人免疫缺陷病毒Ⅰ型gag、env、rev mRNA检测

目的动态检测人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)基因gag、env、rev mRNA水平.方法将插入有HIV-1竞争模板的pSPI质粒DNA转化入感受态菌STBL-2,进行扩增.以T7 RNA聚合酶体外转录出HIV-1 mRNA竞争模板.用3对引物对HIV-1 RNA标本进行定量竞争聚合酶链反应(QC-RT-PCR), 检测HIV-1 gag、env、rev mRNA 水平.结果 HIV-1 ⅢB感染的标本中,HIV-1 gag、env和rev mRNA的水平分别为36 000拷贝/μl,9 800拷贝/μl和9 100拷贝/μl.此方法可动态定量检测HIV-1 gag、env、rev mRNA水平.结论该方法简便易行,费用低廉,适用于实验室HIV致病机理、药物筛选和病毒复制状况的研究.     

人类免疫缺陷病毒1型感染基因诊断方法的建立

目的 建立人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因诊断方法。方法 随机选取80份全国送检的已确认的HIV阳性样品，从健康献血员中选取40份HIV阴性样品。分别提取人DNA和病毒RNA，再分别扩增HIV-1的gp41、pol和gag各基因区的3套反应系统，进行巢氏聚合酶链反应(nPCR)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。将结果与血清学方法比较，观察结果是否一致。同时检测3套反应系统的敏感性、重复性和对HIV-1各亚型参考病毒株的扩增情况。结果 用3套反应系统对80份阳性样本进行nPCR检测的阳性率为：gp41反应系统88．8％；pol反应系统83．8%；gag反应系统81．3％；3套系统联合应用检出率90.0％。用RT-PCR检测阳性率为：gp41反应系统96．3％；pol反应系统91．3％；gag反应系统95．0％；3套反应系统联合应用检出率可达98．8％。阴性样品扩增均阴性，特异性为100％。3套反应系统不但可扩增HIV-1型M组的A、B、C、D、CRF01-AE、F、G、H亚型，还可扩增其N和O组毒株，且与HIV-2无交叉反应。nPCR最低检测限为1拷贝／PCR。gag和pol反应系统RT-PCR最低检测限为750拷贝／ml；gp41反应系统最低检测限为150拷贝／ml。nPCR和RT一：PCR扩增gp41、pol和gag基因区的重复性分别为：93．3％、90．0％、86．70h，和100%、96．7％、100％。结论 建立的HIV-1基因诊断方法敏感性、特异性和重复性较好，且成本低廉，适合我国HIV检测实验室应用。     

人类免疫缺陷病毒HIV-1基因分型方法的初步构建

目的 建立一种合理、详尽、可行的HIV-1基因分型方法。方法 采集南昌地区部分男性性接触人群(MSM)人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者血浆,测量HIV病毒载量。提取其病毒RNA,设计引物并对HIV的Env区和Gag区进行反转录-聚合酶链反应。对扩增后的cDNA进行测序,比对序列并分别构建Env区和Gag区的分子进化树,确定样本的基因亚型,并分析p V3环氨基酸序列特征。结果 本研究的3例样本中,1例样本的HIV病毒载量为43.9 copies/ml,其余2例均20 copies/ml。3例样本经核酸序列分析,均鉴定为CRF01_AE亚型。结论 此HIV-1基因分型方法合理、详细,可为国内HIV分子流行病学研究提供一些参考。     

艾滋病与HIV的职业暴露后防护

艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Vires，HIV)引起的一种严重的传染病。HIV病毒是一种RNA(核糖核酸)逆转录病毒，属慢病毒(Lentivirinae)。HIV主要型别为HIV-1和HIV-2，我国艾滋病大多由HIV-1引起。     

