卵巢癌抗独特型微抗体刺激树突细胞激活的T细胞对自体卵巢癌细胞杀伤作用的研究

背景与目的：以抗原肽、蛋白、肿瘤细胞冻融物致敏树突细胞的肿瘤免疫治疗已在多种肿瘤展开。6B11抗独特型微抗体能模拟卵巢癌相关抗原OC166-9,本研究用6B11抗独特型做抗体体外刺激树突细胞,以诱导出对卯巢癌患者自体肿瘤细胞抗原特异性的细胞毒作用。方法：取10例卵巢癌患者的外周血,分离并诱导培养树突细胞,在培养过程中用6B11抗独特型微抗体刺激,促成熟后在体外激活自体T细胞。^3H-TdR掺入法测DCs对自体T细胞刺激增殖的作用;^51Cr6h释放实验测激活的T细胞对自体肿瘤细胞特异性的杀伤。结果：9例中有4例(#4,#5,#7,#10)6B11微抗体负载组DC刺激自体T细胞增殖^3H-TdR掺入的cpm值高于对照组;杀伤实验的10例患者中5例(#1,#2,#4,#7,#9)6B11微抗体负载组DC刺激自体T细胞(简称MINI-DC-T)对自体肿瘤细胞有特异性杀伤。在效靶比为20：1时,各组不同的效应细胞对自体肿瘤细胞的杀伤率分别为：MINI-DC-T组25％～100％、F(ab)’2-DC-T组18％～40％、unpulsed-DC-T组13％～43％、T细胞组9％～58％,MINI-DC-T组高于其它各组。在效靶比为20：1时,4例(#l,#2,#4,#9)患者MINI-DC-T对自体肿瘤细胞及SKOV3、HLE、K562细胞的杀伤率分别为25％～100％、5％～51％、2％～38％和2％～25％。MINI-DC-T对自体肿瘤细胞的杀伤高于对照组靶细胞,并且这种杀伤可以部分地被anti-MHC-Ⅰ类抗体阻断。说明不同抗原负载DC诱导的CTL对自体肿瘤细胞的杀伤有抗原特异性。结论：6B11抗独特型微抗体可以模拟卵巢癌相关抗原,用它刺激的树突细胞在体外可以诱导出抗原特异性细胞毒T细胞。     

树突细胞对肿瘤浸润淋巴细胞抗乳腺癌免疫活性影响的研究

背景与目的:树突细胞(dendriticcell,DC)又称树突状细胞,是目前已知的功能最强的抗原呈递细胞,它可以在体内、外向T淋巴细胞呈递抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)反应。本研究旨在探讨DC激活的肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TIL)体外对乳腺癌细胞的杀伤活性。方法:从乳腺癌患者外周血获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)、白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和肿瘤抗原激活DC,然后用DC激活TIL,观察TIL在体外对自体乳腺癌细胞和Bcap-37乳腺癌细胞的杀伤活性。结果:DC激活的TIL对自体乳腺癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率为(85.76±2.93)%,明显高于未经DC激活的TIL、DC激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体乳腺癌细胞的杀伤率犤分别为(52.11±1.48)%、(51.35±1.46)%和(3.59±0.25)%犦。而它们对Bcap-37乳腺癌细胞的杀伤活性则相对较低犤分别为(40.03±1.29)%、(22.09±0.87)%、(21.66±0.85)%和(1.76±0.14)%犦。结论:乳腺癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗乳腺癌免疫活性。     

树突细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞抗肝癌免疫活性的研究

目的　探讨树突细胞 (DC)激活的肿瘤浸润性淋巴细胞 (TIL)体外对肝癌细胞的杀伤活性。方法　从肝癌患者外周血获取DC ,应用粒 /巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF)、白细胞介素 -4 (IL -4 )和肿瘤抗原激活DC ,然后用DC激活TIL ,观察TIL在体外对自体肝癌细胞和Hep3B细胞的杀伤活性。 结果　DC激活的TIL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性 ,杀伤率为89 .39%± 3.0 5 %,明显高于未经DC激活的TIL、DC激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体肝癌细胞的杀伤率(分别为 5 5 .2 3%± 1.5 3%、5 4.89%± 1.48%和 3.6 5 %± 0 .2 6 %)。而它们对Hep3B细胞的杀伤活性则相对较低。 结论　肝癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗肝癌免疫活性。     

