聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应(PCR)产物的微孔酶免疫方法。方法 对PCR所用两条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔酶免疫法敏感性最强,加样量0.038μl时即可显色,模板DNA经过10~(11)倍稀释后仍为阳性结果;聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.312 5μl、1.25 μl及10~7、10~4稀释度。对临床脑脊液标本的检测结果微孔酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100％,二者敏感性均高于琼脂糖电泳。结论 微孔酶免疫法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好,所测结果可相对反映PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

聚合酶链反应检测肿瘤组织的端粒酶活性

目的：比较聚合酶链反应－微孔板杂交法（PCR－MPH）和聚合酶链反应－聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PCR－PAGE）检测肿瘤组织端粒酶活性的临床价值。方法：PCR－MPH以地高辛标记端粒重复片段特异的探讨与PCR变性产物杂交,经酶底物显色,通过测定吸光度判断结果;PCR－PAGE方法直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离PCR扩增端粒酶的合成产物,经银染色,分析端粒酶活性。结果：PCR－MPH方法能准确、特异地检测出肿瘤组织的端粒酶活性,其灵敏度比PCR－PAGE法高100倍,结论：两种方法均可用于临床检测,只是PCR－MPH方法更简单、便一些。     

半巢式聚合酶链反应-微孔板杂交法检测沙眼衣原体

目的：应用半巢式聚合酶链反应－微孔板杂交法（半巢式PCR－MPH）检测泌尿生殖道沙眼衣原体（Ct)。方法：分别用质粒和主要外膜蛋白基因引物进行扩增，将下游引物用生物素标记，经半巢式PCR扩增Ct主要外膜蛋白基因后，扩增产物被包被有链霉亲和素的微孔板捕获，经碱变性后与标有荧光素的特异性探针进行杂交，然后通过辣根酶标记的抗荧光素抗体与杂交分子反应，经过酶底物显色，通过测定吸光度来判断结果。结果：主要外膜蛋白基因引物半巢式PCR较质粒引物PCR更敏感，比半巢式PCR产物酶切后电泳法高10倍，半巢式PCR－MPH法特异性强，该法重复法好，批内CV值＜10％，批间CV值＜15％，该法在包被浓度为4mg/L，产物1：20稀释，与微孔板结合20min后加入10pmol/mL探针杂交30min,用1：3000稀释的酶显色条件下有最佳结果，结论：该法操作简便，敏感性和特异性均高，无放射性和EB染料污染，适于临床样本的常规检测。     

用聚合酶链反应微孔板杂交技术检测HBV DNA

目的 :建立并优化HBVDNA的PCR 微孔板杂交技术检测体系 ,使临床PCR结果判定更加客观可靠。方法 :采用碱裂解标本中的HBV、玻璃粉吸附提纯模板DNA ,用 5’端标记生物素的引物进行PCR ,PCR扩增产物与包被于微孔板中的靶基因杂交 ,酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合后 ,用酶底物与所标记酶进行显色反应 ,最后通过测定其光密度来判定结果。结果 :建立并优化的PCR 微孔板杂交检测方法提高了检测的灵敏度和特异性。PCR 微孔板杂交法对HBVDNA的检出阳性率 (79.8% )比电泳法 (6 9.0 % )高 ,2 0份非乙肝患者血清标本两方法检测均阴性。结论 :本方法灵敏、特异、操作简便、快速、结果客观可靠。     

应用探针微孔板杂交技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

寻找一种检测孕妇血浆中胎儿DNA新方法,采用SPY探针微孔板杂交法,通过PCR产物与SRY探针杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值,结果发现：探针微孔板杂交检测法的灵敏性和特异性均高于电泳检测方法,提示：探针微孔板杂交检测技术的灵敏性和特异性较高,更适用于临床应用。     

应用探针微孔板杂交技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究

寻找一种检测孕妇血浆中胎儿DNA新方法.采用SRY探针微孔板杂交法,通过PCR产物与SRY探针杂交,然后通过辣根过氧化物酶标记的抗生物素进行酶联显色,读取光密度值.结果发现探针微孔板杂交检测法的灵敏性和特异性均高于电泳检测方法.提示探针微孔板杂交检测技术的灵敏性和特异性较高,更适用于临床应用.     