人免疫缺陷病毒I型gag、env、rev mRNA检测

目的：动态检测人免疫缺陷病毒I型（HIV－1）基因gag,env,rev mRNA 水平。方法：将插入有HIV－1竞争模板的pSPI质粒DNA转化入感受态菌STBL－2，进行扩增，以T7RNA聚合酶体外转录出HIV－1 mRNA竞争模板，用3对引物对HIV－1 RNA标本进行定量竞争聚合酶链反应（QC－RT－PCR），检测HIV－1 gag,env,rev mRNA水平。结果：HIV－1 Ⅲ B感染的标本中，HIV－1,gag,env和rev mRNA的水平分别为36000拷贝／μl，9800拷贝／μl和9100拷贝／μl，此方法可动态定量检测HIV－1 gag,env,rev mRNA水平。结论：该方法简便易行，费用低廉，适用于实验室HIV致病机理，药物筛选和病毒复制状况的研究。     

不同人类免疫缺陷病毒2型检测方法的比较研究

目的通过随访调查16例人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2）可疑感染者，初步评价HIV一2的几种检测方法。方法从贵州省采集既往经HIV-1／2免疫印迹（WB）试验检测出现HIV-2指示带的16份受检者的全血样品，进行HIV-2抗体和核酸检测。血浆中的抗体用HIV-1／2ELISA初筛一复检，其中阳性样品再分别用HIV-1／2线性免疫试验（LIA）和HIV-2WB检测。外周血单核细胞（PBMC）中的前病毒DNA用HIV-2巢式PCR检测。结果16份血浆样品经HIV-1／2ELISA筛查均为HIV抗体阳性；用HIV-1／2 LIA检测，全部为HIV-1抗体阳性，15份为HIV-2抗体阴性、1份不确定；用HIV-2WB检测，有3份为HIV-2抗体阳性、13份不确定。由于这批样品的采样时间距首次检测至少1年以上，可以排除窗口期感染，上述检测结果不确定的受检者均可判为HIV-2抗体阴性。此外，用巢式PCR检测所有PBMC样品均为HIV一2核酸阴性。结论16例受检者全部为HIV-1而非HIV-2感染，HIV-1／2uA的抗体检测结果与HIV-2核酸检测结果基本相符，而HIV-2WB则产生了大量的不确定甚至假阳性结果。     

HIV基因分型以及耐药性的研究进展

人类免疫缺陷症病毒( HIV)是艾滋病的主要致病因子,无论是无症状HIV感染者还是有症状的艾滋病患者,都有持续的HIV复制[1]。体内的HIV病毒每天进行着107~108次病毒复制,约产生1010新的病毒颗粒。 HIV基因组由将近1万个核苷组成,由于HIV酶缺乏纠错能力,每天至少有104~105子代HIV出现单位点突变。检测结果证实,在尚未开始抗病毒治疗的感染者体内已存在耐药变异。美国和西欧最新研究报道,10.7%~27.6%的新感染者为HIV-1耐药株感染,耐药变异是导致临床抗病毒治疗失败的主要原因[2]。全国流行病学调查结果显示,中国是HIV-1基因亚型最多的国家之一[3]。 HIV-1基因亚型分析在HIV-1的分子流行病学调查、诊断、临床和药物治疗及其疫苗研制等方向均有重要作用[4]。     

皖南地区HIV感染者中HCV感染状况的调查

目的调查皖南地区人类免疫缺陷病毒(HIV)-1感染者中丙型肝炎病毒(HCV)的混合感染率,探讨HCV对HIV-1感染者CD4+T细胞计数的影响。方法对皖南地区234例HIV-1感染者,分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中HCV-Ab、聚合酶链反应(PCR)检测血清和外周血单个核细胞(PBMC)中的HCVRNA含量;同时采用流式细胞技术检测外周血CD4+T细胞亚群数量。结果 234例HIV-1感染者中,性途径感染占83.7%(男男途径占48.7%;异性途径占35.0%);吸毒者占4.2%;住院患者占2.6%;母婴传播占2.1%。HCV-Ab阳性30例,占12.8%;血清HCV-RNA阳性27例,占11.5%,其中26例均为血清HCV-Ab阳性,1例为HCV-Ab阴性,其血清HCV-RNA为3.60×103拷贝/mL;PBMC中HCV-RNA阳性14例,占6.0%;以3种指标任一阳性计算HCV感染率,则HIV-1 HCV合并感染率为13.2%。CD4+T细胞计数在HIV HCV合并感染者平均为322个/mL,HIV单纯感染者为477个/mL。结论皖南地区HIV-1 HCV混合感染率为13.2%,筛查HIV感染时应加强对HCV的检测,有助于HCV感染的早期诊断和治疗;HIV感染者中HCV的监测,须考虑血清和PBMC中HCV-RNA情况。     