小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞纯化方法的比较

目的比较流式细胞分选技术(FACS)及免疫磁珠分选技术(MACS)对小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞NKDC分选纯化的效率,为自然杀伤性树突细胞的深入研究创造基本条件。方法 制备小鼠脾脏单细胞悬液,细胞悬液经70μm细胞滤膜过滤,离心滤液,用红细胞裂解液裂解沉淀中的红细胞,用缓冲液洗涤两次后通过FACS和MACS分选方法各自分选其脾脏表型为NK1.1+CD11c+的自然杀伤性树突细胞NKDC。结果 分选之前小鼠脾脏NK1.1+CD11c+自然杀伤性树突细胞占3.3%。单细胞悬液经FACS分选的NKDC纯度为(90.2±2.0)%,回收率为(91.3±1.8)%,细胞活力(82.5±1.2)%;经MACS分选纯度为(70.5±3.0)%,回收率为(80.5±1.7)%,细胞活力为(60.2±0.8)%。两种方法分选NKDC细胞纯度差异有统计学意义(P=0.03),回收率差异也有统计学意义(P=0.02)。结论 FACS较MACS可更高效、快捷、简便地纯化小鼠脾脏自然杀伤性树突细胞。     

成熟与非成熟树突细胞生物学特征

树突细胞(DC)是目前抗原提呈功能最强的细胞。在免疫应答反应中起着举足轻重的作用。它分布于全身除脑以外的各脏器,数量极微,仅占外周血单核细胞的1％。成熟的DC经抗原刺激后致敏回输机体,可诱导抗原特异的细胞毒T细胞。DC连接着非特异性先天免疫反应和特异性获得     

树突状细胞与卵巢癌的免疫治疗

树突状细胞(DC)是目前发现的体内功能最强的专职抗原提呈细胞,可在体内外激活初始T细胞,并有效诱发细胞毒性T淋巴细胞反应,在抗肿瘤免疫中发挥重要作用.近年来采用DC疫苗进行抗肿瘤治疗已成为肿瘤生物治疗领域的热点之一.DC抗肿瘤机制及DC疫苗在卵巢癌治疗中的应用等研究也取得了很大进展.     

自体宫颈癌-树突细胞疫苗激活的CTL杀伤效应

背景与目的:树突细胞(dendriticcells,DC)是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞(antigen-presentingcell,APC),它可以在体内、外向T淋巴细胞递呈抗原,并诱发细胞毒T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocyte,CTL)反应。本研究旨在探讨负载自体宫颈癌抗原的DC体外激发的CTL对自体宫颈癌细胞的杀伤效应。方法:先冻融宫颈癌细胞制备抗原,然后以GM-CSF、IL-4诱导自体外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)获得DC并负载抗原,刺激自体T淋巴细胞制备宫颈癌抗原特异性CTL,观察CTL对宫颈癌细胞的杀伤活性。结果:负载自体宫颈癌抗原DC诱导的特异性CTL对自体宫颈癌细胞的体外杀伤率高达79.32%～89.27%,显著高于淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkillingcells,LAK)的杀伤率(t≥2.89,P<0.05);且对宫颈癌HeLa细胞株具有一定杀伤效应(40.35%～58.09%),但低于自体癌细胞组(t≥2.97,P<0.05);特异性CTL对HepG2、MCF7、A549、MGC803细胞无明显杀伤效应。结论:自体宫颈癌-树突细胞疫苗体外诱导的CTL具有高效而特异的抗自体宫颈癌细胞免疫活性,可望成为宫颈癌生物治疗的一个有力手段。     

流式细胞术检测化疗前后卵巢癌细胞凋亡的临床意义

目的：探讨化疗前后卵巢癌细胞及外周血淋巴细胞凋亡的因子Ｆａｓ、Ａｐｏ２．７的含量及其临床意义。方法：从７５例化疗前后卵巢癌患者的腹水中提取富含癌细胞的悬液,用Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＴＴＣ／ＰＩ双染法分辨凋亡的亡细胞及坏死细胞及坏死细胞,并以两种凋亡因子克隆抗体Ｆａｓ和Ａｐｏ２．７标记上述细胞,均用流式细胞仪检测。结果：化疗后卵巢癌细胞凋亡率显著高于化疗前的临床疗效好,反之疗效差,被Ｆａｓ及Ａｐｏ２     

