人甲状旁腺素(1-34)的合成与聚乙二醇化修饰

目的合成人甲状旁腺素(1 34) [hPTH(1-34) ]并进行聚乙二醇化修饰。方法应用固相多肽合成方法合成并经高效液相色谱纯化得hPTH(1-34) ,Cys-hPTH(1- 34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 。Cys hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys-NH2 在水溶液(pH 7～8)中分别与平均相对分子质量为5 0 0 0的单甲氧基马来酰亚胺基聚乙二醇(mPEG50 0 0 MAL)反应,经高效液相色谱纯化得Cys(mPEG50 0 0 MAL)- hPTH(1-34)和hPTH(1-34)-Cys(mPEG50 0 0- MAL) -NH2 。结果hPTH(1-34) ,Cys(mPEG50 0 0 MAL) hPTH(1 34)和hPTH(1 34) Cys(mPEG50 0 0 MAL) NH2 的质谱和氨基酸组成分析结果均与理论值一致。hPTH(1-34) -Cys(mPEG50 0 0-MAL) NH2 保持了较好的体外活性,Cys(mPEG50 0 0- MAL) hPTH(1-34)保持了较好的体内活性。结论采用一种简便的方法成功实现了对hPTH(1-34)的N端或C端的聚乙二醇化修饰     

注射用重组人甲状旁腺素(1-34)在健康人体的药代动力学

目的研究注射用重组人甲状旁腺素(1-34)[rhPTH(1-34)](激素)在中国健康人体内的药代动力学特征。方法30名健康受试者随机分为10,20,40μg3个剂量组,每组10人,用免疫放射测定法(IRMA)测定人血浆中甲状旁腺激素(PTH)浓度。结果药代动力学参数:tmax分别为(32.5±9.5),(24.0±9.7)和(35.0±13.5)min;Cmax分别为(0.14±0.04),(0.20±0.05)和(0.30±0.04)ng.mL-1;t1/2分别为(47.7±12.1),(50.1±16.4)和(53.6±14.4)min;AUC(0-240)分别为(9.79±1.46),(15.42±1.66)和(32.72±3.16)ng.min.mL-1。结论单次皮下注射重组人甲状旁腺素(1-34)在低、中、高3个剂量内,Cmax和AUC呈线性增长,与剂量呈正相关;体内代谢呈线性代谢特征,与国外报道基本一致。     

骨肽注射液对新生大鼠的成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响

目的考察骨肽注射液对新生大鼠的成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响。方法在体外培养的大鼠成骨细胞中分别加入75,150,300,600和1 200μg/L的骨肽注射液培养6 d,用MTT法测定成骨细胞的增殖能力;用酶联免疫法检测培养12 d的细胞内碱性磷酸酶活性。结果与对照组比,骨肽注射液150～1 200μg/L组1～6 d的细胞增长速度较快(P<0.05),并呈剂量依赖性,骨肽注射液300μg/L对成骨细胞的增殖的促进作用最为明显;骨肽注射液75～1 200μg/L组培养3,6,9和12 d的成骨细胞碱性磷酸酶活性较高(P<0.05),骨肽注射液300μg/L的碱性磷酸酶活性最强。结论骨肽注射液可提高细胞内碱性磷酸酶活性并加速成骨细胞的增殖活动。     

注射用重组人甲状旁腺素（1-34）的Ⅰ期临床耐受性研究

目的：评价中国健康志愿者皮下注射重组人甲状旁腺素（1—34）的安全性和耐受性。方法：将40例18～40岁的健康受试者随机分为10，20和40μg3个剂量组，腹部皮下注射，观察临床症状体征并严密观察记录试验期间发生的不良反应事件。结果：各组受试者体检及实验室检查各项指标均在正常范围，具较好的可比性。给药后生命体征和实验室检查均未见有临床意义的改变，试验中未见严重不良反应发生。结论：健康受试者皮下注射甲状旁腺素（1-34）40μg以内安全性和耐受性较好。     

人甲状旁腺激素(1-34)突变蛋白的设计与活性验证

通过对NCBI数据库中不同物种同源序列进行比对protein-protein BLAST,并利用计算机软件DiscoveryStudio3.1进行分子对接和分子动力学模拟,对天然人甲状旁腺激素(1 34)的3个氨基酸R25K26K27进行Q25E26L27置换,并对突变体的生物活性进行了评价。结果显示:突变后PTH(1 34)-(RKK-QEL)和突变前PTH(1 34)多肽主链叠合后均方根偏差RMSD值为2.509 3,说明两者主链结构构象差异不大;PTH(1 34)-(RKK-QEL)与受体蛋白PTH1R的相互作用能为599.253 kcal.mol 1,较天然PTH(1 34)的554.083 kcal.mol 1增强7.5%;氢键数目由32对增加至38对;PTH(1 34)-(RKK-QEL)能显著刺激UAMS-32P细胞RANKL基因的表达(P<0.01),并抑制OPG基因的表达(P<0.01);PTH(1 34)-(RKK-QEL)作用于UAMS-32P和小鼠原代股骨骨髓细胞共培养体系时,能显著刺激破骨细胞的形成(P<0.01),并且活性高于PTH(1 34)标准品。     

