单细胞五重巢式PCR检测DMD基因

目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景。方法;获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率。结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97％(97/100)、假阳性率为4％(1/25)、假阴性率为0％(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80％(80/100)、假阳性率为0％(0/25)。结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性。     

性连锁性遗传病植入前诊断的临床前运用研究

目的建立一个高效、稳定的性连锁性遗传病植入前诊断的方法。方法取成人外周血单个淋巴细胞和单卵裂球，采用多重巢式多聚合酶链技术同时扩增性别相关基因Amelogenin基因和IL-3基因。结果男性单个淋巴细胞有效扩增率为92．5％，女性单个淋巴细胞的有效扩增率为91％，准确率100％。单卵裂球的扩增效率为94．1％。结论巢式PCR具有较高的扩增效率和准确性，适于临床植入前诊断的运用推广。     

全基因组扩增应用于胚胎植入前遗传学诊断

植入前遗传学诊断（preimplantation genetic diagnosis, PGD）是指借助显微操作技术对具有高遗传病风险夫妇,从其体外受精培养得到的胚胎中取出个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞进行遗传学检查,通过分析选择正常的胚胎移植,可以防止遗传学异常妊娠的发生,将产前诊断提前到胚胎植入子宫内膜之前。避免了反复流产、引产对孕妇及其家庭造成的伤害。但由于可用于PGD分析的材料为胚胎中取出的个别卵裂球细胞或极体或几个滋养层细胞,这些材料十分有限,所以在进行PGD之前,需对单细胞进行全基因组扩增（whole genome ampliflication,WGA）,全基因组扩增一组在基因组DNA数量极有限情况下对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术,其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量,对进行疾病诊断的组织或单个细胞的基因组进行大量扩增,使得后续分析的模板量增加,从而完成多位点、多基因的检测研究。该技术能很好的解决PGD的标本少和准确性要求高等要求。本文介绍了WGA方法中PEP、DOP—PCR、MDA应用于PGD的情况,分析了MDA方法的优势与不足。     

印迹基因UBE3A在人类卵母细胞及植入前胚胎的mRNA表达

目的 了解印迹基因泛素蛋白酶基因（UBE3A）在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达状况。方法采用单细胞巢式RT-PCR,检测UBE3A在人类卵母细胞和植入前各个阶段胚胎中的mRNA表达。结果UBE3A在人类卵母细胞MⅠ、MⅡ和植入前胚胎2、4、6、8细胞期均有表达,单卵母细胞扩增成功率为83.3%,单个卵裂球细胞为72.3%,平均扩增成功率为77.9%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差别（P〉0.05）,但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论UBE3A在人类卵细胞和植入前胚胎均有表达,有助于研究卵母细胞成熟及胚胎生长发育,为探讨印迹基因与辅助生殖及遗传性印迹疾病的关系提供理论依据。     

单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用

目的探讨单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)中的应用效果。方法选取2012年3月—2017年3月在本院生殖中心进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)并在胚胎种植前需进行遗传学诊断(PGD)的夫妇95例为研究对象,抽取这些病例冻存的第三天卵裂期胚胎细胞50枚、第五天囊胚期囊胚15枚和活检后第三天胚胎形成囊胚8枚,经过单个卵裂球细胞与囊胚期滋养外胚层细胞的活检,以及单细胞全基扩增和高通量测序,分析囊胚扩增成功率及总的扩增成功率、染色体正常检出率及异常率以及胚胎临床资料分析。结果第三天卵裂期胚胎共50枚,扩增成功率为76.0%(38/50);第五天囊胚期囊胚15枚,扩增成功率为93.3%,活检后第三天卵裂期胚胎形成囊胚8枚,扩增成功率为100.0%(8/8)。总的扩增成功率为82.2%(60/73);第三天卵裂期胚胎的总异常率为63.2%、囊胚为45.5%,总体异常率为56.7%。基因扩增成功率因为高龄、性别以及反复植入因素分别为89.0%、49.3%、40.0%;染色体异常检出率因为高龄、性别以及反复植入因素分别为73.8%、30.6%、25.0%。结论单细胞高通量测序技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用效果和价值较高,可以弥补囊胚形成率低无可活检的胚胎用于PGD难题,更有利于高通量测序技术的临床推广和应用。     

Duchenne/Becker型肌营养不良分子遗传学诊断策略

Duchenne/Becker型肌营养不良(Duchenne/Becker muscular dystrophy,DMD/BMD)是一种X-连锁隐性遗传性肌病,临床以进行性加重的对称性肌无力、肌萎缩,血清肌酸激酶水平增高,腓肠肌假性肥大为主要特征,临床病情轻重不一。致病基因为编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因,该基因组序列跨越2 200 kb,由79个外显子组成,是迄今发现的最大的人类基因。DMD基因突变类型复杂多样,包括单个或多个外显子缺失、基因片段重复、单个碱基互换、缺失或插入。迄今已形成多种检测技术,从Sanger测序、多重-PCR、Southern-blotting到多重链接探针依赖扩增技术(multiplex ligation probe amplification,MLPA)、单个扩增/内部引物测序技术(single condition amplification/internal primer sequencing technique,SCAIP)、基于基因芯片的比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)等,检测方法优缺点各异,本文结合DMD/BMD临床表现和分子遗传学检测手段就DMD/BMD的分子遗传学诊断策略进行综述,以期形成完整全面的临床诊断思路。     

