地塞米松在人骨髓基质细胞诱导成骨细胞中的作用

目的 通过对人骨髓基质细胞体外培养及检测，研究地塞米松在骨髓基质细胞体外增生并向成骨细胞定向分化过程中的应用。方 法骨折内固定术扩髓前收集髓腔内骨髓进行原代和传代培养，传代后改用条件培养基（含地塞米松）和基础培养基（不含地塞米松）分别进行培养，应用组织化学及von Kossa方法检测细胞碱性磷酸酶和细胞外基质矿化程度；半定量RT-PCR方法检测Cbfal mRNA和Osterix mRNA在细胞培养过程中不同时间点的表达。并观测地塞米松对上述成骨细胞相关基因表达的影响。结果 条件培养基组细胞Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达峰值高于基础培养基组细胞，并且峰值出现的时间提前。结论 地塞米松通过促进Cbfal mRNA和Osterix mRNA的表达而促进骨髓基质细胞向成骨细胞分化。     

成人骨髓成骨细胞体外培养

目的 研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的成骨能力及生物学特性，探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法 因诊断需要抽取健康成人骨髓组织，在含体积分数为10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、含体积分数为5％的CO2湿化空气孵箱中培养，传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养，用倒置相差显微镜观察、HE染色、扫描与透射电镜观察增殖和分化情况，并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果 采用本法在体外培养的成人成骨细胞生长良好，生化指标稳定，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论 本实验方法取材方便，所培养的细胞具有成骨细胞的特性，可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

Pluronic F-127表面修饰生物衍生骨的体外实验研究

目的：探讨成骨细胞复合PluronicF-127表面修饰生物衍生骨的三维培养，对成骨细胞活力及功能表达的影响。方法：将新鲜猪肋骨加工制成生物生骨，应用PluronicF-127对生物衍生骨进行表面修饰，然后体外复合第3代成骨细胞三维培养，实验为A、B和C组，A组为单纯生物衍生骨复合成骨细胞组，B组为PluronicF-127表面修饰生物衍生骨复合成骨细胞组，C组为单纯成骨细胞组，应用倒置相差显微镜和扫描电镜对各组成骨细胞生长及黏附进行观察，并对其细胞活力碱性磷酸酶（ALP）活性进行检测，结果：B组成骨细胞在支架材料上黏附，伸展及生长良好，成骨细胞活力和ALP活性表达与A组成骨细胞比较均无统计学意义（P＞0．05）；A、B组与C组比较，成骨细胞活性和ALP活性均明显降低，有统计学意义（P＜0．01）。结论：生物衍生骨经PluronicF-127表面修饰后具有良好的细胞相容性，可作为负载生物活性分子的载体修饰生物衍生骨。     

成骨细胞在生物活性玻璃与TGF-β复合生物支架上培养的实验研究

目的:研究兔成骨细胞在生物活性玻璃与TGF-β复合生物支架中的生长情况,探讨优化组织工程中生物材料支架的实验方法。方法:体外培养的兔成骨细胞与BG/TGF-β构建的三维立体材料支架体外复合培养,分别于2、4、6、8 d通过显微镜观察,上清液ALP测定,MTT细胞计数法及流式细胞仪检测,评估BG/TGF-β构建的三维立体材料支架与兔成骨细胞的生物相容性。结果:兔成骨细胞在BG/TGF-β构建的三维立体材料支架的表面及空隙内生长状态良好,随着培养时间的延长,各组细胞数量都明显增加,各时间点BG/TGF-β构建的三维立体材料支架上MTT法测定细胞数实验组与对照组比较,两组对照有显著性差异(P<0.05),上清液ALP测定值实验组与对照组进行统计处理,两组对照有显著性差异(P<0.05)。细胞凋亡率(Ap)实验组与对照组进行统计处理,两组对照无显著性差异(P>0.05)。结论:BG/TGF-β复合支架不但具有良好生物相容性,而且能促进成骨细胞的增殖与分化,为骨组织工程支架材料的改良提供了依据。     

