腺功能减退(甲减)大鼠心肌肌球蛋白重链α和β(myosin heavy chain alpha and beta,α-MHC和β-MHC)mRNA表达的影响。方法:将甲减Wistar大鼠随机分为模型对照组、L-T4组、补中益气汤组。实时定量RT-PCR法测心肌α-MHC和β-MHC mRNA。结果:给处理因素8周,L-T4组、补中益气汤组的α-MHCmRNA的表达分别为正常组的1.77倍、2.32倍,补中益气汤组较L-T4组上升明显(P<0.05);L-T4组、补中益气汤组β-MHCmRNA的表达分别为正常组的2.61倍、1.17倍,补中益气汤组下调明显(P<0.05)。结论:补中益气法在甲减心肌损伤的修复中起重要作用,其机制与其提高心肌α-MHC mRNA的表达、降低β-MHCmRNA的表达有关。     

天保宁对阿霉素致大鼠心肌损伤心肌肌球蛋白重链变化的影响

目的：观察天保宁对阿霉素所致大鼠心肌损伤时心肌肌球蛋白重链的变化及心肌结构的改变。方法：采用雄性SD大鼠30只，随机分为3组：(1)正常对照组：ip等体积生理盐水；(2)阿霉素组(Doxorbincin,Adrinmycin,ADR)：于实验开始后第2、4天ip ADR 1mg/kg；第6、8天ip ADR 2mg／kg；第10、12天ip ADR 3mg/kg；第14、16天ip ADR 4mg／kg，16d累计用药剂量达20mg/kg。(3)天保宁组(ADR 天保宁)：ADR的剂量用法同ADR单用组，天保宁(浙江康恩贝制药公司)450mg／kg隔日灌服共8d停药24h后，称体重、心肌重量、左心室重量及心肌蛋白的提取、肌球蛋白重链(MHC)分析，电镜观察心肌细胞超微结构的变化。结果：天保宁组大鼠的体重、心体比及左室心体比(LVM／BW)均较ADR组有显著改善(vs P＜0．01)。电镜下可见，ADR组心肌细胞严重损伤，提示有心衰发生，天保宁组大致正常。同时，天保宁组中α-MHC向β—MHC转变减轻，α-／β-MHC较ADR组低(P＜0．05)。结论：天保宁可改善ADR对心肌损伤时的毒性反应，特别是减轻ADR对心肌肌球蛋白重链中α-MHC向β-MHC转变，具有抗重塑和抗心衰的作用。     

益母草碱对肥大心肌细胞p38MAPK及下游基因表达的影响研究

目的:探讨益母草碱对肥大心肌细胞p38MAPK及下游基因表达的影响。方法:以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导肥大心肌细胞,在此基础上给予p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂(SB203580,10μmol/L)及低、中、高浓度益母草碱(5、10、20μmol/L)干预。分别以[~3H]亮氨酸掺入量、酶联免疫吸附测定(ELISA)和硝酸还原酶法检测心肌细胞蛋白质合成速率以及细胞上清B型利钠肽(BNP)、内皮素-1(ET-1)、AngII和一氧化氮(NO)含量;Real-time PCR法检测心肌细胞ET-1、p38MAPK、肌细胞增强因子2(MEF2)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-肌球蛋白重链(α-MHC) mRNA的表达水平。结果:与模型组比较,高剂量益母草碱组心肌细胞蛋白质合成速率、BNP、ET-1及AngII含量明显降低(P0.05),同时ET-1、p38MAPK、 MEF2、β-MHC mRNA表达水平明显下调(P0.05),而NO含量和α-MHC mRNA表达水平明显上调(P0.05)。结论:高剂量益母草碱(20μmol/L)可能通过调节p38MAPK及下游基因表达逆转心肌细胞肥大。     

吡非尼酮抑制内皮素-1诱导下的乳鼠心肌细胞肥大及其作用机制研究

目的 采用内皮素-1（ET-1）诱导的心肌细胞肥大模型,研究吡啶酮类小分子化合物吡非尼酮（pirfenidone）对心肌肥大标志物如心房钠尿肽（ANP）、B型利钠肽（BNP）、β肌球蛋白重链（β MHC）等的影响,并探讨其作用的分子机制.方法 构建ET-1 诱导离体心肌细胞肥大模型,采用Real-time PCR 法检测吡非尼酮对ANP、BNP、β-MHC 等蛋白表达水平的影响;用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测吡非尼酮对ANP、BNP、β-MHC 等mRNA 表达水平,以及转化生长因子β（TGF-β）/SMAD 信号通路分子TGF-β1 及SMAD2、SMAD3 在心肌细胞中的mRNA 表达水平的影响.结果 吡非尼酮能够显著抑制ET-1 诱导下ANP、BNP、β-MHC 蛋白及mRNA 水平的表达,以及TGF-β1 、SMAD2、SMAD3 在心肌细胞中的mRNA 表达.结论 吡非尼酮对ET-1 诱导的心肌细胞肥大具有抑制作用,这一作用可能是通过抑制TGF β/SMAD 信号通路相关分子实现的.     