聚合酶链反应一微孔板杂交技术用于乙型肝炎病毒DNA的检测

目的建立乙肝病毒DNA的聚合酶链反应(PCR)-微孔板杂交法,使PCR结果判定更加客观.方法我们使用煮沸裂解法提取模板DNA,将PCR引物5'端标记生物素,用PCR产物与包被有亲和素的微孔板结合,并与含荧光素特异探针杂交,酶标记抗荧光素抗体与之结合进行显色反应,通过测定其吸光度来判断结果.结果所建立的PCR-微孔板杂交法的阳性检出率(68/160)比PCR-电泳法(60/160)高,检测时间约是Kdler法的1/10.结论该法较敏感、特异和客现地检测临床标本中的乙型肝炎病毒DNA.     

聚合酶链反应—微孔板杂交技术用于乙型肝炎病毒DNA的检测

目的：建立乙肝病毒DNA的聚合酶链反应（PCR）－微孔板杂交法,使PCR结果判定更加客观。方法：我们使用煮沸裂解法提取模板DNA,将PCR引物5′端标记生物素,用PCR产物与包被有亲和素的微孔板结合,并与含荧光素特异探针杂交,酶标记抗荧光素抗体与之结合进行显色反应,通过测定其吸光度来判断结果,结果：所建立的PCR－微孔板杂交法的阳性检出率（68／160）比PCR－电泳地（60／160）高,检测时间约是Keller法的1／10。结论：该法较敏感、特异和客观地检测临床标本中的乙型肝炎病毒DNA。     

RT—PCR—ELISA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度的初步研究

目的应用核酸扩增产物测定的固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用RT-PCR-ELISA，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取吸光度(A值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度，并与常规细胞培养法(CCID50）比较。结果本方法与细胞培养法的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RTPCR—EUSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

RT-RCR产物固相杂交-酶联显色方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度

目的应用RT-PCR-EIJSA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用固相杂交一酶联显色方法，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取光密度值(OD值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度。并与常规细胞培养法(CCID50)比较。结果证明本方法与细胞培养法(CCID50)的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RT-PCR-EIJSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

改良的降落PCR与普通PCR结果比较

目的：设计并验证一改良的降落PCR(MTD—PCR)程序。方法：自盐藻bardawi1中提取基因组DNA作为PCR模板，使用TaqDNA聚合酶及pfu DNA聚合酶，运用普通PCR和MTD—PCR程序，扩增胡萝卜素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列，并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果：使用普通Taq酶进行PCR，普通PCR程序产生200bp，500bp和1272bp的3条带，而MTD—PCR程序仅克隆出1272bp的特异带；利用高保真的pfu DNA聚合酶作PCR，在MTD—PCR泳道中也仅有1272bpl条带，而普通PCR除了产生1272bp的特异带外，还出现1条500bp的非特异带。结论：无论使用普通Taq酶或高保真酶pfu，改良的MT—PCR程序均明显提高PCR的特异性，提示它可用于克隆普通PCR难以克隆的基因片段，或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。     

PCR佐剂在单细胞PCR技术中的优化应用

目的:探索一种优化的单细胞PCR佐剂,应用于分子病理学研究中单细胞基因的检测。方法:从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取单个淋巴细胞,优化单细胞PCR反应体系进行actin基因检测。对照组不添加PCR佐剂,实验A、B、C组分别添加PCR佐剂二甲基亚砜、甘油、牛血清白蛋白。结果:对照组、实验A、B、C组的单细胞扩增阳性率分别为5%,7.5%,10%,45%,对照组和实验A、B组的单细胞扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而实验C组的单细胞扩增阳性率显著性高于对照组和实验A组(P<0.01)。结论:牛血清白蛋白是最佳的单细胞PCR佐剂,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性。     

PCR基因芯片

基因芯片(gene chips)可以快速、微型化、自动化地检测大量基因,成了生物医学研究的重要推动力.随着微加工技术的发展, 我们建立了有1 200个微反应池的PCR基因芯片,将基因芯片和聚合酶链式反应(PCR)技术结合在一起.PCR基因芯片综合了基因芯片体积小却可以检测大量基因,以及PCR敏感而且容易发现各种基因变异的特点,采用以PCR 为基础,而非以分子杂交为基础的检测方式,克服了杂交技术所存在的内在缺陷,大大增强了实验的敏感性和可重复性;扩展了基因芯片在生物医学领域中应用的范围,更适用于各种基因重排、基因突变和基因缺失的鉴定.PCR反应采用荧光探针作实时定量分析.在临床肿瘤和白血病的诊断、人类基因组分析、基因多态性和疾病易感性鉴定、遗传性疾病的基因诊断、动物和植物基因变异筛选、各种病原微生物鉴定等多方面会有广泛应用前景.     