基于阻断膜金属蛋白酶TRABD2A的HIV储存库检测方法的建立

目的探究人源化膜金属蛋白酶——含有TRAB结构域的蛋白2A(TRABD2A)单克隆抗体对接受联合抗逆转录病毒疗法(cART)的人免疫缺陷病毒(HIV-1)感染者储存库细胞的作用效果, 建立基于TRABD2A阻断抗体的全新HIV-1储存库检测方法。方法 2021年5—12月于中国医科大学附属第一医院收集研究对象51例。其中健康者2名, 接受cART的HIV-1感染者(cART组)41例, 未接受cART的HIV-1感染者(no-cART组)8例。采用噬菌体展示库技术构建人源化TRABD2A单克隆抗体, 分别处理HIV-1感染者、未接受cART的HIV-1感染者及健康对照者的外周血单个核细胞(PBMC)和CD4+T淋巴细胞, 利用荧光素酶报告系统、单分子免疫阵列检测技术等方法检测细胞培养上清中病毒含量, 同时使用流式细胞术、荧光实时定量聚合酶链式反应检测处理后细胞的活化和病毒基因表达情况, 比较不同处理组之间病毒释放量和表面活化标志CD25、CD69、HLA-DR(人类白细胞DR抗原)表达量的差异。结果接受cART的HIV-1感染者的PBMC经人源化TRABD2A单克隆抗体处理后检测HIV...     

164例HIV-1感染者梅毒RPR出现生物学假阳性情况分析

目的 了解性病门诊人类免疫缺陷病毒1亚型(HIV-1)感染者梅毒快速血浆反应素试验(RPR)出现生物学假阳性(BFP)情况。方法 收集该院性病门诊中已确诊HIV-1感染者,采用梅毒螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS-IgG)、RPR进行检测,对RPR出现BFP的HIV-1感染者,根据抗病毒治疗情况分成已治疗和未治疗两组,检测病毒载量及CD4⁺T细胞检测并进行比对,观察抗病毒治疗情况对RPR出现BFP有无影响,1年后随访检测RPR,分析RPR出现BFP的临床转归情况。结果 2 146例已确诊HIV-1感染者中RPR出现BFP的有164例;4 072例HIV抗体阴性者中RPR出现BFP的有22例,HIV-1感染者和HIV阴性者BFP发生率差异有统计学意义(P<0.01)。164例RPR出现BFP的患者中未进行抗病毒治疗140例,病毒载量基线HIV RNA 3.50(1.48～6.15)lg copies/mL,CD4⁺T细胞计数344.50(239.75～480.25)mm³;已进行抗病毒治疗24例,未检测到HIV R...     