益母草碱对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大p38 MAPK信号通路和miRNA-1表达的影响

目的:研究益母草碱对血管紧张素Ⅱ(angiotensin,AngⅡ)诱导心肌细胞肥大的作用,并分析其对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路和微小RNA-1(microRNA-1,miRNA-1)表达的影响。方法:以AngⅡ(0. 1μmol·L~(-1))诱导肥大心肌细胞。实验分为空白组,模型组,p38 MAPK抑制剂组(SB203580,10μmol·L~(-1))以及益母草碱低、中、高浓度组(5,10,20μmol·L~(-1))。以图像分析软件测量心肌细胞表面积; Folin-酚试剂法(Lowry)检测心肌细胞蛋白含量;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)含量;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测心肌细胞miRNA-1 mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌细胞内皮素-1(endothelin-1,ET-1),p38 MAPK,磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK),肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor 2,MEF2),β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)和α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)蛋白的表达水平。结果:与空白组比较,模型组心肌细胞表面积、蛋白含量及细胞上清ANP含量明显升高(P 0. 05),ET-1,p38 MAPK,p-p38 MAPK,MEF2和β-MHC蛋白表达水平明显上调(P 0. 05),α-MHC蛋白及miRNA-1 mRNA的表达水平明显下调(P 0. 05)。与模型组比较,益母草碱高浓度组明显减少肥大心肌细胞表面积、蛋白含量及细胞上清ANP含量(P 0. 05);下调ET-1,p38 MAPK,p-p38 MAPK,MEF2和β-MHC蛋白表达水平(P 0. 05);上调α-MHC蛋白及miRNA-1的表达水平(P 0. 05)。结论:益母草碱高浓度组(20μmol·L~(-1))可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其机制可能与抑制p38MAPK信号通路活化和上调miRNA-1的表达有关。     

温肾方对亚临床甲状腺功能减退模型大鼠心肌肌球蛋白重链基因表达的影响

目的:观察温肾方对亚临床甲状腺功能减退模型大鼠心肌肌球蛋白重链基因表达的影响。方法:采用"甲状腺全切术+术后皮下注射L-T4"法制备亚临床甲减大鼠模型,设定空白对照组、模型组、西药组、中药低剂量组及高剂量组、中+西药组,RT-PCR法按照试剂盒说明测定心肌肌球蛋白重链基因表达,同时观察温肾方对其指标的干预情况。结果:与空白对照组比较,模型组大鼠心肌肌球蛋白重链α-MHCmRNA表达降低(P0.05),β-MHCmRNA表达显著增加(P0.01);与模型组比较,中+西药组和中药高剂量组在上调大鼠心肌α-MHCmRNA表达,下调大鼠心肌β-MHCmRNA表达方面效果显著(P0.05);中+西药组及中药高剂量组心肌α-MHCmRNA、β-MHCmRNA表达水平接近于空白对照组(P0.05)。结论:亚临床甲状腺功能减退可引起心肌肌球蛋白重链基因表达的改变,温肾方能逆转心肌肌球蛋白基因的异常表达,从而具有防治亚临床甲减心脏并发症的作用。     

鹿茸多肽提取工艺及其药理学作用

综述鹿茸多肽提取工艺及其药理学作用。鹿茸多肽的提取工艺包括萃取法、酶解法、超声波法、高压电场法。鹿茸多肽的分离纯化方法包括盐析法、超滤法、离子交换法、电泳法。鹿茸多肽的药理学作用广泛,主要对免疫系统、循环系统、神经系统、骨代谢以及糖代谢等起着重要作用,同时鹿茸多肽还具有抗炎、抗病毒、抗氧化和抗疲劳等作用。     

Velvet antler polypeptide is able to induce differentiation of neural stem cells towards neurons in vitro

OBJECTIVE: To investigate the neural differentiation capacity of water extraction of velvet antler.METHODS: Velvet antler(Cervus Nippon Temminck) polypeptide(VAP) was used to differentiate neural stem cells(NSCs) towards neurons in the study. Firstly, we obtain the polypeptides of VAP by water extraction. Secondly, we observed the morphology, assayed the factors in the media by enzyme-linked immunosorbent assay, and detected the special neural molecules by immuno fl uorescence staining. NSCs were cultured on the cell climbing film. After neuronal differentiation, differentiated NSCs were mounted for immunocytochemistry with immunofluorescence technique.RESULTS: The differentiating cells look like neuron,some special factors, such as Glial cell line-derived neurotrophic factor, nerve growth factor, in the media can be detected while differentiated neuron-like cells can express the special neural molecules.CONCLUSION: Differentiation of NSCs towards neurons can be induced by velvet antler polypeptide.     