骨髓瘤独特型抗原致敏树突细胞诱导的主动免疫反应

背景与目的:大多数多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)无法通过大剂量化疗和造血干细胞移植治愈,应用树突细胞(DCs)瘤苗清除MM患者化疗后残留的骨髓瘤细胞,是近年来骨髓瘤免疫疗法的新策略。本研究旨在探讨负载Id的DC独特型瘤苗对自体MM细胞的体外杀伤作用。方法:从MM患者外周血中分离获取DCs前体细胞,用GM鄄CSF与IL鄄4诱导分化,培养第5天加入从患者血清中提取的IgG的F(ab’)2片段(Id),第7天加TNF鄄α促成熟,将Id冲击致敏的DCs与自体T淋巴细胞共培养3天,获得肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。MTT法检测致敏DCs促自体T淋巴细胞增殖能力,以及患者CTLs对自体MM细胞的特异性细胞毒杀伤作用。结果:GM鄄CSF、IL鄄4和TNF鄄α联合可以有效地从MM患者外周血单核细胞中诱导出大量成熟的功能性DCs。MM患者自体血清Id冲击致敏的成熟DCs能够显著提高T细胞增殖能力,且与DC∶T的比值呈正相关;同时在1∶10时刺激细胞为负载了Id的成熟DC组刺激指数(SI)值(39.1±6.0)%,明显高于未经Id刺激的成熟DC组、经Id刺激的未成熟DC组以及未经Id刺激的未成熟DC组[(19.3±7.7)%、(15.9±6.1)%和(11.4±4.9)%]。负载了Id的成熟DC能够使幼稚T细胞活化成为肿瘤独特型CTLs,各个剂量的CTLs均能诱导出针对自体MM细胞的抑制性杀伤反应,并且     

CIK治疗后肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞变化研究

目的:探讨CIK(CellInductionKiller)治疗后肿瘤患者的免疫功能状态。方法:采用流式细胞术检测20例肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞。结果:肿瘤患者CD3+、CD4+、CD3-/CD16+56+细胞和CD4/CD8比值明显低于对照组并呈显著性差异,而CD8+细胞高于对照组(P<0.01)。CIK生物治疗后CD3+、CD4+、CD3-/CD16+56+细胞和CD4/CD8比值都升高,其中CD4+、CD3-/CD16+56+细胞与治疗前比较呈显著性差异(P<0.05),而CD8+细胞与治疗前比较降低(P<0.05)。结论:肿瘤患者的免疫功能低下,CIK生物治疗能够提高机体的免疫功能。流式细胞术对患者免疫功能的监测,具有快速、灵敏、准确的特点,对于评价疗效、判断预后具有重要价值。     

卵巢恶性肿瘤手术及化疗前后外周血免疫细胞亚群的检测

目的:探讨卵巢恶性肿瘤手术及化疗前后外周血免疫细胞亚群的改变及临床意义。方法:采用单克隆抗体和流式细胞仪对208例卵巢恶性肿瘤手术前后、化疗前后和200位正常人对照组进行外周血免疫细胞亚群动态检测并比较活性。结果:肿瘤组手术前CD3、CD4、CD4/CD8和NK显著低于对照组,P值分别为0·000、0·000、0·000和0·009。手术后较手术前IL-2和CD3升高,P值分别为0·000和0·000。化疗后较化疗前CD3、CD4和CD4/CD8升高,P值均为0·000;NK下降,P=0·009。Ⅲ~Ⅳ期较Ⅰ~Ⅱ期CD3、CD4、CD4/CD8和NK下降,P值分别为0·003、0·000、0·000和0·000。不同细胞分化程度术前各项指标差异无统计学意义,P>0.05。结论:卵巢恶性肿瘤患者细胞免疫功能低下,手术创伤可导致免疫力下降。疾病分期晚者免疫力差。手术、化疗后由于肿瘤负荷、抑制因子减少免疫力逐渐上升。     

肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞对大鼠卵巢上皮癌免疫治疗的体内研究

目的：研究树突状细胞（dendritic cells,DC）与肿瘤细胞裂解物致敏的树突状细胞（tumor-associated antigen／dendritic cells,TAA／DC）对荷瘤大鼠的免疫治疗效果。方法：建立大鼠卵巢癌皮下移植瘤模型;于成瘤后2周分别用PBS、DC或TAA／DC进行免疫治疗,比较治疗效果。结果：TAA／DC抑制肿瘤细胞的增殖与转移,对荷瘤大鼠治疗后8周,局部肿瘤无明显增长,P=0．355,无转移灶出现;TAA／DC可明显改善大鼠免疫状况,对荷瘤大鼠治疗后3周,使已经下降的CD8^＋ T细胞百分比又明显上升,P=0．000;TAA／DC对荷瘤大鼠单次免疫治疗的效果具有时限性,在对荷瘤大鼠治疗后8周,CD8^＋ T细胞百分比再次出现明显下降,P=0．000。结论：TAA／DC可改善荷瘤大鼠的细胞免疫状态,抑制肿瘤细胞的增殖与转移。     

DC-CIK过继性细胞免疫治疗对卵巢癌患者的预后及免疫功能的影响

目的:探讨自体DC-CIK细胞疗法改善卵巢癌患者的预后及免疫功能的能力。方法:回顾性分析2014年1月至2015年12月在中国医科大学附属盛京医院均接受了规范的初始治疗、达到完全缓解（CR）的卵巢癌患者90例。分析比较其基本条件、免疫指标、无瘤生存时间及不良反应。结果:经DC-CIK生物免疫治疗的患者外周血CD3+、CD4+细胞百分率,CD3+、CD8+细胞百分率及CD4+/CD8+比值均上升,NK细胞即CD16+、CD56+细胞增多,同时随着疗程数的增多,升高的更加明显（P<0.05）。一线治疗后,单纯观察组平均无瘤生存时间为15.88±2.7个月明显少于DC-CIK生物免疫治疗组的22.5±4.13个月（P=0.039）。其中使用DC-CIK生物免疫治疗疗程≥5程的平均无瘤生存时间为27.25±4.53个月明显高于DC-CIK生物免疫治疗疗程≤4程的19.69±2.81个月,两者相比差异无明显统计学意义（P=0.412）。所有患者DC-CIK细胞治疗后血常规及肝肾功能检测与治疗前及单纯观察组患者相比无明显变化,也未见明显不良反应。结论:DC-CIK免疫治疗提高卵巢癌患者的免疫反应,改善卵巢癌患者预后,未见明显不良反应。     

Altered maturation of peripheral blood dendritic cells in patients with breast cancer

Tumours have at least two mechanisms that can alter dendritic cell (DC) maturation and function. The first affects the ability of haematopoietic progenitors to differentiate into functional DCs; the second affects their differentiation from CD14+ monocytes, promoting an early but dysfunctional maturation. The aim of this study was to evaluate the in vivo relevance of these pathways in breast cancer patients. For this purpose, 53 patients with invasive breast cancer were compared to 68 healthy controls. To avoid isolation or culture procedures for enrichment of DCs, analyses were directly performed by flow cytometry on whole-blood samples. The expression of surface antigens and intracellular accumulation of regulatory cytokines upon LPS stimulation were evaluated. The number of DCs, and in particular of the myeloid subpopulation, was markedly reduced in cancer patients (P<0.001). Patient DCs were characterized by a more mature phenotype compared with controls (P=0.016), and had impaired production of IL-12 (P<0.001). These alterations were reverted by surgical resection of the tumour. To investigate the possible role of some tumour-related immunoactive soluble factors, we measured the plasmatic levels of vascular endothelial growth factor, IL-10 and spermine. A significant inverse correlation between spermine concentration and the percentage of DCs expressing IL-12 was found. Evidence was also obtained that in vitro exposure of monocyte-derived DCs to spermine promoted their activation and maturation, and impaired their function. Taken together, our results suggest that both the above-described mechanisms could concomitantly act in breast cancer to affect DC differentiation, and that spermine could be a mediator of dysfunctional maturation of DCs.     