转染特异性报导基因成骨细胞生物学性状及其与骨支架材料生物相容性的研究

目的研究转染特异性报导基因成骨细胞的生物学性状，并观察该细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。方法常规复苏培养转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞，通过倒置相差显微镜、HE染色、I型胶原免疫组化法染色、碱性磷酸酶（ALP）偶氮偶联法染色、矿化结节茜素红法染色及四环素法染色观察该转基因成骨细胞的生物学性状；并将其与纳米磷酸钙复合骨支架进行体外复合培养，通过扫描电镜观察该转基因成骨细胞在骨支架材料上的生长特性和黏附性。结果转染12×SBE—OC—Luc报导基因的前成骨细胞株OCTl细胞经培养后能贴壁生长，形态和成纤维细胞相似，能分泌胶原基质和ALP，经I型胶原免疫组化法染色及ALP偶氮偶联法染色呈强阳性；并能够形成矿化结节，茜素红法染色及四环素法染色呈阳性；该转基因成骨细胞在骨支架材料上具有良好的生长特性和黏附性，并能正常分化、增殖和成熟，分泌大量胶原基质和钙结节。结论转染12×SBE—OC—Luc报导基因后成骨细胞生物学性状未发生改变，其与骨支架材料亦具有良好的生物相容性。     

锶磷灰石多孔陶瓷不同孔隙率对成骨细胞生物学行为的影响

目的 比较不同孔隙率的锶磷灰石(含5at%锶的羟磷灰石,Sr-HA)陶瓷在体外培养条件下对兔骨髓成骨细胞生物学行为的影响.方法 抽取健康兔的骨髓组织,体外培养,诱导分化为成骨细胞,分别与孔径约为300μm-600μm、孔隙率分别为50%、60%、70%的Sr-HA以及孔隙率为70%的纯羟磷灰石陶瓷体复合,在不同时间点利用相差显微镜及扫描电镜观察,并进行碱性磷酸酶的定量检测.结果 兔骨髓成骨细胞与不同孔隙率的Sr-HA陶瓷体外培养后,表现出典型成骨细胞的形态特征和生物学特性,Sr-HA多孔陶瓷有利于细胞的贴附、生长与增殖,并对细胞的功能无不良影响.其中,孔隙率为70%的Sr-HA陶瓷更有利于细胞向材料内部爬行.结论 Sr-HA多孔陶瓷是较理想的骨组织工程支架材料,成骨细胞复合Sr-HA陶瓷用于骨缺损的修复,具有广阔的临床应用前景.孔隙率为70%的Sr-HA陶瓷由于具有良好的孔隙连通性,在促进成骨细胞生长方面表现出更佳的效果,较其他孔隙率的Sr-HA陶瓷更适用于骨组织工程支架材料.     

成人骨髓成骨细胞体外培养

目的　研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的成骨能力及生物学特性 ,探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法 ,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法　因诊断需要抽取健康成人骨髓组织 ,在含体积分数为 10 %胎牛血清的DMEM培养基中 ,置于 37℃、含体积分数为 5 %的CO2 湿化空气孵箱中培养 ,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养 ,用倒置相差显微镜观察、HE染色、扫描与透射电镜观察增殖和分化情况 ,并测定培养细胞的生长曲线 (MTT法 )、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力。结果　采用本法在体外培养的成人成骨细胞生长良好 ,生化指标稳定 ,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性。结论　本实验方法取材方便 ,所培养的细胞具有成骨细胞的特性 ,可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法     

可控微结构EBM钛合金支架与成骨细胞的体外三维复合培养

[目的]探讨可控微结构EBM钛合金支架作为成骨细胞体外培养载体的可行性,并观察载体类蜂巢状孔结构在成骨细胞培养中的作用.[方法]应用直接金属快速成形技术一电子束熔化成形(electron beam melting,EBM)过程直接构建和制备可控性微结构钛合金支架.分离培养1 d龄胎兔颅骨成骨细胞,以兔颅骨源性成骨细胞复合支架作为实验组,以单独培养的兔颅骨源性成骨细胞作为对照组.将成骨细胞与支架复合培养1、7、14 d后,进行倒置相差显微镜、扫描电镜及组织切片染色观察细胞与材料复合情况,以MTT比色法及碱性磷酸酶的定量检测研究材料结构对细胞增殖、分化的影响.[结果]成骨细胞/支架复合培养7d后,大量细胞通过伸出多个伪足粘附在支架表面以及孔周围并与支架牢固结合;培养14 d后支架表面及孔隙内有大量细胞分布,细胞伸出数个突起沿着孔隙壁逐渐向孔隙内延伸、汇集.支架上的细胞增殖、分化以及转移明显增加,与对照组比较有明显统计学差异(P<0.05).[结论]EBM钛合金支架有利于细胞的贴附、生长及增殖,并对细胞的功能无不良的影响.支架类蜂巢状孔结构能够调节成骨细胞在支架内的分布.     