鹿茸多肽对人胶质瘤细胞生长抑制率及细胞周期的影响

目的观察鹿茸多肽对人胶质瘤细胞生长抑制率及细胞周期的影响,探讨鹿茸多肽抑制肿瘤细胞的增殖及调节细胞周期作用的机制。方法在体外传代的培养人胶质瘤细胞(U251)细胞株中加入不同浓度(50、100、200、400、800μg/mL)的鹿茸多肽,诱导培养48 h,镜下观察细胞的形态学变化,MTT法检测鹿茸多肽对肿瘤细胞增殖情况,计算抑制率;流式细胞术(FCM)分析鹿茸多肽,诱导培养肿瘤细胞48 h后,细胞周期变化情况。结果形态学观察表明,与对照组相比,随着药物剂量的增加,实验组细胞密度逐渐降低,细胞间隙逐渐增宽,细胞体积逐渐缩小,细胞内颗粒逐渐增多。MTT法检测结果表明,鹿茸多肽对肿瘤细胞的增殖抑制作用明显,细胞生长抑制率随着剂量增加抑制率逐渐增加,呈现出良好的剂量依赖性。FCM检测表明,肿瘤细胞G0/G1期与S期所占百分比逐渐减少,G2/M期阻滞。48 h均出现凋亡峰,及凋亡细胞群。结论鹿茸多肽对体外培养的人胶质瘤细胞的增殖有抑制作用,并具有量效关系。可使肿瘤细胞阻滞在细胞周期的G2/M期,继而引起的细胞周期阻滞和诱导其凋亡。     

鹿茸线粒体DNA的指纹鉴定研究

 目的 通过鹿茸特异性引物鉴别和随机扩增多态DNA(RAPD)鉴别的比较,选择一种更简便的方法用于鉴别鹿茸。 方法 采用盐析法从梅花鹿茸、马鹿茸、驯鹿茸、市售鹿茸等样品中抽提线粒体DNA,并应用试剂盒进行纯化。进行特异性引物扩增和序列测定,同时进行随机扩增多态DNA扩增。结果 梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸以及部分市售鹿茸经特异性引物扩增后均可在琼脂糖凝胶中显示313 bp片段,只是条带亮度不同。而其余市售鹿茸无扩增条带; 随机扩增多态DNA不仅有效显示阳性与阴性的DNA扩增结果,而且对梅花鹿茸,马鹿茸,驯鹿茸的聚合酶链反应产物的差异,以不同的条带数目和条带亮度得以验证。结论 随机扩增多态DNA鉴别鹿茸真伪的方法更准确快捷,通过随机扩增多态DNA扩增后主条带与梅花鹿茸或马鹿茸扩增的条带大小和亮度一致,则为正品;如不一致,则为《中国药典》规定外的鹿茸或其他混淆品。这种方法对于筛选、甄别市售动物中药材,特别是名贵中药具有广阔的应用前景。     

鹿茸多肽促进大鼠坐骨神经再生的实验研究

目的 :探讨鹿茸多肽对大鼠坐骨神经损伤后神经再生的影响。方法 :Wistar大鼠 36只 ,雌雄各半 ,随机分成对照组和鹿茸多肽用药组。建立切断大鼠坐骨神经保留一侧神经外膜模型 ,术后隔日于失神经支配的靶器官注射给药。于术后 2、4、6周观察坐骨神经功能指数、电生理、组织学及超微结构。结果 :坐骨神经功能指数、潜伏期及诱发电位恢复率在各时间点上用药组优于对照组P <0 0 1。组织学检查有髓神经纤维数、纤维直径、截面积在各时间点上用药组优于对照组P <0 0 1。超微结构观察用药组各时间点上有髓神经纤维的髓鞘厚度、成熟度均优于对照组。结论 :鹿茸多肽能促进神经再生及功能的恢复。     