重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症的研究进展

本文就重组人甲状旁腺素治疗骨质疏松症的研究概况作一综述,重点介绍重组人甲状旁腺素(1- 34)和重组人甲状旁腺素(1-84)的药理毒理和临床研究工作,为研究和开发甲状旁腺素提供参考。     

重组人甲状旁腺激素1-34的纯化研究

重组人甲状旁腺激素(rhPTH(1-34))在工程菌pET(32a+)-PTH(1-34)/BL21(DE3)中以胞内可溶性融合蛋白形式高效表达。经过高压匀浆破菌处理,取上清经过亲和层析、酶切、阴离子交换层析、反相层析和阳离子交换层析进行分离纯化,得到rhPTH(1-34)原液样品纯度在98%以上,比活性达到1.05×104U/mg。     

注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的测定及其药动学

目的:注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)在体内的代谢产物PTH(1-34)对骨质疏松症具有较好的疗效,本试验通过测定人血浆中PTH(1-34)浓度的变化,了解PTH(1-34)在体内的分布,对注射用重组人甲状旁腺素PTH(1-84)的药效及作用机制具有重要意义。方法:采用固相萃取法结合放射免疫分析(RIA)测定人血浆中注射用重组人甲状旁腺素代谢产物PTH(1-34)的浓度,采用DAS2.0数据处理系统进行药动学分析。结果:PTH(1-34)的线性范围为10～1 280 pg.mL-1,最低检测限为10 pg.mL-1(RSD为3.51%),采用固相萃取柱Styre Screen H2P在血浆样本萃取效率大于85%。结论:本法测定注射用重组人甲状旁腺素在血浆中的代谢产物PTH(1-34)的方法是可行的,特异性、灵敏度、精密度和准确度较高,可应用于临床样本的检测。     

重组人甲状旁腺素1-34联合钙尔奇D治疗绝经后女性骨质疏松疗效观察

目的 研究重组人甲状旁腺素1-34(recombinant human parathyroid hormone 1-34,rhPTH1-34)联合钙尔奇D治疗绝经后妇女骨质疏松的治疗效果.方法 84例绝经后骨质疏松妇女被随机分为实验组和对照组,每组均有患者42例.实验组采用rhPTH1 34)联合钙尔奇D治疗,对照组仅采用钙尔奇D治疗,疗程均为6个月.观察两组患者治疗前后骨密度变化、血清钙、磷和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、骨痛症状变化和治疗期间的骨折发生率.结果实验组治疗后的骨密度(T值)较治疗前增加,差异具有统计学意义(P<0.05);并且实验组治疗后的骨密度(T值)较对照组治疗后的骨密度(T值)增加,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组和对照组治疗后ALP的浓度均高于治疗前,差异具有统计学意义(P<0.05),并且实验组治疗后ALP的浓度高于对照组治疗后,差异具有统计学意义(P<0.05).实验组的骨痛治疗有效率为66.67%;对照组为50%,实验组的有效率高于对照组,差异具有统计学意义(χ2=4.04,P<0.05).结论 rhPTH1 34联合钙尔奇D能够有效的提高绝经后女性的骨密度,减少骨质疏松的症状.     

HPLC法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药的含量

目的:建立以高效液相色谱法测定甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的方法。方法:色谱柱为Spherisorb ODS;流动相A为甲醇,流动相B为0.05mo·lL-1 Na2SO4水溶液(磷酸调节至pH2.5),A∶B=30∶70;流速为1.0mL·min-1;检测波长为215nm;柱温为室温;进样量为20μL。结果:甲状旁腺激素(1-34)检测浓度线性范围为0.06～0.90mg·mL-1(r=0.99997),平均回收率98.6%,RSD=0.15%。结论:本方法简便、准确、灵敏度高,可用于甲状旁腺激素(1-34)原料药含量的测定。     

甲状旁腺素对人成骨肉瘤细胞株SaOS-2内cAMP,IP3,Ca~(2+)的作用研究

目的通过研究ｈＰＴＨ（１～３４）对人成骨肉瘤细胞株ＳａＯＳ－２胞浆内ｃＡＭＰ、ＩＰ３、Ｃａ２＋的影响，来阐明ＰＴＨ与其膜上特异受体结合后的胞浆内主要信息传递途径。方法利用蛋白竞争结合法测定胞浆内ｃＡＭＰ，以Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ作为荧光指示剂，激光共聚焦显微系统显示ＳａＯＳ－２内［Ｃａ２＋］ｉ的变化，离子交换层析法测定ｈＰＴＨ（１～３４）作用下胞浆内ＩＰ３的改变。结果ｈＰＴＨ（１～３４）可使ＳａＯＳ－２胞浆内ｃＡＭＰ明显升高且与其浓度呈正相关，其最佳作用时间为１０ｍｉｎ。ｈＰＴＨ（１～３４）能迅速提高ＳａＯＳ－２内［Ｃａ２＋］ｉ，而且作用３０ｓ时ＳａＯＳ－２胞浆内ＩＰ３升高即达最高峰，未发现百日咳毒素对此现象有抑制作用。结论ｃＡＭＰ及ＩＰ３／Ｃａ２＋两条信息途径均参与ｈＰＴＨ（１～３４）对成骨细胞的调节作用     

