人类14-3-3ζ和GCH1蛋白相互作用的初步研究

目的 寻找人类14-3-3ζ蛋白的相互作用蛋白,为进一步揭示14-3-3ζ的作用机理提供线索.方法 以14-3-3ζ为"诱饵",利用酵母双杂交系统筛选人脑cDNA文库得到"猎物"蛋白,通过GST pulldown技术和哺乳动物细胞内免疫共沉淀技术验证14-3-3ζ和"猎物"蛋白的特异性结合.结果 首次利用酵母双杂交cDNA文库筛选技术发现了14-3-3ζ能够与GTP环化水解酶Ⅰ(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)相互作用,并通过了体内和体外的蛋白质结合实验证实了这两个蛋白质之间的特异性相互作用.结论 发现并验证了14-3-3ζ与GCH1之间的蛋白质相互作用,为进一步深入研究这两种蛋白质的功能及所引起的相关疾病的发病机理提供了新的线索.     

参麦注射液改善3T3-L1细胞的胰岛素抵抗

 目的: 探讨参麦注射液改善3T3-L1脂肪前体细胞胰岛素抵抗模型的效果及其作用机制。方法:使用地塞米松等将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,使用油红O染色法检测脂肪细胞分化情况;用胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞以建立胰岛素抵抗模型,并使用葡萄糖氧化酶法检测细胞上清液中葡萄糖浓度,以评价模型建立情况。将建立胰岛素抵抗的细胞分为空白对照组、10 μmol/L罗格列酮阳性对照组、25 g/L参麦组和50 g/L参麦组。MTT检测各组药物作用8、16、24和36 h后的细胞活力。药物作用8、16和24 h后测定细胞上清液葡萄糖浓度。免疫印迹检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、AKT和磷酸化AKT(p-AKT)在各组中的蛋白水平。结果:成功建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型,葡萄糖浓度数据显示参麦注射液(25、50 g/L)可以改善胰岛素抵抗并可以明显增加3T3-L1细胞GLUT4、PI3K及p-AKT的蛋白水平。结论:参麦注射液可以改善3T3-L1胰岛素抵抗细胞的葡萄糖利用,并且与增加GLUT4、PI3K及p-AKT的蛋白水平有关。     

14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质和PC12细胞中的分布

本实验采用免疫组织化学、免疫荧光组织化学和免疫印迹技术对14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质(SN)和PC12细胞中的分布情况进行了研究。在大鼠黑质内,免疫组化和免疫荧光结果显示14-3-3蛋白的γ、ε、θ、ζ四个亚型呈阳性反应,而β和η亚型未见明显阳性反应;在PC12细胞中,6个亚型均呈免疫荧光阳性反应;在黑质中,Westernblot结果显示14-3-3各亚型蛋白表达的相对水平为ε>γ>ζ>θ;而在PC12细胞中各亚型的表达水平为γ>ε>β>ζ>η>θ。本实验的结果提示ε、γ、ζ和θ亚型可能在黑质中发挥主要作用。本研究的结果为研究14-3-3蛋白在Parkinson病中的作用提供了形态学依据。     

与14-3-3ζ相互作用的蛋白Polo样激酶1的筛选与鉴定

目的:应用酵母双杂交系统筛选与14-3-3ζ相互作用的蛋白,进一步鉴定其与Polo样激酶1(Plk1)相互作用。方法:构建pGBKT7-14-3-3ζ诱饵表达载体,筛选HeLa细胞cDNA文库中与14-3-3ζ相互作用蛋白,进一步通过共转酵母、免疫荧光以及外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验验证两者的相互作用。结果:通过酵母双杂交系统筛选出的阳性相互作用蛋白中包括Plk1,进一步通过共转酵母,外源性和内源性的细胞免疫共沉淀实验证实两者的相互作用,免疫荧光实验证实两者共定位于有丝分裂过程中胞质分裂期的中体。结论:Plk1是高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在中体的成熟,有丝分裂期染色体的分离,胞质分裂以及DNA的损伤应答等环节发挥重要作用,其与14-3-3ζ的相互作用为14-3-3蛋白家族参与有丝分裂(M期)的调控提供了直接证据。     

14-3-3ζ蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

为了探讨14-3-3ζ蛋白在中枢神经系统内的分布,本文采用纯化的基因重组型14-3-3ζ蛋白免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗14-3-3ζ蛋白单克隆抗体;Western blot及免疫组织化学法鉴定抗体。结果显示:制备的单克隆抗体能特异性识别基因重组14-3-3ζ蛋白和大鼠脑匀浆32kD蛋白。免疫组化染色结果显示,14-3-3ζ蛋白在大鼠中枢神经系统广泛分布,在皮层、海马、杏仁核和基底前脑的免疫阳性染色较强,免疫阳性产物位于神经元胞浆内。本研究结果提示,14-3-3ζ蛋白可能具有多样化的生理功能。     

