类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B酵母双杂交cDNA文库的构建

目的:构建类泛素FAT10高表达肝癌细胞株Hep3B的酵母双杂交用cDNA文库.方法:从肝癌细胞Hep3B中提取总RNA,分离mRNA.利用反转录酶M-MLV与Oligo(dT)AnchorPrimer合成1stStrandcDNA,用E.coliDNAPolymerase与E.coliDNALigase将RNA链置换成DNA链,合成2ndStrandcDNA.将双链cDNA与EcoRⅠAdaptor连接,然后用EcoRⅠ/XhoⅠ进行酶切.使用SpinColumn除去短链cDNA与pGADT7载体连接,转化入E.coliDH10B,建成原始文库.然后对其进行扩增并随机挑取单菌落,酶切鉴定重组子插入片段大小.结果:提取的总RNA降解少且分子完整;RNA纯度高,相对分子质量为400-5000bp;成功合成双链cDNA,均符合建库要求;库容量达到1.03×106克隆,原始文库滴度为2.50×109cfu/L,扩增后的文库滴度为3.60×1012cfu/L.插入片段大小分布为0.5-3.5kb,平均长度约为2.0kb.结论:所构建文库的各项指标均达到要求,为筛选FAT10作用蛋白奠定了重要基础.     

人胃黏膜细胞cDNA文库和pGBKT7p-37重组质粒的构建(英文)

目的　构建人胃黏膜细胞cDNA文库 ,并选取VacA毒素的p37片段将其克隆到 pGBKT7以表达BD p37融合蛋白作为诱饵。为进一步用所此诱饵来筛选所构建文库以其找到与VacA相互作用的蛋白奠定基础。方法　用TRIzol试剂从胃腺癌病人手术切除的正常胃黏膜细胞中抽取总RNA经LD PCR得到双链cDNA ,参照Clontech的MATCHMAKERLibraryConstructionandScreeningKit构建cDNA文库并用文库所含的独立克隆数和含插入片段的克隆数占总克隆数的比例来评价酵母双杂交文库的质量。用PCR从Helicobacterpylor基因组中扩增出p 37基因将其克隆入 pGBKT7载体并使插入片段与GAL4BD同框 ,插入片段的大小和序列的正确性由双酶切和测序得以证实。结果　文库中共有 1.9× 10 6个独立克隆 ,含插入片段克隆所占比例为 91.7%。双酶切和测序结果表明 p37的正确插入 ,Westernblot结果证明了融合蛋白的表达。 结论　构建了较高质量的cDNA文库和与GAL4BD融合的诱饵蛋白 ,为进一步的研究奠定了基础。     

人结肠癌羟基喜树碱耐药细胞株SW1116/HCPT的建立与鉴定

背景：肿瘤细胞的多药耐药性是造成化疗失败的主要原因，其机制是多种耐药相关基因表达的改变。目的：探讨消化道肿瘤的多药耐药机制和逆转策略。方法：应用药物浓度递增诱导法建立羟基喜树碱（HCPT）耐药结肠癌细胞株SW1116／HCPT；细胞计数法测定细胞生长曲线；流式细胞仪测定细胞周期分布；细胞染色体染色进行核型分析；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法进行药物敏感实验；聚合酶链反应（PCR）-酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞端粒酶活性；肿瘤药物耐受功能分类基因芯片筛选差异表达的耐药相关基因。结果：与亲代细胞相比，SW1116／HCPT细胞生长曲线无明显改变；对HCPT的耐药倍数增加120．0倍，并与阿霉素（48．2倍）、氧化苦参碱（2．1倍）、阿糖胞苷（2．0倍）、5．氟尿嘧啶（1．8倍）、顺铂（1-3倍）存在交叉耐药现象；细胞周期分布明显改变，G1期细胞增加，S期细胞减少；细胞染色体无明显变化，核型为非整倍体54-69；细胞端粒酶活性无明显改变；功能分类基因芯片显示，耐药细胞株表达改变的基因有30个。其中表达下调10个，上调20个。结论：SW1116／HCPT是研究消化道肿瘤多药耐药现象的模型之一。     

酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选

目的: 应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HbcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/Leu-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因.分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.     

