CpG-ODN增强乙型肝炎病毒转基小鼠对重组乙肝疫苗的细胞免疫应答

[目的 ]探讨CpG -ODN作为佐剂对重组乙肝疫苗诱导乙肝病毒转基因小鼠产生细胞免疫应答的影响。[方法 ]用重组干扰素 (rIFNα - 2b)、重组乙肝疫苗 (rHBsvaccine)和重组乙肝疫苗 CpG -ODN分别免疫HBV转基因小鼠后 ,流式细胞仪检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群 ,ELISA法检测免疫小鼠的外周血IL - 2、IL - 12 (p70 )和IFN -γ的含量 ,MTT法和乳酸脱氢酶法分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能。[结果 ]重组乙肝疫苗组CD3 、CD4 、CD8 细胞在T细胞中所占百分比分别为 (2 5 .0 0 8± 2 .85 2 ) %、(13.6 40± 1.6 16 ) %、(9.989± 1.12 3) %均明显高于对照组 ,(P <0 .0 5 ) ;IL - 2、IL - 12 (p70 )和IFN -γ的含量分别为 (130 4 .2 88± 5 72 .2 12 ) pg/mL、(2 0 3.810± 91.80 7) pg/mL、(86 0 .736± 336 .888)pg/mL均明显高于对照组 ,(P <0 .0 5 ) ;淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应与对照组相比均有明显差异 ,(P <0 .0 5 )。疫苗 CpG -ODN组与疫苗组比较 ,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答 (P <0 .0 5 ) ,且以Th1型细胞免疫应答为主。而干扰素组由于给药次数和剂量等原因 ,与对照组无显著差异。 [结论 ]CpG -ODN作为佐剂可以较好的增强重组乙肝疫苗诱导HBV转基因小鼠产生细胞免疫应答。     

含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

CpG-ODN增强乙型肝炎病毒转基因小鼠对重组乙肝疫苗的细胞免疫应答

[目的] 探讨CpG-ODN作为佐剂对重组乙肝疫苗诱导乙肝病毒转基因小鼠产生细胞免疫应答的影响. [方法] 用重组干扰素(rIFNα-2b)、重组乙肝疫苗(rHBs vaccine)和重组乙肝疫苗+CpG-ODN分别免疫HBV转基因小鼠后,流式细胞仪检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群,ELISA法检测免疫小鼠的外周血IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量,MTT法和乳酸脱氢酶法分别检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖和杀伤功能. [结果] 重组乙肝疫苗组CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比分别为(25.008±2.852)%、(13.640±1.616)%、(9.989±1.123)%均明显高于对照组,(P<0.05);IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量分别为(1304.288±572.212)pg/mL、(203.810±91.807)pg/mL、(860.736±336.888)pg/mL均明显高于对照组,(P<0.05);淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应与对照组相比均有明显差异,(P<0.05).疫苗+CpG-ODN组与疫苗组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P<0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.而干扰素组由于给药次数和剂量等原因,与对照组无显著差异.[结论] CpG-ODN作为佐剂可以较好的增强重组乙肝疫苗诱导HBV转基因小鼠产生细胞免疫应答.     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.     

IL-12的真核表达载体对乙肝基因疫苗的免疫佐剂效应

观察编码鼠IL - 12的真核表达载体对HBVDNA疫苗诱导Balb/c小鼠免疫应答的影响。方法 :肌肉注射DNA疫苗 ,ELISA法检测小鼠血清抗HBs,4h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTL杀伤活性。结果 :免疫8周后 ,注射 pCR3.1组、注射 pCR3.1-S组及共注射IL - 12真核表达载体的血清OD值分别为 0 .0 4± 0 .0 1、0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15。CTL细胞杀伤活性分别为 (10 .1± 6 .4) %、(5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与pCR3.1组比较均有显著差异 (P <0 .0 0 1) ,后两组比较亦有显著差异 (P <0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗CD4 单克隆抗体处理后分别为 (48.3± 5 .9) %、(75 .6± 9.1) % ,抗CD8 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6±1.4) %、(16 .9± 2 .3) %。结论 :IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由CD8 执行。     