14-3-3zeta在T1期非小细胞肺癌中的表达及其临床病理意义

目的探讨14-3-3ζ在T1期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床病理意义。方法采用免疫组化、免疫印迹及RT-PCR技术检测110例T1期NSCLC及癌旁正常肺组织中14-3-3ζ蛋白的表达。结果 T1期NSCLC中14-3-3ζ蛋白及mRNA表达水平均较正常肺组织明显增强,14-3-3ζ的表达与患者的年龄、性别及病理学分型不相关。但随着肺癌分化程度的降低,14-3-3ζ的表达逐渐增强。在淋巴结转移阳性的癌组织中,14-3-3ζ表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。生存曲线分析结果显示14-3-3ζ表达阴性患者的5年生存率及平均生存时间均高于表达阳性者。结论 14-3-3ζ与肺癌的分化程度、淋巴结转移及患者预后密切相关,提示14-3-3ζ有可能作为判断T1期NSCLC发展与预后的生物学指标之一。     

14-3-3蛋白的研究进展

14-3-3是一个在真核生物中广泛表达的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,通过磷酸化丝/苏氨酸作用与靶蛋白或靶蛋白的2个结构域结合。7种不同亚型的高度保守的14-3-3蛋白与人类细胞中多种不同的信号通路有密切的关系。14-3-3通过调节靶蛋白间的相互作用在信号转导途径中发挥调控作用。     

经典型蛋白激酶Cγ及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺缺血损伤中的作用

目的 探讨经典型蛋白激酶Cγ (cPKCγ)及其相互作用蛋白14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元氧-糖剥夺(OGD)缺血损伤中的作用。方法 利用cPKCγ基因敲除(cPKCγ^-/-)小鼠和原代培养脑皮层神经元1h OGD/24h复糖复氧(R)模拟离体细胞缺血模型,给予14-3-3γ抑制剂R18干扰,采用免疫共沉淀(Co-IP)、蛋白免疫印迹(Western blotting)和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,验证cPKCγ与14-3-3γ的相互作用及其对原代培养小鼠脑皮层神经元1h OGD/24h R缺血损伤的影响。结果 Co-IP结果证明,14-3-3γ与cPKCγ在小鼠脑皮层中确实存在相互作用;1h OGD/24h R处理使原代培养野生型(cPKCγ ^+/+)小鼠脑皮层神经元内cPKCγ蛋白水平明显降低,而14-3-3γ蛋白水平显著增加(P<0.05,每组n=6);对于原代培养cPKCγ^-/-小鼠脑皮层神经元,尽管14-3-3γ表达水平明显高于cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元,但1h OGD/24h R处理却使14-3-3γ表达水平显著降低(P<0.05, 每组n=6),提示cPKCγ可影响神经元内14-3-3γ的表达水平。此外,MTT结果表明,14-3-3γ抑制剂R18 (100μmol/L)可显著加重1h OGD/24h R处理原代培养cPKCγ^-/-和cPKCγ^+/+小鼠脑皮层神经元的缺血损伤(P<0.05,每组n=6)。结论 cPKCγ与14-3-3γ在小鼠脑皮层神经元内存在相互作用并影响14-3-3γ的蛋白表达水平,cPKCγ和14-3-3γ在原代培养小鼠脑皮层神经元缺血/低氧损伤中起保护作用。     

大鼠心肌细胞自噬H9C2/GFP-LC3稳定株的构建

目的:在大鼠心肌细胞H9C2(2-1)中建立表达绿色荧光蛋白融合微管相关蛋白3(GFP-LC3)的稳定细胞株,为研究心肌细胞自噬提供合适的细胞模型。方法:将表达增强的绿色荧光蛋白融合微管相关蛋白3的质粒(pEGFP-LC3)瞬时转染人胚肾-293T细胞(HEK-293T),通过荧光观察和免疫印迹对质粒进行鉴定;将质粒用同样的方法转染H9C2(2-1)细胞,G418筛选出稳定表达GFP-LC3的细胞株,通过观察荧光和免疫印迹检测GFP-LC3在H9C2中的表达;稳定细胞株在缺氧1 h复氧0、6、12、48 h和60 h的模型中,荧光显微镜观察GFP在细胞质中的表达,免疫印迹检测内源性LC3的变化;确定荧光及内源性LC3的高表达时相,用3-甲基腺嘌呤(3MA)进行自噬抑制后观察荧光及内源性LC3蛋白表达情况。结果:荧光观察和免疫印迹检测到GFP-LC3在H9C2中的表达,成功建立了表达GFP-LC3的H9C2稳定株;筛选出荧光及内源性LC3的高表达时相为缺氧1 h复氧48 h,在此模型中,GFP-LC3在细胞质中聚集成点状,内源性LC3表达显著升高,细胞经3MA处理后点状聚集减少,内源性LC3表达减弱。结论:成功建立了过表达GFP-LC3的H9C2稳定株,该细胞株为研究心肌细胞自噬奠定了基础。     