多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用

多重置换扩增技术(MDA)是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点。尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断(PGD)实验研究和临床应用中仍取得巨大进展。MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断。     

多重置换扩增技术在植入前遗传学诊断中的应用

多重置换扩增技术（MDA）是基于环状滚动扩增的全基因组扩增技术,具有高扩增效率和高保真性等特点。尽管用于单细胞扩增时存在某些缺陷,但其在胚胎植入前遗传学诊断（PGD）实验研究和临床应用中仍取得巨大进展。MDA联合常规PCR技术已成功用于PGD的临床诊断,实现了单次胚胎活检、单个胚胎细胞的性别、部分单基因病的同步诊断。     

单细胞PEP-PCR技术无创性产前诊断胎儿性别

目的:探讨无创性产前基因诊断胎儿性别新方法的科学性和可行性。方法:从273例孕妇外周血中分离出单个胎儿细胞,应用引物延伸预扩增(primer extension preamplification,PEP)方法预扩增单个细胞的基因组,再用PCR方法检测扩增产物中的SRY基因以产前诊断胎儿性别。结果:153例男胎标本中该产前诊断方法检测到SRY基因的有149例,120例女胎样本中除1例外均未检测出SRY基因。该产前诊断方法的敏感性为97.39％,特异性为99.17％,正确率为98.17％。结论:无创性产前基因诊断胎儿性别的新方法具有良好的科学性和可行性,并为其他疾病的无创性产前诊断研究奠定基础。     

单细胞PEP-PCR技术无创性产前诊断胎儿性别

目的探讨无创性产前基因诊断胎儿性别新方法的科学性和可行性.方法从273例孕妇外周血中分离出单个胎儿细胞,应用引物延伸预扩增(primer extension preamplification,PEP)方法预扩增单个细胞的基因组,再用PCR方法检测扩增产物中的SRY基因以产前诊断胎儿性别.结果153例男胎标本中该产前诊断方法检测到SRY基因的有149例,120例女胎样本中除1例外均未检测出SRY基因.该产前诊断方法的敏感性为97.39%,特异性为99.17%,正确率为98.17%.结论无创性产前基因诊断胎儿性别的新方法具有良好的科学性和可行性,并为其他疾病的无创性产前诊断研究奠定基础.     

乙基亚硝基脲对人白血病细胞HPRT基因的影响

目的 探讨乙基亚硝基脲(ENU）诱导人次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因突变的分子图谱和发生机制。方法 采用单细胞克隆培养、双向筛选计数、多重聚合酶链反应扩增和电泳分析等方法。结果 随着ENU剂量的增加,细胞接种存活率非常显著下降(100～200μg/ml剂量组)、突变频率显著升高（12．5～200．0μg/ml剂量组)。自发突变没有全部基因外显子缺失型,只有7．7％检测出单个外显子缺失;而ENU诱发突变中却有79．7％显示缺失改变,其中缺失突变可以发生于：HPRT基因的每个外显子,且诱发突变中大多数是多个外显子连锁缺失(88．1％)。结论 ENU诱发：HPRT基因突变图谱与自发突变完全不同,易诱发较大遗传结构改变,提示其具有较强的致突变作用。     

6例性发育异常病残儿的SRY基因分析

目的:对6例性发育异常患儿进行SRY基因检测,为临床诊断提供参考,并对性发育异常机理进行初步探讨。方法:应用PCR扩增及PCR产物直接测序进行SRY基因分析。结果:1例45,XO男性患儿,SRY基因阳性;1例46,XX男性,SRY阴性;1例46,XY女性,SRY基因阳性,对其SRY基因保守区测序结果表明,该区无突变;3例46,XY男性性异常患儿,SRY基因均为阳性。结论:45,XO男性患儿是由于SRY基因易位所至。女性性反转非SRY基因保守区突变所至。男性性反转可能由于常染色体上与性别决定有关的基因突变所至。     

From gene to disease; the dystrophin gene involved in Duchenne and Becker muscular dystrophy