应用白细胞表达型cDNA文库的酵母双杂交技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的结合蛋白

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)与白细胞来源蛋白的相互作用，探讨HCV NS5A对于病毒致病的机制及对机体免疫的影响。方法：构建HCV NS5A的酵母细胞表达载体，采用酵母双杂交系统筛选人白细胞cDNA文库，利用核苷酸数据库及生物信息学技术，对于筛选结果进行分析。结果：获得了53个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括jun B原癌基因、Mob-1、制瘤素M、肌球蛋白IF、小囊泡结合膜蛋白的结合蛋白等16种已知蛋白基因，和2个未知功能基因。结论：NS5A可与一些白细胞特异性蛋白和信号转导组分发生结合，为HCV所引起的肝内外疾病机制的研究提供线索。     

猫肠上皮细胞的原代培养及cDNA文库的构建

目的建立猫肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)培养体系,构建其酵母双杂交cDNA文库,为筛选弓形虫毒性因子在终末宿主的互作蛋白奠定基础。方法分别采用组织块法以及低浓度胶原蛋白酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法进行猫IECs的原代培养,通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法鉴定后提取mRNA,运用SMART技术合成cDNA第一链,以LD-PCR扩增获得双链cDNA(ds cDNA),通过同源重组方法在酵母菌株Y187中构建猫IECs的cDNA文库,计算文库的容量,以酵母菌液PCR检测插入片段的大小分布。结果两种培养方法效果表明酶联合消化法更为有效。本研究建立了连续培养猫IECs体系,培养出高纯度的猫IECs,用其构建的cDNA文库容量为1.1×10~6,滴度为2.8×10~9cfu/ml,插入片段大小在0.5~2.0 kb之间。结论培养的原代猫IECs构建的cDNA文库符合酵母双杂交筛选互作因子标准,这为筛选弓形虫终末宿主的毒性因子互作蛋白奠定了基础。     

旋毛虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫保护性抗原及特异性诊断抗原基因，我们用异硫氰酸胍从旋毛虫肌肉或幼虫中分离总RNA，用PolyATtractmRNA分离系统统化mRNA，以NotIprimeradapter为引物合成双链cDNA，加SalIadapter,与λgt22A在体外进行连接包装并转染大肠杆菌Y1090r－，构建cDNA文库。结果获得5×105个重组噬菌体，重组率在90％以上．     

人包皮成纤维细胞酵母双杂交均一化cDNA文库的构建北大核心CSCD

目的构建人包皮成纤维细胞(HFF)酵母双杂交均一化cDNA文库,为研究弓形虫与宿主细胞间的相互作用及其入侵机制奠定基础。方法复苏、培养HFF细胞并提取细胞总RNA,采用SMART和LD-PCR合成ds cDNA,对其进行均一化处理后,利用SfiI酶切,酶切后的ds cDNA连接pGADT7-SfiI三阅读框表达载体,连接产物转化至大肠埃希菌HST08,构建cDNA初级文库,进行库容检测和插入片段的PCR鉴定。提取文库质粒转化至酵母Y187中,制备HFF细胞Y187酵母文库。结果 HFF细胞总RNA的A260/A280值为2.02,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到28S和18S核糖体特异性条带且二者亮度之比为2∶1,提取的RNA完整、质量良好。3种读码框库容分别为1.4×10~6 CFU/ml、1.8×10~6 CFU/ml和2.0×10~6 CFU/ml,重组率为99%。cDNA文库外源基因插入片段长度700～2 000bp。制备的HFF细胞酵母cDNA文库库容量为2.5×10~7 CFU/ml。结论构建的HFF细胞酵母双杂交cDNA文库具有较高的库容量和重组率,可用于弓形虫蛋白与HFF宿主细胞互作蛋白的筛选。     