3-硝基丙酸预处理对脑缺血耐受模型GLUT1和GLUT3表达的影响

目的: 探讨3-硝基丙酸(3-NPA)预处理对大鼠局灶性脑缺血半暗带区不同再灌注时点GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白水平表达的影响。方法: 雄性SD大鼠40只,随机分为假手术组(sham组,n=4)、预处理对照组(3-NPA组,n=4)、大脑中动脉缺血组(M组,n=16)、3-NPA 预处理组(IPC组,n=16)。M组和IPC组按再灌注时间(4 h、12 h、24 h及48 h)不同又分为4个亚组,每组动物4只。将大鼠在相应时点断头取脑,取缺血侧(左侧)冠状面中间1/3皮质,分别采用RT-PCR和Western blotting方法检测GLUT1、GLUT3 mRNA和蛋白水平表达情况。结果: IPC组GLUT1 mRNA表达在缺血再灌注后4 h开始升高,48 h最大,显著高于sham组和M组相应时点。IPC组GLUT3 mRNA表达在24 h增高,48 h最高,与M组相应时点24 h、48 h及sham组比较显著增高。IPC组比M组的GLUT1蛋白、GLUT3蛋白表达增高,有显著差异(F=5.848,P<0.05;F=6.295,P<0.05),尤以缺血再灌注后48 h两者差异最明显。结论: 3-NPA预处理能诱导脑缺血耐受,其机制可能是上调GLUT1和GLUT3 mRNA及蛋白表达水平,维持脑组织的能量供给。     

Immune regulations by 14-3-3: A misty terrain

The 14-3-3 proteins are known for their functions related to the cell cycle and play a prominent role in cancer-related diseases. Recent studies show that 14-3-3 proteins are also regulators of immune responses and are involved in the pathogenesis of autoimmune and infectious diseases. This focused review highlights the significant and recent studies on how 14-3-3 proteins influence innate and adaptive immune responses; specifically, their roles as immunogens and cytokine signaling regulators are discussed. These revelations have added numerous questions to the pre-existing list of challenges, including understanding the 14-3-3 proteins' mechanism of immunogenicity to dissecting the isoform-specific immune regulations.     

蛋白14-3-3蛋白亚型与癌症

14-3-3蛋白家族在真核细胞中广泛表达且高度保守,据报道其与心血管疾病、神经元损伤、帕金森病以及支气管哮喘等疾病有关联,近年来研究发现14-3-3蛋白与癌症的发生和发展也密切相关,而涉及的癌症包括胆管癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、卡波济肉瘤、脑膜癌、直肠癌、星形细胞瘤等几乎所有常见癌症。14-3-3蛋白对癌症增殖、转移、凋亡以及耐药等影响作用已经得到证实,其调控机制也得到部分揭示,并且已合成了影响14-3-3蛋白与其他蛋白相互作用的特异小分子阻断药物。人体内的14-3-3蛋白家族包含β,ε,γ,η,θ(τ),ζ和σ7种亚型,不同亚型有不同的组织定位和功能。阐明各亚型在不同肿瘤中的分布、作用及其调控机制,对我们进一步认识和治疗癌症均有一定的指导意义。     

14－3－3蛋白的新认识

14-3-3蛋白是一个在真核生物中广泛表达的高度保守的酸性蛋白家族,主要以同源/异源二聚体形式存在,在哺乳动物中由7种亚型组成。7种不同亚型的14-3-3蛋白在人类细胞中发挥着重要作用。本文就14-3-3蛋白的序列保守性和独特性、结构特征、结合靶点、调控机制以及作为潜在药物治疗靶点的相关研究进展做一综述。     