Duchenne and Becker muscular dystrophy (DMD and BMD) are progressive disorders, which almost exclusively affect males. DMD is the more severe type with an onset at 2-3 years of age. Patients become wheelchair-bound before the age of 13 and often die due to cardiac arrest or respiratory insufficiency. BMD, a more varying phenotype which may overlap with limb girdle muscular dystrophy (LGMD), has a less severe muscle weakness which starts later than in DMD patients. DMD carriers may show some muscle weakness. The dystrophin gene (2.4 Mb), known to be involved in DMD/BMD, codes for a 427 kilodalton muscle-specific protein named dystrophin as well as several tissue-specific isoforms. Dystrophin, as part of a membrane-bound complex of proteins, connects the cytoskeleton of the muscle cell to the extracellular matrix. Since 1985, when highly reliable carrier detection and prenatal diagnosis at the DNA level became possible, over 250 prenatal tests have been performed. Molecular genetic analysis, highlighted a phenomenon called germinal mosaicism, which explains the recurrence of de novo mutations and led to the discovery of the so-called reading-frame rule, which helps to discriminate between DMD and BMD. Fifteen years after the discovery of the dystrophin gene, mutations can be detected in 95% of the patients, while the remaining 5% are still hiding within this very large gene.     

性反转综合征患者的细胞及分子遗传学分析

目的:探讨检测SRY基因和Y染色体AZF因子在性反转综合征患者临床分子诊断中的应用价值及性反转综合征的机制。方法:运用细胞遗传学核型分析技术和聚合酶链反应(PCR)对7例46,XY女性性反转患者及1例46,XX男性性反转患者进行染色体核型分析、SRY基因扩增和Y染色体AZF因子扩增,SRY阳性的扩增产物进行序列测序。结果:7例46,XY女性性反转中4例SRY和Y染色体AZF因子检测阳性,3例SRY和Y染色体AZF因子检测阴性;1例46,XX男性性反转患者SRY和Y染色体AZF因子检测阴性。4例SRY阳性病例DNA序列分析均未检测到突变。结论:SRY是决定性别和分化的重要基因,Y染色体AZF因子有辅助检测的作用,对性反转综合征患者进行检测有利于明确病因,为其诊断和治疗提供科学依据。性反转综合征可能与其它性别分化相关基因的异常有关,需深入进行细胞、分子遗传学研究。     

MLPA技术在假肥大型肌营养不良症基因检测和产前诊断中的应用

目的 评价多重连接依赖式探针扩增 (Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) 技术对假肥大型肌营养不良症(DMD)患者进行基因诊断和产前诊断的应用价值。方法 应用MLPA技术对具有典型表型的22例患者进行DMD基因79个外显子拷贝数变异(缺失/重复突变)检测,同时对部分家系中孕妇携带者进行产前诊断,STR毛细管电泳连锁分析方法进行辅助诊断及验证。结果 22例患者中15例为缺失突变,4例为重复突变,3例未见拷贝数变异。14例MLPA检测结果为阳性的患者母亲中有9例为携带者。产前诊断的7例胎儿中,3例为女性胎儿携带者,3例男性正常胎儿和1例女性正常胎儿。结论 MLPA技术能准确、快速、可靠地检测DMD基因拷贝数变异(缺失或重复突变)。     

SRY和maspin基因对胎儿游离DNA的检测效率

目的:探讨应用非性别依赖的表观遗传学标记代替SRY基因检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的可行性。方法:分别以SRY基因和不同甲基化状态的maspin基因序列为标记对孕妇和非妊娠女性血浆中的游离DNA进行PCR和甲基化PCR检测,并对结果进行统计学分析。结果:孕男胎孕妇血浆DNA标本中SRY基因的检出率为93.9%。u-maspin(maspin基因的非甲基化序列)仅在妊娠组中被检测出,检出率88.3%。两检出率间的差异不具有统计学意义。m-maspin(maspin基因的甲基化序列)在妊娠组和非妊娠组中的检出率无差异。结论:u-maspin基因可作为非性别依赖的胎儿DNA特异性标志物,相对于以SRY基因作为标志物有助于扩大非创伤性产前诊断的临床应用范围。     

Detection of Duchenne/Becker muscular dystrophy carriers in a group of Iranian families by linkage analysis

This study determines the value of linkage analysis using six RFLP markers for carrier detection and prenatal diagnosis in familial DMD/BMD cases and their family members for the first time in the Iranian population. We studied the dystrophin gene in 33 unrelated patients with clinical diagnosis of DMD or BMD. Subsequently, we determined the rate of heterozygosity for six intragenic RFLP markers in the mothers of patients with dystrophin gene deletions. Finally, we studied the efficiency of linkage analysis by using RFLP markers for carrier status detection of DMD/BMD. In 63.6% of the patients we found one or more deletions. The most common heterozygous RFLP marker with 57.1% heterozygosity was pERT87.15Taq1. More than 80% of mothers in two groups of familial or non-familial cases had at least two heterozygous markers. Family linkage analysis was informative in more than 80% of the cases, allowing for accurate carrier detection. We found that linkage analysis using these six RFLP markers for carrier detection and prenatal diagnosis is a rapid, easy, reliable, and inexpensive method, suitable for most routine diagnostic services. The heterozygosity frequency of these markers is high enough in the Iranian population to allow carrier detection and prenatal diagnosis of DMD/BMD in more than 80% of familial cases in Iran.