多重定量PCR法同步检测HBV、HCV和HIV-1在血液筛查中的优化及应用

目的 初步探讨多重定量聚合酶链反应（PCR）同步检测乙型肝炎病毒（HBV） DNA,丙型肝炎病毒（HCV） RNA及人类免疫缺陷病毒（HIV）-1 RNA在血液筛查中的应用前景.方法 选择2012年8月至12月,于孝感市中心血站志愿献血的合格献血者血样中,经2次酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBV表面抗原（HBsAg）、抗HCV及抗HIV-1,检测结果均呈阴性的4 800份血样为研究对象.采用全自动核酸混合提取仪对该4 800份血样进行核酸提取,然后利用多重定量PCR方法对血样中HBV、HCV及HIV-1进行同步扩增检测.采用中国药品和生物制品检定所提供的HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA标准参考品,检测多重定量PCR的灵敏度,并与单重定量PCR的灵敏度进行比较.在HBV、HCV及HIV-1 3者中任意1种病毒基因组浓度较高的条件下,对多重定量PCR检测另2种低浓度病毒基因组的能力进行评估.结果 增加多重定量PCR中c-MMLV逆转录酶和Hot Taq酶的用量,并适量加入单链结合蛋白（SSB）,可使其扩增效率提升至单重定量PCR扩增水平.本组4 800份血样中,经多重定量PCR检测出3份HBV DNA阳性样品,ELISA漏检率为0.062 5％,未发现HCV RNA和HIV-1 RNA阳性样品;多重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为115 IU/mL、376 IU /mL和232 IU /mL;单重定量PCR检测HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA在95％置信区间的灵敏度浓度分别为51 IU /mL、94 IU /mL和78 IU/mL.结论 本研究初步建立了对献血者血液同时进行HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA检测的多重定量PCR检测方法;该检测体系经过进一步优化后,有望应用于临床大规模血液病毒筛查.     

建立用于检测H IV-1的基于核酸序列扩增的酶联免疫吸附测定法

目的：建立用于检测 HIV-1的基于核酸序列扩增的酶联免疫吸附测定（NASBA-ELISA）法。方法根据 HIV-1基因组长末端重复序列设计引物对 HIV-1 RNA进行基于核酸序列扩增（NASBA）,结合微孔板中液相杂交和酶标显色反应检测核酸扩增物,并对该检测方法的灵敏度、特异度及其对临床样本的检测结果进行评价。结果该方法可检测到0．1 fg/μL的RNA,且对 HIV-1具有特异性。在120例临床样本的检测中,其检测准确度高于常规的实时荧光定量反转录聚合酶链反应（fqRT-PCR）法。结论 NASBA-ELISA方法能灵敏并特异地检测 HIV-1。     

国产全自动HIV-1核酸定量检测试剂盒的性能评价

目的探讨国产NEPG全自动人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核酸定量检测试剂[荧光聚合酶链反应(PCR)法](简称国产NEPG HIV-1试剂)临床应用的可行性。方法采用灵敏度/定量参考品评估国产NEPGHIV-1试剂的定值准确性及灵敏度。收集210例临床血液样本,以cobas AmpliPrepcobas TaqManHIV-1 Testv2.0试剂盒(简称进口HIV-1试剂)为参比试剂,评估2种试剂检测结果的一致性。结果低、中、高浓度样本测定结果的绝对偏差分别为0.05、0.08、-0.06,均符合要求(绝对偏差≤±0.5个对数数量级)。国产NEPG HIV-1试剂的灵敏度为50 IU/mL(约30拷贝/mL)。国产NEPG HIV-1试剂与进口HIV-1试剂定性结果的符合率均为100.00%,定性结果一致(Kappa值=1.00)。国产NEPG HIV-1试剂检测HIV-1载量结果与进口HIV-1试剂比较差异无统计学意义(P>0.05),2种试剂的相关性良好(r=0.953),低值样本的相关性也较好(r=0.823)。结论国产NEPG HIV-1试剂的灵敏度和准确性均符合临床要求,定量及定性检测结果与进口HIV-1试剂一致,且相关性良好。     