生物活性玻璃陶瓷对成骨细胞影响的体外实验研究

目的：探讨生物活性玻璃作为成骨细胞培养支架的可行性，为骨组织工程寻找一种良好的细胞载体。方法：采用骨膜源性成骨细胞与生物活性玻璃陶瓷体外复合培养，通过光镜、电镜、上清液ALP测定及流式细胞仪观察及检测生物活性玻璃陶瓷对成骨细胞生物学性状的影响。结果：成骨细胞在生物活性玻璃陶瓷的表面及空隙内生长状态良好，上清液ALP测定值及细胞凋亡率(Ap)两组对照无显著性差异。结论：生物活性玻璃陶瓷具有良好的生物相容性、生物活性和成骨作用，可以成为骨组织工程中一种新型的细胞支架材料。     

成骨细胞株与强韧化纳米人工骨支架联合培养实验研究

目的 :观察成骨细胞株 ( 3T3 E1)在新型纳米氧化锆强韧化高孔隙率人工骨支架 (下文简称人工骨支架 )材料上生长情况。方法 :成骨细胞株 ( 3T3 -E1)与人工骨支架联合培养 ,通过光镜观察和细胞计数的方法了解成骨细胞与支架结合能力 ,扫描电镜观察细胞生长的情况。结果 :新型强韧化纳米人工骨材料与建株成骨细胞有良好的结合能力 ,成骨细胞株 ( 3T3 E1)在人工骨材料上生长良好。结论 :纳米骨支架是较理想的骨组织工程支架材料 ,成骨细胞复合支架用于骨缺损的修复 ,具有广阔的临床应用前景。     

蛇床子素和纳米氧化锆强韧化磷酸钙支架对成骨细胞增殖影响的研究

目的研究蛇床子素与纳米氧化锆强韧化磷酸钙骨支架的相容性，以及其在体外对幼兔成骨细胞增殖和成骨作用的影响。方法酶消化法分离培养幼兔股骨成骨细胞，噻唑兰法(MTT)测量成骨细胞增殖率，用碱性磷酸酶试剂盒测定细胞内骨碱性磷酸酶(ALP)活性。结果蛇床子素对大鼠新生成骨细胞的增殖和ALP活性具有显著的促进作用，与纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架生物相容性良好。结论纳米氧化锆强韧化磷酸钙人工骨支架复合蛇床子素刺激的成骨细胞，是一种性能良好的复合骨组织工程材料。     

WO-1生物衍生骨支架与成骨细胞相容性的实验研究

目的 研究WO-1生物衍生骨复合材料与兔成骨细胞的相容性及体外附着规律，为进一步的体内试验提供基础研究。方法 应用同种异体骨、Ⅰ型胶原及WO-1制备WO-1生物衍生骨复合材料；取幼兔的颅顶骨成骨细胞，经培养液体外培养、扩增后，与WO-1生物衍生骨材料联合培养。通过扫描电镜和倒置相差显微镜观察WO-1生物衍生骨复合材料的形貌特征、细胞与材料的粘附和增殖情况。结果 WO-1生物衍生骨复合材料具有天然骨的三维结构；扫描电镜和倒置相差显微镜均显示复合培养的成骨细胞在材料表面和孔隙内生长良好。结论 WO-1生物衍生骨复合材料具有良好的细胞相容性。     

兔骨髓基质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：研究兔骨髓基质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC）体外分离、诱导培养及增殖特点,探讨其生物学特性。方法：抽取兔骨髓,密度梯度离心结合贴壁培养法分离BMSC,诱导培养液定向诱导传代细胞向成骨细胞分化。倒置显微镜下观察细胞生长及增殖情况,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,免疫组织化学观察Ⅰ型胶原表达,并检测碱性磷酸酶活性及细胞矿化作用。结果：体外培养的兔BMSC贴壁生长,10～14天后形成克隆。细胞形态为均一的长梭形并呈漩涡状排列,流式细胞仪检测CD34,CD45阴性,CD44阳性。免疫组化可检测到Ⅰ型胶原表达,碱性磷酸酶活性明显增高,并且出现矿化结节。结论：密度梯度离心结合贴壁培养BMSC,操作简单,细胞易于成活,诱导条件下成骨能力肯定,适合作为骨组织工程的种子细胞。     