RNA interference (RNAi) of Ufd1 protein can sensitize a hydroxycamptothecin-resistant colon cancer cell line SW1116/HCPT to hydroxycamptothecin

OBJECTIVE: To investigate whether RNA interference (RNAi) of the ubiquitin fusion‐degradation 1‐like protein (Ufd1) could sensitize hydroxycamptothecin (HCPT)‐resistant colon cancer cell line SW1116/HCPT to the cytotoxic effect of HCPT. METHODS: SW1116/HCPT cells were transfected with plasmids containing Ufd1‐specific small interfering RNA (siRNA) (Ufd1 knockdown cells) and non‐specific siRNA (control cells). A drug sensitivity analysis, 3‐(4,5)‐dimethylthiahiazol (‐z‐y1)‐3,5‐di‐ phenytetrazoliumromide (MTT) assay was performed on Ufd1 knockdown cells and control cells. After treating the cells with HCPT, a caspase‐3 and caspase‐4 activity assay, flow cytometric analysis and Western blot for detecting phosphorylated c‐Jun N‐terminal kinase (p‐JNK), phosphorylated protein kinases B (p‐Akt), P53, ubiquitin, GADD 153 and Grp78/Bip were performed. RESULTS: According to the MTT assay, the survival rate of knockdown cells was significantly lower than that of the control cells (P < 0.01). Both caspase‐3 and caspase‐4 activity assay showed higher activation level in Ufd1 knockdown cells than that in the control cells (P < 0.01). A flow cytometric analysis revealed more severe S‐phase arrest in the Ufd1 knockdown cells than that in the control cells (P < 0.05). The Western blot showed that increasing the concentration of HCPT resulted in a higher expression level of p‐JNK, P53, ubiquitin, GADD 153 and Grp78/Bip in the Ufd1 knockdown cells than that in the control cells. CONCLUSION: Ufd1 plays a key role in HCPT resistance of SW1116/HCPT and RNAi of Ufd1 can sensitize SW1116/HCPT to the cytotoxic effect of HCPT via strengthening the activation of caspase‐3 pathway and disturbing endoplasmic reticulum functions.     

人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞的蛋白质组学研究

目的对结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞（SW1116／HCPT）及其亲代细胞（SW1116）进行蛋白质组学比较研究，探讨肿瘤细胞的多药耐药机制。方法培养羟基喜树碱多药耐药细胞和亲代细胞，提取蛋白质，以固相pH梯度等电聚焦为第一向，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向进行双向电泳，图像分析软件分析电泳图谱，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或基质辅助激光解吸电离飞行时间／飞行时间串联质谱鉴定蛋白质。结果发现9个蛋白质点在SW1116／HCPT细胞中表达量发生改变，4个蛋白质点表达量增加，5个蛋白质点表达量减少。质谱鉴定了6个蛋白质点分别为：琥珀酸脱氢酶复合物（亚单位A）、3-磷酸甘油醛脱氢酶、泛素融合降解1相似蛋白、胞核氯离子通道蛋白、β-微管蛋白和ORF蛋白。结论该研究有助于深入理解结肠癌羟基喜树碱多药耐药机制，并有望在新型耐药逆转剂的开发上发挥作用。     

人胰腺癌抑制消减cDNA文库的构建

目的应用抑制消减杂交技术(SSH)构建胰腺癌和正常胰腺组织间差异表达的抑制消减cDNA文库。方法分别提取胰腺癌(tester)和癌旁正常胰腺组织(driver)中的总RNA和mRNA．合成双链cDNA，经RsaI酶切后，将胰腺癌双链cDNA分为两组，分别加上不同的接头，再与正常胰腺组织cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR，分离出胰腺癌差异表达基因的cDNA片段。将该差异表达片段克隆至T／A载体，并转化大肠杆菌TOP10F’，经蓝白斑筛选后，再用PcR方法筛选阳性克隆，从而构建胰腺癌抑制消减cDNA文库。结果文库扩增后得到257个白色克隆，随机挑取50个阳性克隆进行PCR扩增分析，其中47个克隆有插入片段．克隆阳性率为94％，片段大小主要集中在300～600bp之间。结论成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库，为进一步筛选、克隆胰腺癌特异性表达基因奠定了基础。     