甲状旁腺激素对心肌细胞PGI_2释放的影响

为探讨甲状旁腺激素PTH心肌毒性的可能机制,我们对心肌细胞释放6-keto-PGF_(-1α)进行了测定。结果表明,bPTH(1-34)明显增加心肌细胞释放PGI_2,该作用与剂量有关;钙载体A_(23187)也能刺激心肌细胞释放PGI_2;钙离子络合剂EDTA,钙通道阻断剂维拉帕米明显抑制之;维拉帕米还可阻断bPTH(1-34)对PGI_2释放的增加作用。提示PTH促进心肌细胞合成PGI_2的作用受细胞内外钙离子的影响。bPTH(1-34)增加心肌细胞PGI_2合成的意义可能与其干扰能量代谢进而使细胞损伤有关。     

重组人甲状旁腺激素1-34多次皮下注射给药的人体药动学特征

目的研究健康志愿者多次皮下注射重组人甲状旁腺激素1-34[(rhPTH(1-34)]后体内的药动学特征。方法8名健康志愿者多次皮下注射rhPTH(1-34)后,采用放射免疫法测定血浆中rhPTH(1-34)浓度,评估它的药动学特性。结果rhPTH(1-34)的主要药动学参数如下:d 1,AUC0→t为(17103.3±2243.3)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20471.3±2444.6)ng.min.L-1,ρmax为(171.2±34.2)ng.L-1,tmax为(38.1±15.1)min,t12为(55.7±3.9)min;d 7,AUC0→t为(17759.6±3781.5)ng.min.L-1,AUC0→∞为(20698.4±3374.6)ng.min.L-1,ρmax为(184.6±36.8)ng.L-1,tmax为(35.0±16.0)min,t12为(51.6±7.6)min,蓄积系数R为1.02±0.18。结论多次皮下注射rhPTH(1-34)后,与单次给药相比它在人体内的吸收、消除不随连续给药变化,药物在体内没有蓄积作用。rhPTH(1-34)的安全耐受性良好。性别对药动学参数没有影响。     

Formulations for Intermittent Release of Parathyroid Hormone (1-34) and Local Enhancement of Osteoblast Activities

The objective of these studies was to develop simple, implantable devices that intermittently release PTH(1-34) and thus could be used for locally stimulating bone formation. The formulations were based on the association polymer system of cellulose acetate phthalate and Pluronic F-127. Release profiles for intermittent devices showed five discrete peaks, whereas sustained devices exhibited zero-order kinetics. Osteoblastic activity was greater for cells intermittently treated with PTH(1-34) compared to sustained exposure. These controlled release devices delivering PTH(1-34) in an intermittent manner may be useful for affecting osteoblast activities in a localized area.     

甲壳质对氧自由基致人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用

在培养的人脐静脉内皮细胞中观察了不同剂量的甲壳质对氧自由基损伤的内皮细胞培养上清液中丙二醛和乳酸脱氢酶含量的影响。结果表明,与损伤对照组相比,甲壳质保护组培养上清液中丙二醛和乳酸脱氢酶的含量均显著下降。提示甲壳质对氧自由基损伤的内皮细胞有一定的保护作用。     

人甲状旁腺素活性片段前体物Pro-Pro-hPTH(1-34)的制备及活性研究

目的制备出具有生物活性的人甲状旁腺素活性片段类似物,并对其活性进行考察。方法采用基因工程方法:大肠杆菌BL 21为宿主菌,pET 28a为表达载体,天门冬酰胺酶Ⅱ切除信号肽的C末端片段为融合伙伴,在融合伙伴和目的肽结合处引入Asp Pro酸敏感位点及二肽酶Ⅳ识别的N端Pro Pro位点,之后经诱导表达,酸水解使融合伙伴和目的肽分离。结果成功构建了hPTH(1 34)的融合表达体系,它能高效表达含hPTH(1 34)的融合蛋白,经纯化,得到多肽纯品,经鉴定,该多肽的分子量、氨基酸组成均与设计的分子相符,工程菌中用于编码该多肽的DNA片段其测序结果也与原设计相符,是表达该多肽的正确模板。该多肽在Parsons雏鸡分析及卵巢摘除大鼠模型试验中均显示显著活性。结论用基因工程方法成功地制备出人甲状旁腺素活性片段类似物,该产物具有显著生物活性及潜在的药用价值。