多肽药物汇利心康对小鼠心肌肥大与肌球蛋白重链表达的影响

 目的 探讨Gq蛋白羧基端模拟肽盐酸GCIP-27（汇利心康,HLXK）对去甲肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大和肌球蛋白重链表达的影响。方法 60只小鼠,随机分为对照组、模型组、氯沙坦组、HLXK（10、30、90 μg·kg-1）组,分别给予生理盐水、去甲肾上腺素1.5 mg·kg-1（ip,bid）、氯沙坦钾9 mg·kg-1（ig,qd）、HLXK（10、30、90 μg·kg-1;ip,bid）。连续给药20 d后,称量小鼠体重、心脏质量、左心室质量,计算心脏质量指数和左心室质量指数。采用免疫组化法测定肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)α、β在心肌组织中的表达情况。结果 去甲肾上腺素可明显诱导小鼠心肌重构。氯沙坦、HLXK（30、90 μg·kg-1;bid）能明显降低小鼠心脏质量指数和左心室质量指数,增加心肌组织中α-MHC的表达,降低β-MHC的表达。结论 汇利心康能够有效防止小鼠发生心肌肥大,纠正心肌肥大过程中的肌球蛋白重链表达失衡。     

益母草水苏碱抑制去甲肾上腺素诱导心肌细胞胚胎基因再表达的作用

目的观察益母草水苏碱（stachydrine,Sta）对去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）诱导的新生大鼠心肌细胞胚胎基因再表达的抑制作用。方法采用II型胶原酶分离新生大鼠心肌细胞,随机分为空白对照组、NE组、卡维地洛组（Car组）及益母草水苏碱组（sta组）各组分别予相应的干预措施。采用荧光标记F-actin染色法测定心肌细胞表面积,Protein／DNA比值代表细胞蛋白合成,并以荧光定量PCR检测胚胎基因α—MHC、β-MHCmRNA表达情况。结果与空白对照组比较,NE组心肌细胞表面积、Protein／DNA比值以及3-MHCmRNA表达差异有统计学意义（P〈0．05）。与NE组比较,sta组及卡维地洛组心肌细胞表面积、Protein／DNA及β—MHCmRNA表达差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Sta能够显著抑制NE诱导的心肌细胞肥大。     

酸味中药复方对糖尿病大鼠心肌组织晚期糖化终产物形成及其受体基因表达的影响

目的以氨基胍（AG）为对照,观察酸味中药复方对2型糖尿病大鼠心肌组织晚期糖化终产物（AGEs）含量及受体（RAGE）基因表达的影响,探讨其防治糖尿病心肌病变的机制。方法采取腹腔注射链脲佐菌素（STZ）配合高热量饮食的方法建立糖尿病动物模型。成模后随机分为模型组、AG组、中药组。给药8周和12周后分别采用荧光法和荧光定量PCR法检测心肌组织AGEs含量和RAGE基因表达量。结果糖尿病大鼠心肌组织AGEs含量和RAGE基因表达量明显高于正常组（P〈0．05）;中药组和AG组AGEs含量和RAGE基因表达量明显低于模型组（P〈0．05）。结论酸味中药复方可能通过抑制大鼠心肌组织AGEs形成和下调RAGE基因表达实现对高糖状态下心肌组织保护作用。     

益母草碱对压力超负荷心肌肥厚大鼠的作用及机制研究

探讨益母草碱(leonurine, Leo)对腹主动脉缩窄(abdominal aortic constriction, AAC)致大鼠压力负荷型心肌肥厚的作用及作用机制。AAC方法建立压力超负荷大鼠心肌肥大模型,经益母草碱高、低剂量组(30、15 mg·kg^-1)及阳性对照药氯沙坦钾片组(losartan, 5 mg·kg^-1)干预27 d后,采用血流动力学方法评价心功能,并记录左室收缩压(left ventricular systolic pressure, LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure, LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(maximum increase and decrease in left ventricular pressure,±dp/dt_max);采用心脏质量指数(heart weight index, HWI)和左室质量指数(left ventricular mass index, LVWI)测定左心室肥大程度;苏...     

鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响

目的:观察鹿茸多肽对兔骨性关节炎软骨细胞的影响。方法:参考Hulth法建立骨性关节炎模型,给予不同浓度的鹿茸多肽进行干预,分别进行MTT法检测、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,获得鹿茸多肽对软骨细胞作用。结果:鹿茸多肽对骨性关节炎软骨细胞有一定的增殖作用,骨性关节炎软骨细胞直接分泌到胞外的基质金属蛋白酶含量变化不明显,骨性关节炎软骨细胞核酸中金属蛋白酶有一定表达。结论:骨性关节炎软骨细胞在正常分化及增殖发生改变过程中,其软骨基质的降解是金属蛋白酶与其它因子协同作用的结果;鹿茸多肽有促进骨性关节炎软骨细胞增殖作用,并可抑制骨性关节炎软骨细胞中金属蛋白酶的过度表达,可能对治疗骨性关节炎有较好的作用。