人胰岛细胞瘤cDNA文库的构建

采用一种简单高效的互补脱氧核糖核酸（ｃＤＮＡ）克隆技术制备人胰岛细胞瘤的ｃＤＮＡ文库。方法的主要过程如下：以人胰岛细胞瘤的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ为模板，以含ＮｏｔＩ切点的ｏｌｉｇｏ－（ｄＴ）１５为引物，在反转录酶作用下合成第一股单链ｃＤＮＡ；用Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ除去Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋－ＲＮＡ，并以Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ和Ｔ４ＤＮ     

Screening of genes of proteins interacting with p7 protein of hepatitis C virus from human liver cDNA library by yeast two-hybrid system

AIM: To investigate the biological function of p7 protein and to look for proteins interacting with p7 protein in hepatocytes. METHODS: We constructed p7 protein bait plasmid by cloning the gene of p7 protein into pGBKT7, then transformed it into yeast AH109 (a type). The transformed yeast was mated with yeast Y187 (a type) containing liver cDNA library plasmid, pACT2 in 2xYPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing x-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from blue colonies, we performed sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Fifty colonies were selected and sequenced. Among them, one colony was Homo sapiens signal sequence receptor, seven colonies were Homo sapiens H19, seven colonies were immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat, three colonies were spermatid peri-nuclear RNA binding proteins, two colonies were membrane-spanning 4-domains, 24 colonies were cancer-associated antigens, four colonies were nucleoporin 214 ku and two colonies were CLL-associated antigens. CONCLUSION: The successful cloning of gene of protein interacting with p7 protein paves a way for the study of the physiological function of p7 protein and its associated protein.     

苦参碱诱导人结肠癌SW1116细胞凋亡及机制探讨

目的观察苦参碱（Ma）诱导结肠癌SW1116细胞凋亡的作用，并探讨其机制。方法采用不同浓度的Ma处理SW1116细胞48h，并设正常对照组，MTT法检测细胞增殖抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，半定量RT-PCR检测Fas和Bax mRNA表达水平。结果与正常对照组相比，不同浓度Ma处理的SW1116细胞抑制率、胞凋亡率显著升高（P均〈0.01），Fas和Bax mRNA表达上调（P〈0.05，P〈0.01）。结论Ma可诱导SW1116细胞凋亡，其作用机制可能与上调Fas和Bax mRNA表达有关。     

应用芯片技术筛查人结肠癌羟基喜树碱多药耐药相关微RNA的研究

目的 探讨新一类调控分子微RNA(miRNA)在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中的作用,为逆转肿瘤化学治疗的多药耐药性提供新的靶点.方法 运用miRCURYTM LNA Array V8.1版芯片检测人结肠癌细胞SW1116和人结肠癌羟基喜树碱多药耐药细胞SW1116/HCPT的miRNA表达谱,筛选出具有表达差异的miRNA(2倍以上).通过PiTcar,Targetscan,MIRanda等算法在线搜寻差异表达miRNA的靶基因.利用茎环特异miRNA引物反转录特异的miRNA,并采用荧光定量PCR法对个别差异表达的miRNA进行验证.结果 用于芯片分析的总RNA的吸光度比值分别为1.93(SW1116)和1.94(SW1116/HCPT).琼脂糖变性凝胶电泳进一步验证总RNA质量符合芯片要求.通过芯片检测后发现SW1116/HCPT相比SW1116表达下调的miRNA共有28条,表达上调的有36条.根据靶基因预测结果,我们选取其中2条表达下调hsa-miR-452,hsa-miR-373*和1条表达上调hsa-miR-506进行荧光定量PCR验证,hsa-miR-452和hsa-miR-506的结果与芯片相符合,但hsa-miR-373*表达量不足以由荧光定量PCR检测出.结论 miRNA表达量的改变可能在人结肠癌羟基喜树碱多药耐药中起有关键作用.