健康成年人乙肝疫苗接种免疫效果的观察

目的了解成年人乙型肝炎疫苗接种的免疫效果,控制乙型肝炎病毒通过港口职业因素传播。方法收集1998年港口有关单位职工HBV感染血清流行病学资料作为本底对照;2003年对同一范围人员采血测定HBV感染标志,将已接种乙型肝炎疫苗单位和未接种乙型肝炎疫苗单位分组进行比较,观察HBV血清流行率的变动趋势。结果2003年港口作业人员未接种乙型肝炎疫苗组的HBsAg携带率为11·0%,接种乙型肝炎疫苗组为8·2%·与1998年的12·3%相比,后者显示有差异性(P<0·05)。接种疫苗组与未接种疫苗组的HBsAb阳性率相比,接种组为69·0%,未接种组为20·9%,两者差异有显著性(P<0·05)。结论在港口作业人员中大规模接种乙型肝炎疫苗能有效控制乙型肝炎在人群中的水平传播。     

人类免疫缺陷病毒DNA疫苗黏膜免疫小鼠免疫力研究

目的以人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)疫苗免疫BALB/c(H-2d)小鼠为模型,探讨有效活化黏膜与系统免疫力的策略。方法将6~8周龄BALB/c小鼠随机分为6组,每组3只;利用DNA疫苗加或不加疫苗佐剂滴鼻途径进行黏膜引导免疫,利用重组痘苗天坛株疫苗进行系统加强的策略以提高机体免疫反应。DNA疫苗免疫时间是0、14、28d,剂量每只小鼠10μg/次;重组痘苗病毒加强免疫时间是第42天,剂量每只小鼠1×107PFU/次。初次免疫后第56天处死小鼠。ELISPOT和胞内染色测定T淋巴细胞免疫反应;ELISA法测血清特异的IgG和鼻咽部、肺部灌洗液特异的IgA。结果单独DNA疫苗黏膜免疫后只活化微弱的系统T细胞免疫(2±1)斑点形成细胞(spotformingcells,SFC/106个细胞),黏膜共同施用霍乱毒素可提高相应的系统T细胞免疫力(14±11SFC/106个细胞),重组痘苗天坛株疫苗系统加强后,分泌γ-干扰素(IFN-γ)的特异性T淋巴细胞升高4·5倍(61±35SFC/106个细胞);胞内染色可获得1·8%±1·4%HIV-1Gag特异性CD8+T细胞免疫反应,同时,血清中特异性IgG抗体与肺部灌洗液的特异性IgA抗体水平在痘苗天坛株疫苗系统加强后分别提高2倍吸光度(A)值:1·5±0·3和2·5倍(A值:1·8±0·8)。结论黏膜进行引导免疫并辅以系统加强的免疫策略可诱发有效的黏膜、系统体液免疫反应和T淋巴细胞免疫。     

空肠弯曲菌亚单位脂质体佐剂疫苗诱导的Th1/Th2应答机制研究

目的探讨空肠弯曲菌(Campylobacter jejun i,CJ)亚单位脂质体佐剂疫苗免疫新西兰兔后Th1/Th2应答机制。方法制备CJ亚单位阳离子和阴离子脂质体佐剂疫苗,用不同剂量(按蛋白质含量计算,0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg)的疫苗免疫新西兰兔,于末次免疫后10d采集血清,ELISA(双抗体夹心法)检测各组动物血清中IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-4、IL-6、IL-10的水平,同时设有CJ完全福氏佐剂免疫原对照组和生理盐水(NS)对照组。结果免疫组与CJ完全福氏佐剂免疫原对照组和NS对照组相比较,IL-4、IL-10水平与对照组相比有显著性升高(P<0.01),其中同一剂量(0.5mg/kg)不同佐剂组以CJ亚单位阳离子脂质体佐剂疫苗组升高明显(P<0.05),不同剂量同一佐剂疫苗组以0.5mg/kg组升高较明显(P<0.01),IL-2、IFNγ-、TNF-β水平各免疫组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。结论CJ亚单位脂质体佐剂疫苗诱导了以Th2应答为主的免疫应答类型。     

胸腺肽增强狂犬病疫苗免疫效果的研究

目的　探索胸腺肽作为人用纯化Vero -细胞狂犬病疫苗佐剂的可能性。　方法　分为单针和多针狂犬疫苗免疫方案。单针免疫是用狂犬疫苗 1支加胸腺肽 1针免疫 ;多针免疫按常规五针免疫程序 (即 0、3、7、14、2 8d各注射1针 ) ,加胸腺肽组按三针免疫程序 (即 0、7、2 8d各注射 1针 ) ,实验小白鼠每只均以狂犬病疫苗 0 .2ml与胸腺肽混合后肌肉注射。　结果　单针免疫加入胸腺肽 ( 2mg/只 )后抗体效价高且抗体产生时间早 ,抗体水平显著高于疫苗组 (P <0 .0 1)。而且加入胸腺肽 ( 6mg/只 )后免疫三针可达到五针常规疫苗免疫效果。　结论　胸腺肽作为人用纯化Vero -细胞狂犬病疫苗的佐剂可减少免疫次数。     

