家蝇相关序列扩增多态性扩增体系的建立与优化

目的:建立和优化家蝇的相关序列扩增多态性(SRAP-PCR)扩增体系.方法:以驯养家蝇为材料,通过单因子实验分别研究了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物浓度及Taq DNA聚合酶用量对家蝇SRAP分子标记扩增体系的影响,并对扩增体系进行了优化.结果:优化后的反应体系总体积为30 μl,含50 ng模板DNA、1.5mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTPs、0.15 μmol/L引物和0.50 U Taq DNA聚合酶.结论:家蝇SRAP-PCR扩增优化系统的建立,为今后利用SRAP技术进行家蝇遗传多样性分析、基因定位奠定了基础.     

中金钗石斛相关序列扩增多态性反应体系的正交优化研究药大质量观及实践

目的 建立金钗石斛Dendrobium nobile相关序列扩增多态性 (SRAP) 反应体系,为金钗石斛分子生物学研究提供技术支持。方法 运用 L25(56) 正交设计对影响金钗石斛 SRAP 反应的5个因素：模板 DNA、Mg2+、dNTPs、Taq 酶、引物在5个水平上进行优化试验,对 PCR 结果进行极差分析。结果 金钗石斛 SRAP 反应最佳体系为：25 μL PCR 体系中含有 20 ng 模板 DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.2 mmol/L dNTPs, 1 U Taq 酶,0.6 μmol/L 引物。各因素对 SRAP 反应的影响依次为：〖WTBX〗Taq 酶＞Mg2+＞dNTPs＞模板 DNA＞引物。结论 所建立的金钗石斛 SRAP 反应体系具有标记位点清晰、多态性丰富、稳定性好等特点,可用于金钗石斛分子生物学的研究。     

正交设计优化半夏相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应体系

目的 采用正交设计优化半夏SRAP - PCR的反应体系.方法 以半夏基因组DNA为模板,应用L16 (45)正交表,研究了Taq酶、Mg2+、随机引物、dNTPs和模板DNA 5种SRAP反应组分浓度变化对扩增结果的影响.结果 优化反应体系为:25μL反应体系中含有buffer2.5μL、Taq酶1.0U、Mg2+2...     

金钗石斛遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系建立与优化

目的：对影响金钗石斛ISSR-PCR扩增效果的一些因素进行优化,为进一步研究其遗传多样性奠定基础。方法：通过筛选引物并设定影响金钗石斛ISSR反应诸因子的不同浓度,检测ISSR不同反应体系的扩增效果;通过分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立金钗石斛ISSR稳定可靠的反应体系。结果：金钗石斛较适宜的ISSR-PCR反应条件为：10 lμPCR反应体系,含5～15 ng模板DNA、2.0 mmol/L Mg^2＋、0.20 mmol/L dNTP、0.6～0.75 U Taq DNA聚合酶、1.0μmol/L引物。较适宜的退火温度为46～62℃。结论：Taq酶质量、DNA模板品质、退火温度等对ISSR反应结果具有较大影响。所建立的金钗石斛ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力较强、重复性好等特点,可用于金钗石斛的遗传多样性研究。     

青葙SRAP体系的建立和优化

目的 探讨影响青葙SRAP(sequence-related amplified polymorphism)扩增的各种因素,建立并优化青葙SRAP反应体系,为分子水平鉴定青葙子及其伪品,探讨青葙不同种质问的亲缘关系奠定基础.方法 用CTAB法提取青葙DAN,设计Taq酶浓度(0.02、0.04、0.06 U/μL)、dNTP浓度(0.10、0.20、0.30 mmol/L)、Primer浓度(0.15、0.30、0.45μmol/L)3水平3因素试验和Mg2 浓度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mmol/L)8水平单因素试验.在25 μL体系中加入模板DNA 20 ng,对体系进行优化,用琼脂糖进行检测.结果 建立了适合青葙的SRAP体系,在25 μL体系中,DNA为20 ng,Taq酶浓度为0.04 U/μL,dNTP浓度为0.30 mmol/L,Primer浓度为0.30 μmol/L,Mg2 浓度为2.5 mmol/L,优化后的体系目标条带增多,且比较稳定,重现性好,得到了较好的扩增效果.结论 本研究建立的反应体系适合青葙SRAP的研究.为从分子水平鉴定青葙子正品与伪品以及鉴定青葙不同种质资源奠定了基础.     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨夏枯草种质间遗传多样性奠定基础。方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究Mg2+、dNTP、引物、 Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响。结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为：在20 μL的反应体系中含模板DNA 30 ng,Mg2+2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U。在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析。     