Enhanced bone formation in large segmental radial defects by combining adipose-derived stem cells expressing bone morphogenetic protein 2 with nHA/RHLC/PLA scaffold

In this study, rabbit adipose-derived stem cells (rASCs) were isolated, cultured in vitro, and transfected with recombinant adenovirus vector containing human bone morphogenetic protein 2 (Ad-hBMP2). These cells were combined with a nano-hydroxyapatite/recombinant human-like collagen/poly(lactic acid) scaffold (nHA/RHLC/PLA) to fabricate a new biocomposite (hBMP2/rASCs-nHA/RHLC/PLA, group 1) and cultured in osteogenic medium. Non-transfected rASCs mixed with nHA/RHLC/PLA (rASCs-nHA/RHLC/PLA, group 2) and nHA/RHLC/PLA scaffold alone (group 3) served as controls. Scanning electron microscope (SEM) demonstrated integration of rASCs with the nHA/RHLC/PLA scaffold. Quantitative real-time RT-PCR analyses of collagen I, osteonectin, and osteopontin cDNA expression indicated that the osteogenic potency of rASCs was enhanced by transfection with Ad-hBMP2. After in vitro culture for seven days, three groups were implanted into 15-mm length critical-sized segmental radial defects in rabbits. After 12 weeks, radiographic and histological analyses were performed. In group 1, the medullary cavity was recanalised, bone was rebuilt and moulding was finished, the bone contour had begun to remodel and scaffold was degraded completely. In contrast, bone defects were not repaired in groups 2 or 3. Furthermore, the scaffold degradation rate in group 1 was significantly higher than in groups 2 or 3. In summary, after transduction with Ad-hBMP2, the osteogenesis of rASCs was enhanced; a new biocomposite created with these cells induced repair of a critical bone defect in vivo in a relatively short time.     

煅烧骨与诱导的MSCs复合的实验研究

目的：观察大鼠骨髓基质干细胞（MSCs）与经胶原涂层处理的煅烧骨（CCB）复合行体外培养时贴附、增殖能力的变化,探讨构建组织工程骨体外培养的最适时间。方法：制备鼠尾胶原（I型胶原）,无菌条件下,将煅烧骨置于胶原液中,2h后取出骨块,置滤网中将孔内外的胶原溶液沥干。体外培养的大鼠MSCs经矿化液诱导向成骨细胞分化。将分化后的成骨细胞滴加到涂胶原的煅烧骨块上,同时以未涂胶原的煅烧骨块为对照组。3天,7天时取材,扫描电镜下观察实验组与对照组成骨细胞在煅烧骨表面的贴附数量及形态,用细胞计数法测定细胞在两组材料的生长曲线,组织化学方法检测成骨细胞的ALP活性。结果：扫描电镜发现实验组成骨细胞的贴附数量显著高于对照组（P〈0．01）。细胞计数认为实验组细胞在材料上粘附数量多,增殖速度快。实验组ALP活性明显高于对照组（P〈0．01）。结论：胶原修饰的煅烧骨具有良好的组织相容性,能明显提高成骨细胞的贴附,并且促进成骨细胞活性维持,体外培养7～8天时,材料上的细胞数达到最大,应尽快植入体内。     

成骨细胞与生物衍生材料联合培养的实验研究

目的：探讨冻干脱钙骨基质（FDBM）作为组织工程骨支架的可行性。方法：取兔颅骨外膜的成骨细胞，经传代培养后作为种子细胞与FDBM于体外联合培养，通过对复合物相差显微镜、光镜及扫描电镜等观察，了解细胞在材料中的生长情况。结果：经系统处理后的FDBM呈现不规则的网－孔结构，其孔隙直径为100－400μm ,孔隙率为70％。体外复合培养8小时，成骨细胞即开始贴附于FDBM网架上；复合培养7天，分布于支架材料上的成骨细胞迅速分化增殖，分泌细胞外基质并形成钙结节。结论：FDBM可作为构建组织工程骨的一种较好支架材料。