逆转录聚合酶链反应在艾滋病患者HIV-1毒株env基因的序列测定和亚型分析中的应用

目的 了解深圳地区艾滋病患者中Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)毒株各亚型的感染情况，及其不同亚型对患者疾病进程的影响。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法对26例艾滋病患者血浆中的HIV-1毒株的env基因片段进行扩增，并对扩增片段进行序列测定和分析，同时检测其CD4^ 细胞计数与血浆病毒载量。结果 基因系统树显示深圳地区26例艾滋病患者的HIV-1毒株env基因序列，B亚型12例，其中1例与欧美B亚型序列十分接近，11例与中国云南B亚型序列十分接近；循环重组亚型AE(CRFD1-AE)13例，均与泰国AE亚型序列十分接近。比较B、AE亚型感染患者的CD4细胞计数与病毒载量之间的差异无统计学意义。结论 深圳地区艾滋病患者中以HIV-1毒株以B亚型和循环重组亚型AE最常见，尚未观察到B、AE亚型对艾滋病进展的影响。     

中国HIV/AIDS患者tat第一外显子基因变异特点与疾病进展关系的研究

目的了解中国HIV／AIDS患者tat第一外显子的基因序列的特征和变异特点，探讨其与HIV-1感染者疾病是展之间的关系。方法选取40例辽宁和吉林HIV感染后临床进程不同的人抽取外周血，提取核酸，用套式聚合酶链反应（PCR）扩增HIV-1的tat基因，并进行核酸测序，生成系统进化树。结果长期不进展者、无症状感染者及AIDS患者的tat基因序列与相应亚型的国际流行株序列比较，各组均存在与流行株序列不一致的氨基酸变异，而且某些变异具有组间特异性。在系统树分析中各组聚集在一起，呈混合分布。结论中国HIV／AIDS患者tat第一外显子一些位点的基因变异可能与疾病进展有关，某些位点的基因变异可能会降低病毒的复制能力。     

石家庄市人类免疫缺陷病毒Ⅰ型流行株基因序列测定和亚型分析

目的了解石家庄市人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)流行株的亚型及分布情况。方法184例HIV-1抗体阳性者抗凝全血中提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应(nested-PCR)扩增病毒膜蛋白env基因的C2-V3区并进行序列测定,与国际标准参考序列比较确定亚型。结果148例样品扩增阳性并得到相应序列,经进化树分析,45例为欧美B,37例为CRF07-BC,35例为泰国B(B’),25例为CRF01-AE,C和CRF02-AG各2例,CRF03-AB和CRF11-CPX各1例。结论石家庄市目前主要流行B、CRF07-BC、B’和CRF01-AE亚型。性传播以B、CRF01-AE亚型为主;注射吸毒以CRF07-BC亚型为主;既往采输血感染及其造成的家庭内传播全部是B’亚型。     

重组HIV抗原和多表位抗原的研究

目的研究重组HIV病毒系列抗原,以满足HIV各种抗体检测试荆研究的需要。方法从HIV-1／2不同抗原中精选出优势抗原片段,分别用PCR方法从编码全长HIV-1基因的pBHIOR2／HIV质粒中扩增出HIV-1／gpl20、HIV-1／GP41及HIV-1／“M”优势抗原表位,用基因合成法,合成HIV-1／“0”和HIV-2／gp36基因,将获得的各基因片段插入到pBVIL1载体,使其在HB101中表达。利用载体pBVILl具有使小分子肽基因间可方便连接的特点,选择优势抗原表位进行连接和嵌合表达。结果与结论所克隆的单片段及嵌合抗原均在大肠杆菌中获得了高效的表达,纯化的单片段及多表位嵌合抗原经用间接EIA法对HIV阴性和阳性血清测定,表明抗原已满足抗体检测试剂盒的要求。得到的单片段抗原可用于LIA测定,而多表位嵌合抗原,可用于EIA筛检试剂。     

我国237例未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中原发性基因型耐药监测和病毒亚型分析

目的 分析237例HIV/AIDS患者中原发性耐药的发生率和病毒亚型分布情况.方法 从河南、云南、上海等20个地区采集237例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者血浆HIV-1进行基因测序,通过病毒亚型分析软件REGA HIV-1 Subtyping Tool确定测序样本的HIV-1亚型,并与斯坦福大学HIV耐药数据库比对确定测序样本HIV-1耐药相关突变位点.采用b-DNA方法检测患者血浆病毒载量,采用流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞计数.结果 237例未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者感染的HIV-1毒株分布为A1、B、C、CRF01-AE、CRF02-AG、CRY7-BC、CRF08-BC、CRF12-BF、G等9个不同亚型,可能的感染时间分布在1990-2006年.237例患者中仅有3例分别对核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药、蛋白酶类抑制剂低度耐药和非核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药,原发性耐药的发生率为1.3%(3/237).结论我国部分地区未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中HIV-1原发性基因型耐药的发生比例处于较低水平,病毒亚型分布在9个亚型.     