CDC25 B与14-3-3相互作用的研究

有研究表明在肿瘤发生发展的过程中,癌细胞的有丝分裂失控是肿瘤发生的主要原因。因此,对细胞分裂调控机制的研究成为目前研究的热点。其中细胞分裂周期25 B （ cell division cycle 25 B, CDC25B）和14-3-3是与细胞分裂有着密切关系的调控子。目前研究已经发现PKA／CDC25B／MPF （ CDC2-cyclinB1）和PKA／CDC25B／14-3-3／MPF是调控细胞有丝分裂的两条重要信号转导途径。蛋白激酶A （ pro-tein kinase A, PKA）是一种环磷酸腺苷（ cyclic adenosine monophosphate, cAMP）依赖性蛋白激酶,可以通过磷酸化下游的靶蛋白,抑制靶蛋白正常发挥作用,从而发挥调节作用。实验研究发现, PKA可以通过磷酸化CDC25B某些位点的丝氨酸残基,使CDC25B处于磷酸化状态,不能使成熟促进因子（ maturation pro-moting factor, MPF）的催化亚基细胞分裂周期2蛋白（cell division cycle 2, CDC2）第15位酪氨酸脱磷酸,因而不能激活MPF,使细胞分裂发生阻滞,不能发生G2／M的转化。14-3-3可以通过CDC25B／14-3-3／MPF途径调节有丝分裂,14-3-3通过结合已经发生磷酸化的CDC25 B的氨基酸（丝氨酸或者苏氨酸）残基,阻止CDC25B进入细胞核,从而引起细胞分裂的阻滞畅这样也就提示可以将14-3-3作为靶位点进行靶向治疗,治疗肿瘤疾病。     

Identification of 14-3-3 protein isoforms in human astrocytoma by immunohistochemistry

The 14-3-3 proteins are highly conserved, ubiquitous molecules involved in a variety of biologic events, such as cell cycle control, and apoptosis. In our previous study, it has been proved that they are expressed in primary human nervous system tumors. However, the isoform-specific expression of 14-3-3 protein is still need to be identified. This study is the first detection of 14-3-3 isoforms' specific expression in human astrocytoma. In the normal brain tissues, all the seven 14-3-3 isoforms' immunoreactivity was localized mainly in the neurons, while only weak expression of epsilon, zeta and theta was found in some glial cells. However, beta, epsilon, zeta, eta and theta isoforms' immunoreactivity was seen in the majority of astrocytoma samples and its immunoreactivity score was increased markedly with an increase in the pathologic grade of human astrocytomas. These results indicate that the five isoforms may play an important role in tumorigenesis of human astrocytoma.     

14-3-3 Sigma And p53 Expression in Gastric Cancer and Its Clinical Applications

14-3-3 sigma (σ) induces G2 arrest enabling the repair of damaged DNA. The function of 14-3-3 σ is frequently lost in tumor cells, indicating a potential tumor suppressor function. The purpose of this study was to evaluate the prognostic value of 14-3-3 σ expression in human gastric cancer. 14-3-3 σ expression was analyzed by immunohistochemistry in 157 tumor samples of patients, who underwent resection for gastric cancer. Since 14-3-3 σ is involved in the p53 network, p53 expression was detected in parallel and correlated with 14-3-3 σ. 14-3-3 σ was found to be overexpressed in 75 (47.8%) of 157 cases, the overexpression rate of p53 protein was 27.4%. 14-3-3 σ overexpression was statistically significantly associated with pT-stage (p=0.041) pN-stage (p=0.015) and UICC-stage (p=0.019) and showed a borderline significance with Lauren classification (p=0.057). Univariate survival calculations revealed a coexistent 14-3-3 σ and p53 overexpression as a significant predictor of disease-free survival. Multivariate analysis did not unfold 14-3-3 as an independent prognostic factor for disease-free survival and overall survival. Concomitant 14-3-3 σ and p53 overexpression in tumor cells of patients with gastric cancer identifies a population of patients with relatively unfavorable prognosis.     

14-3-3 gene expression exerts isoform-dependent functions in sinonasal pathophysiology

The expression profiles of 14-3-3β and θ isoforms, known to exert both oncogenic and antiapoptotic effects, were assessed in different entities of nasal pathophysiology.     

14-3-3β基因与胃癌淋巴结转移的相关性研究

目的：探讨敲减及过表达14-3-3β基因对胃癌细胞生物学行为的影响及临床病理改变。方法在 SGC 7901、MGC 803和 HGC 27胃癌细胞系中，利用 RNA 干扰技术抑制14-3-3β基因的表达，分别用 MTT 法、基底膜侵袭实验检测胃癌细胞的增殖和侵袭能力的变化。结果在 HGC27和 MGC803细胞系中，14-3-3β基因的缺失会影响细胞增殖（ P 值分别为0.000、0.000、0.000、0.000、0.000、0.001、0.000、0.005），14-3-3β基因表达缺失的MGC803胃癌细胞侵袭能力降低（ P 值分别为0.000、0.000）。结论14-3-3β基因参与了胃癌细胞增殖和侵袭。