HBV S基因与IL-12基因联合免疫小鼠的免疫应答

目的 观察小鼠对IL-12基因表达质粒与HBVS基因疫苗联合免疫的免疫应答。方法 用已构建的HBVS基因疫苗（pCR3.1-S)和表达IL-12p35和p40蛋白的真核表达载体pWRG3169分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法检测小鼠血清抗-HBs及脾细胞对HBsAg的特异性增殖反应。结果 免疫接种2wk后小鼠血甭抗-HBs滴度及脾细胞对HBsAg的刺激指数均明显高于对照组,pWRG3169 pCR3.1-S组明显高于单纯pCR3.1-S注射组。结论 IL-12表达质粒可以增强pCR3.1-S基因疫苗诱导的体液和细胞免疫应答强度,尤以细胞免疫增高明显。     

白细胞介素2增强HBV基因疫苗的免疫效应

目的：构建乙型肝炎病毒基因疫苗ｐＣＲ３．１－Ｓ,观察重组人白细胞介素２（ｒｈＩＬ－２）作为佐剂对其诱导ＮＡＬＢ／ｃ小鼠产生免疫应答的影响．方法：以ＥＬＩＳＡ法检测免疫小鼠血清抗ＨＢｓ,另用＾３Ｈ－ＴｄＲ参入法测定淋巴细胞增殖活性,初步研究不同免疫组的体液和细胞免疫应答．结果：ｒｈＩＬ－２组免疫小鼠抗ＨＢｓ抗体和淋巴细胞增殖活性与对照组相比有显著差异（Ｐ〈０．０５）．结论：ＨＢＶ基因疫苗可诱发ＢＡＬ     

共刺激分子B7-1与汉坦病毒核蛋白基因共表达载体的构建及免疫调节作用

目的:探讨共刺激分子B7-1(CD80)对汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫调节作用.方法:构建双启动子共表达B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的真核表达载体pcDNA 3.1-B7-S,酶切鉴定后直接肌注免疫BALB/c小鼠,同时设对照组pcDNA 3.1 空质粒接种组、pcDNA 3.1-S接种组.ELISA法检测血清特异性抗体,MTT法检测T细胞增殖反应.结果:pcDNA 3.1-B7-S接种组鼠在抗体的产生水平及淋巴细胞增殖指数上均较pcDNA 3.1-S接种组明显增高.结论:接种B7-1基因和汉坦病毒核蛋白基因的共表达质粒优于注射单目的抗原基因表达质粒,为探索增强基因疫苗的免疫作用提供了新的途径.     

丙型肝炎病毒多CTL表位DNA疫苗免疫学特性的初步研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)疫苗研制并为抗HCV感染提供实验依据。方法:从HCV J株基因组中,选取小鼠(H-2d)CTL表位基因序列,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建相应的真核表达质粒,经肌肉免疫后,取受免疫小鼠血清和脾细胞,用ELISA及MTT法检测小鼠血清中IL-2和IFN水平及小鼠脾细胞的增殖活性。结果:实验组小鼠血清中IL-2及IFN水平明显高于对照组[IL-2:(208±8.88)比(106±6.06);IFN:(179.5±2.52)比(90.5±2.52),P<0.05];实验组淋巴细胞增殖指数明显高于对照组(1.56比1.13,P<0.05)。结论:本实验构建的pcDNA3.1(+)/HCV CTL真核表达质粒,经肌肉免疫后可以使受免疫小鼠细胞免疫应答水平提高,淋巴细胞增殖活性增高。     

插入CpG序列和IL—2基因的HBV重组真核表达载体的构建

目的：构建插入CpG序列和IL-2基因的HBV重组真核表达载体。方法：采用PCR产物直接克隆方法,构建了编码HBsAg基因的真核细胞表达载体pcDNA3.1^ -HBsAg;并以此为基础通过重组DNA技术分别构建了在不同位置含不同数目的CpG序列的重组质粒pcDNA3.1^ -S/CpG1、pcDNA3.1^ -S/CpG2、pcDNA3.1^ -S/CpG1 CpG2及IL-2和HBsAg融合基因的表达载体pcDNA3.1^ -S/IL-2。通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达。结果：通过酶切、PCR及测序证实已分别正确完整地插入IL-2基因和CpG序列,体外转染Cos-7细胞后可见基因的表达和分泌,结论：本实验成功构建了我们所设计的5种重组质粒,拟为今后探索优化基因疫苗的设计及HBV治疗性疫苗的研究奠定基础。     