国外实验动物信息资源网站

目的建立实验兔随机扩增多态DNA（RAPD）的最优反应体系,并对RAPD引物进行筛选优化。方法以白毛黑眼（WHBE）兔,日本大耳白（JW）兔,新西兰（NZW）兔为实验材料,对影响RAPD反应的各因素进行优化,摸索出最佳的Mg^2＋,dNTP,Taq酶,引物和DNA模板的浓度,并从60个随机引物中筛选出适合实验兔RAPD反应的引物。结果最优RAPD—PCR反应体系为：在20山的反应体系中,Mg^2＋1．5mmol／L,dNTP0．25mmol／L,Taq酶1．25U,引物5μmol／L,模板DNA40ng。60个RAPD引物中剔除了重复性差,条带模糊的引物后,有25个引物稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高。结论本研究筛选出的25个引物和建立的PCR体系可应用于实验兔的RAPD反应。     

黄花蒿SRAP-PCR反应体系的建立与优化

目的用序列相关扩增多态性(SRAP)这一新的分子标记技术建立稳定可重复的黄花蒿Artemisia annua的SRAP最佳反应体系。方法以黄花蒿DNA为模板,分析了SRAP反应体系中的一些重要参数对PCR扩增的影响。结果建立了稳定可重复的SRAP反应体系;25μL反应体系中,模板DNA为30～105ng,MgCl2为2.0mmol/L,dNTP为0.25mmol/L,Taq酶为1.0U,引物为2.0μmol/L;扩增程序:94℃预变性3min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸7min。结论本研究建立的黄花蒿SRAP体系重复性好,稳定性强。     

白芷ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的:建立白芷的ISSR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术进行白芷鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序.方法:以白芷基因组DNA为模板,分析了ISSR反应体系中模板DNA、Mg2 、dNTPs、引物浓度,TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响.结果:建立了重复性好,分辨率高的ISSR反应体系,即在25μL反应体系中,模板DNA浓度为10～30 ng,2.5μ10×PCR buffer(Mg2 free),MgCl2 2.0 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.6 pμmol/L;扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,引物在筛选后的最佳退火温度退火45 s,72℃延伸2min,共计39个循环,循环结束后在72℃延伸5 min.结论:建立了适用于白芷的ISSR反应体系.为今后利用ISSR标记技术开展白芷遗传变异分析和构建遗传图谱奠定了基础.     

胡黄连SRAP反应体系的建立与引物筛选

目的:建立胡黄连SRAP的反应体系,并筛选出适合胡黄连的引物组合,为胡黄连的遗传多样性研究奠定基础.方法:采用5因素(dNTP、Mg2+、Taq酶、引物、DNA)4水平正交试验一步法建立SRAP -PCR的反应体系,采用梯度温度法筛选PCR反应程序的最佳退火温度,对已发表的SRAP引物组合进行了筛选.结果:胡黄连SRAP - PCR的最佳反应体系,即20μL反应体系:10×buffer 2μL,dNTP 150μmol·L-1,Mg23 mmol·L-1,Taq酶2U,引物为0.5μmol·L-1,DNA为20ng,DMSO 1μL;最适的退火温度是30.0℃～33.2℃:最适的引物组合为Me1Em1,Me1Em2,Me1Em3,Me3Em3,Me1Em4,Me2Em4,Me3Em4,Me4Em4,Me1Em5,Me3Em5,Me4Em5,Me3Em6,Me4Em6.结论:该体系是适合胡黄连SRAP - PCR反应的最适宜体系,为今后胡黄连遗传多样性研究奠定了基础.     

白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化

目的：建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础.方法：应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系.结果：优化后25 μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2＋、2.5 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 UTaq DNA聚合酶.结论：建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系.     

荧光定量PCR检测细胞代谢综合征相关基因表达的优化

目的优化MRSG mRNA表达的Taqman荧光定量PCR检测反应体系并进行系统评价。方法设计荧光PCR适用的引物和探针,从模板、引物、探针、镁离子浓度等方面优化荧光定量PCR检测反应体系,评价优化系统的特异性和稳定性。结果确定系统的模板取样量为2μl,引物浓度为0.4μmol/L,探针浓度为0.2μmol/L,Mg~（2＋）浓度为4mM,建立了稳定的MRSG mRNA表达的Taqman荧光PCR检测方法。结论优化后的MRSG mRNA荧光PCR检测方法特异性和稳定性较好。     

药用植物诃子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化药用植物诃子的ISSR-PCR反应体系.方法 以诃子叶片为实验材料,采用CTAB法提取诃子DNA为模板,通过单因素和双因素实验,研究诃子ISSR-PCR反应体系中DNA模板、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物、dNTPs等的用量,以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合诃子ISSR分析的反应体系...     