HIV1＋2型抗体化学发光免疫分析试剂盒的研制

[目的]建立：险测HIV1＋2型抗体化学发光免疫分析方法并研制其试剂盒。[方法]应用HIV-1的gp41和gp120．HIV-2的gp36蛋白混合包被化学发光微孔板作为固相抗原；用辣根过氧化物酶（HRP）标记以上抗原，应用含Luminol及其增强剂的化学发光底物作示踪剂，通过条件优化建立检测血清中HIV-1＋2型抗体的双抗原夹心化学发光免疫分析法。应用该方法制备HIV1＋2抗体化学发光免疫分析试剂盒三批，分别检测中国药品生物制品检定所（中检所）HIV抗体国家参考品，并与国内市场主要产品进行对比。[结果]建立了HIV1＋2型抗体化学发光免疫分析试剂盒（双抗原夹心法）。用中检所HIV抗体国家参考品检测，该方法研制的三批试剂盒均符合质量标准。与国内知名厂家的HIV-ELISA试剂盒比较，该方法所研制的试剂盒在灵敏度和精密性上较好。检测196份HIV1／2感染血清，226份其他疾病患者血清和正常人血清，阳性和阴性符合率均100％，与HIV-ELISA试剂相关性达0．994。三批变异系数均小于10％。试剂盒于37℃放置6d后，检测结果的阴阳性判断不受影响。[结论]该法特异性强，灵敏度高，精密性及稳定性好，适用于献血员的筛查和临床HIV感染的检测。     

干血斑样本用于人类免疫缺陷病毒1型前病毒基因诊断的研究

目的研究干血斑（DBS）样本用于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染前病毒DNA基因诊断的可行性。方法采集59例静脉吸毒HIV-1感染者和22名HIV-1阴性健康人EDTA抗凝静脉全血5ml，保存全血1ml，另用50μl制备干血斑样本后，分离血浆。QIAamp Blood Mini试剂盒和10％Chelex 100树脂分别提取全血和干血斑中细胞DNA。Roche Cobas Amplicor逆转录聚合酶链反应检测HIV-1感染者血浆病毒载量。HIV-1Env基因Gp41区，gag基因，pol基因分别用2对外侧和内侧引物，按照套式PCR方法，进行扩增。以HIV-1任何两个基因区扩增结果组合判断HIV-1感染。结果在重复2～3次的前提下，59份DBS样本HIV-1感染基因诊断敏感度93％（95％可信区间89％～97％），34份全血样本94％（95％可信区间89％～98％）。疋。检验显示，两种样本用于HIV-1基因诊断时差异无统计学意义。22份两种阴性样本特异性均为100％（95％可信区间95．93％～100％）。8份血浆病毒载量（VL）〉4．0 Log的DBS样本用于基因诊断的可重复性和HIV-1感染样本检出率优于5份VL〈4．0 Log样本。18对全血和DBS样本HIV-1基因诊断一致性分析，符合率94％，一份DBS样本HIV-1特异三个基因片段均未扩增。结论干血斑样本易采集，便于运输，保存条件低，费用低廉，用于HIV-1基因诊断时与全血样本检测结果无显著性差异，病毒载量〈4．0 Log的样本，为增加检出概率需要对样本重复检测。DBS样本HIV-1基因诊断方法适合于无条件立即处理血样本的偏远地区或采样困难的感染者的诊断，及HIV-1母婴垂直传播研究中婴幼儿感染的早期诊断。