小鼠对HBV DNA疫苗的免疫应答及细胞因子的免疫佐剂效应

目的 :观察编码小鼠 IL- 2及 IL- 12的真核表达载体 ,对 HBV DNA疫苗诱导 Balb/ c小鼠 (H- 2 d )免疫应答的调节作用及其对稳定表达 HBs Ag的小鼠肥大细胞瘤 P815细胞 (P 815 - HBV- S)成瘤性的影响。　方法 :肌内注射HBV DNA疫苗及细胞因子真核表达载体 ;背部皮下接种 P 815 - HBV - S细胞 ,观察成瘤情况 ;EL ISA法测定血清抗HBs;4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL 活性。　结果 :免疫 8周后 ,以 p CR3.1- S、p CR3.1- S+IL- 2及 p CR3.1-S+IL- 12免疫的小鼠血清 ,45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1、1.98± 0 .17及 1.6 7± 0 .15 ,均较 p CR3.1组显著提高(P<0 .0 5 )。CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %、(6 1.9± 7.1) %及 (73.3± 8.8) % ,后两组与 p CR3.1- S组比较差异均显著 (P<0 .0 5 )。脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 ,CTL细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) %、(5 6 .2± 7.5 ) %和 (75 .6± 9.1) % ,抗 CD8+ 单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) %、(13.6± 1.9) %和 (16 .9±2 .3) %。对照组成瘤率为 10 0 % ,p CR3.1- S组小鼠成瘤率为 12 .5 % ,p CR3.1- S+IL- 12真核表达载体组成瘤率为0 ,对照组平均存活期和 6周后存活率分别为 2 8.4天和 0天。后两组分别 >38.2天及 45     

CONSTRUCTION AND IMMUNOGENICITY OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 6B L1 RECOMBINANT PLASMID

Objective To construct a DNA vaccine as a prophylactic model to prevent condyloma acuminatum and detect its immunogenicity in mice. Methods The major capsid protein (L1) gene of human papillomavirus (HPV) 6b was inserted into an eukaryotic expression plasmid (pcDNA3.1). The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. Western blot were performed to detect whether L1 protein can be expressed in eukaryotic cells. Eighteen female BALB/c mice were tested for immunogenicity study. Results The recombinant plasmid (pcDNA3. 1-HPV6bL1) was verified as HPV6b L1 gene by sequencing. Western blot showed specific strip. Anti-L1 protein antibodies could be detected in the mice‘s sera inoculated with pcDNA3.1-HPV6bL1. Similarly, IL-4, IL-2, and IFN-γ were increased in the same mice. Conclusion HPV6b L1 recombinant plasmid was constructed successfully which had immunogenicity for BALB/c mice. It provided experimental evidence for the research of DNA vaccine of condyloma acuminata.     

含CpG免疫刺激序列的质粒增强HBsAg诱导的免疫应答

目的 探讨以含有多拷贝CpG寡脱氧核苷酸的质粒作为治疗性乙肝疫苗佐剂的可行性。 方法 构建含有6个拷贝D型CpG ODN的质粒pKO-CG6,将该质粒以及载体pKO分别刺激健康人以及HBV感染者的外周血单核细胞（PBMC）,检测PBMC的增殖以及分泌的细胞因子IFN-与IL-12,进一步将重组HBsAg分别联合这两种质粒免疫小鼠,检测小鼠的细胞和体液免疫应答。结果 质粒pKO-CG6与载体pKO在体外均能有效激活健康人以及HBV感染者PBMC的增殖反应,并促进IFN-与IL-12的产生,其中pKO-CG6的免疫刺激活性明显强于载体pKO。小鼠体内试验表明,虽然载体pKO也具有免疫佐剂作用,但pKO-CG6更能显著增强HBsAg诱导的免疫应答,尤其是细胞免疫应答。 结论 含有多拷贝D型CpG ODN的质粒能有效激活HBV感染者的PBMC,并增强HBsAg在小鼠体内的免疫原性,对于治疗性乙肝疫苗具有潜在应用前景。