用PCR结合甲基化特异PCR方法检测遗传性脆性X综合征

目的 建立一种快速、灵敏、廉价的实验室检测脆性X综合征(FXS)的方法.方法 检测130例样本的(CGG)n重复数.首先,PCR扩增脆性X智力低下基因Ⅰ(FMRⅠ)的(CGG)n重复序列;其次,进行甲基化特异性PCR (MS-PCR),对男性不能有效扩增和女性样本的基因组DNA进行亚硫酸氢钠脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,用两套不同的引物对(甲基化特异性引物对和非甲基化特异性引物对)扩增FMRⅠ基因的(CGG)n重复序列区,PCR产物测序.结果 所有样本的(CGG)n重复数都在13～47之间;测序结果表明FMRⅠ基因中的非甲基化的C碱基转变为T碱基,甲基化的C碱基保持不变.结论 PCR结合MS-PCR方法可以同时检测FMRⅠ基因的 (CGG)n重复数和CpG岛的甲基化情况,为临床检测FXS提供了依据.     

PCR及Real-time PCR评价细菌DNA提取方法

目的:比较几种不同的细菌DNA提取方法,建立一种适于PCR和Real-time PCR的细菌DNA提取方法.方法:分别用蛋白酶K法、碱裂解法、Chelex-100 NP40、Chelex-100 TritonX-100法和水煮法提取同种浓度大肠杆菌DNA,测定OD260/280;用不同方法提取不同浓度的大肠杆菌DNA,进行PCR和实时荧光定量PCR扩增,比较灵敏度.结果:5种方法提取细菌DNA,其中Chelex-100 NP40 法纯度(OD260/280=1.79±0.03)最高,此方法所提取的DNA产物进行PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,其灵敏度为10个/ml细菌浓度.结论:Chelex-100 NP40的细菌DNA提取方法纯度及灵敏度高,且适应于PCR及Real-time PCR.     

博尔纳病病毒荧光定量PCR试剂盒扩增缓冲液的优化

目的 选择并优化博尔纳病病毒荧光定量PCR TaqMan探针法反应体系中的扩增缓冲液,使PCR反应体系对该病毒p24模板基因的扩增效率得到明显提高.方法 通过常规PCR比较选择3种常用酸(盐酸、磷酸和硫酸)所滴定的缓冲液体系,在其基础上选择适合浓度的硫酸铵配制TSS buffer,在TSS buffer中分别加入四甲基...     

Real-time PCR与常规PCR在Q热立克体检测中的比较

目的比较与评价Real-time PCR与常规PCR,寻求适合于Q热患者早期诊断的方法。方法应用Taq Man探针定量PCR、SYBR Green染料定量PCR、巢式PCR和普通PCR四种方法分别对T-A克隆的Q热立克次体基因htp AB片断进行灵敏性、特异性和重复性检测及评价。结果 Taq Man PCR方法的灵敏度分别为SYBR Green PCR、巢式PCR和普通PCR的10倍、10倍和100倍。重复性测试Taq Man法Ct变异系数CV:0.2%~3.0%,SYBR Green法的CV:0.3%~6.0%。Taq Man和SYBR Green PCR均耗时约1h,巢式PCR耗时约2.5h,普通PCR耗时约1.5h。四种方法检测25种相关病原菌结果均为阴性。结论 Taq Man探针定量PCR方法具有很好的特异性、灵敏性、重复性和可操作性,可用于Q热患者临床早期诊断。     

PCR法与荧光定量PCR法在人巨细胞病毒检测中的作用比较

目的 比较常规PCR法与荧光定量RCR（RQ-PCR）法在人巨细胞病毒（HCMV）检测中的作用,寻找更适合于HCMV检测的方法。方法 构建携带CMV-DNA的标准质粒,利用常规PCR技术及FQ-PCR技术分别对不同稀释度的标准质粒进行检测。结果 FQ-PCR法对HCMV,标准质粒检测的灵敏度及线性范围均显著高于常规RCR法。结论 RCP法比常规PCR法更适合HCMV病毒的检测。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。