蠕形螨ISSR-PCR的反应体系优化及引物筛选

目的以蠕形螨的DNA为模板,对蠕形螨简单重复序列锚定PCR(ISSR-PCR)反应体系优化并对ISSR引物进行筛选,为ISSR分析奠定基础。方法用自然沉降法收集山羊蠕形螨,用基因组DNA提取试剂盒提取山羊蠕形螨DNA,并以此为模板,以(CA)8RG(R为1分子的嘧啶)为引物,利用正交实验法,从Mg2+浓度、引物用量、dNTPs、DNA模板用量和TaqDNA聚合酶以及退火温度对蠕形螨ISSR-PCR反应体系进行优化,并以优化的反应体系筛选ISSR-PCR的引物。结果 ISSR-PCR 25μL最佳反应体系包括:0.4 mmol/L Mg2+、30 pmol引物、30～60 ng模板DNA、2u Taq酶,最佳退火温度为49℃、循环35次。筛选出10条条带清晰、多态性好、重复性高的引物。结论筛选出蠕形螨ISSR-PCR最佳反应体系和理想的引物,为蠕形螨的分子生物学研究奠定了基础。     

两面针ISSR-PCR反应体系的建立及优化

【目的】建立适合两面针简单重复序列—聚合酶链反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序。【方法】采用改良的高盐低pH法提取两面针基因组DNA,通过单因素试验和正交试验相结合对ISSR反应体系中的主要成分(Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物和模板)进行筛选和优化,并考察退火温度对扩增结果的影响。【结果】最佳的PCR反应体系为:总体积为25μL,含1.50 mmol/L Mg2+、150μmol/L dNTPs、0.04 U/μL Taq DNA聚合酶、0.60μmol/L引物、2.40 ng/μL DNA模板。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,51.4℃退火45 s,72℃延伸2 min;35个循环;72℃再延伸10 min。【结论】优化了两面针ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为两面针ISSR遗传多样性分析打下基础。     

Taqman—MGB荧光定量PCR测定饮用水中大肠菌群

目的建立饮用水中大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法。方法以大肠菌群lacZ基因为靶基因,建立Taqman—MGB探针荧光定量PCR定量方法测定饮用水中大肠菌群,并进行方法学评价。结果25山荧光定量PCR反应体系中Mg3＋为5．0mmol／L,dNTPs0．2mmol／L,引物0．2μmol／L,探针0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶2．0U,加入样品模板5μl。检测方法的特异性、重复性好,灵敏度高,可检出单个拷贝大肠菌群模板。结论所建立荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异检测饮用水中大肠菌群。     

DNA甲基化PCR方法的优化

【目的】优化DNA甲基化PCR的反应体系及扩增参数，为基因甲基化的研究建立一个最佳的PCR方法。【方法】以MHCC-97H肝癌细胞株AFP基因启动子区为模板，分析DNA甲基化反应体系中Mg^2＋、TaqDNA聚合酶用量、加入时间、退火温度及循环方式对甲基化PCR扩增的影响。【结果】反应体系20μl：模板DNA（MoDNA），2μl；正向引物，1μl；反向引物，1μl；10×PCR Buffer，2．5μl；2mmol／LdNTPs，2．5μl；Taq酶，0．4μl；MgCl2，2μl；H2O，8．6μl。PCR程序采用Touch Down PCR。【结论】优化了适用于AFP基因甲基化PCR的反应体系，为利用甲基化PCR分析方法研究肝癌等肿瘤发生机制奠定基础。     

PCR扩增肺癌组织puma基因第四外显子的实验研究

目的探讨PCR扩增肺癌组织中puma基因第四外显子（GC含量76．44％）的最适实验条件．方法通过改变PCR反应体系各组分的浓度和反应条件,探讨PCR反应体系最适浓度和反应条件．结果PCR反应体系为dNTP200μmol／L,普通MgCl2 1．0mmol／L,引物500nmol／L,TaqDNA聚合酶0．1U／μL,模板量不低于4000ng,普通10×扩增体系缓冲液5μL,总体积50μL.反应条件为94℃预变性5min,94℃ 45s、61℃ 45s、72℃ 45s循环33次,最后72℃延伸5min．结论确立了puma基因第四外显子的PCR扩增条件,为后续的突变研究奠定了基础．