Clusterin在卵巢上皮性癌患者外周血中的蛋白水平及其临床意义

目的：检测卵巢癌患者外周血中clusterin蛋白水平,并探讨其临床意义。方法：采用酶联免疫吸附分析法分别测定137例卵巢癌患者、12例卵巢交界性肿瘤患者、10例卵巢良性肿瘤患者、41例盆腔良性疾患病人和58例健康人外周血血浆中clusterin蛋白水平。结果：卵巢癌患者血浆中的clusterin蛋白水平[（109.37±52.37）ng/ml]显著高于健康人对照组[（102.61±18.48）ng/ml,P=0.021]。在卵巢癌患者组,发生远处转移的患者外周血的clusterin蛋白水平显著高于未发生远处转移者（P〈0.01）;血浆中的clusterin蛋白水平在卵巢癌不同分期、分化和有无淋巴转移等临床病理指标间的差异无统计学意义。结论：卵巢癌患者外周血中clusterin蛋白水平显著高于健康人群,并且可能与卵巢癌远处转移有关。     

人脐血树突状细胞抗神经胶质瘤的体外免疫效应研究

目的　研究肿瘤抗原致敏的树突状细胞 (DC)对神经胶质瘤细胞的免疫杀伤效应。方法　应用免疫磁珠分选脐血 CD34细胞 ,经 SCF FL3 GM- CSF IL- 4 TNF- α的联合诱导培养 DC,采用相差显微镜观察树突状细胞的形态 ;流式细胞仪作 DC的表面标志检测 ;MTT比色法测定同种异型的混合淋巴细胞反应能力和诱导CTL 毒性的检测。结果　 (1)脐血 CD34细胞在体外经细胞因子联合刺激后呈典型的 DC形态 ;(2 )流式检测 CD4 0、CD80和 CD86等成熟 DC特异性表面标志呈高表达 ,分别与诱导前比较 ,差异均有显著性 ;(3) MTT法测得脐血来源的 DC较外周血 DC刺激同种异体 T淋巴细胞增殖能力弱 ;经肿瘤抗原负载的 DC体外诱导出较强 CTL 毒性。结论　脐血 CD34细胞经体外扩增诱导的 DC具有典型的 CTL 毒性 ,为临床应用脐血来源 DC抗神经胶质瘤的生物治疗提供了理论依据     

肺癌患者红细胞免疫功能与外周血T淋巴细胞亚群的改变

目的：观察肺癌患红细胞免疫功能及T淋巴细胞亚群的变化。方法：应用红细胞免疫粘附花环形成法和流式细胞仪检测法。结果：（1）肺癌组（55例）红细胞C3b受体花环率（RBC－C3bRR)、CD3^ 、CD4^ 、CD^ ／CD^8 比值低下正常人（20例）（P＜0．05－0．01）,红细胞免疫复合物花环率（RBC－ICR）依次高于肺良性肿瘤组（15例）和正常人（P＜0．05－0．01）。（2）肺癌RBC－C3bRR与CD4^ /CD8^ 成直线正相关（P＜0．01,r=0.9131)。（3）Ⅲa,Ⅲb期肺癌,RBC－C3bRR,CD3^ ,CD4^ ,CD4^ /CD8^ 比值低于Ⅰ、Ⅱ期肺癌患和正常人（P＜0．05－0．01）,而RBC－ICR高于正常人（P＜0．01）。Ⅰ、Ⅱ期病人CD3^ ,CD4^ ,CD8^ 低于正常人（P＜0．01）,RBC－ICR高于正常人（P＜0．01）。结论：肺癌患RBC免疫和T细胞亚群的测定及其相关性分析,对于肺癌的诊断、治疗及病情预后估计有一定价值。     

上皮源性卵巢癌干细胞的研究进展

肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是肿瘤组织内具有自我更新能力以及无限增殖和多向分化潜能的一群细胞,对化疗药物耐受.卵巢癌干细胞(epithelial ovarian cancer stem cells,EOCSCs)在卵巢癌的发生发展、侵袭转移和耐药复发过程中都起到了重要作用.传统的肿瘤细胞减灭术联合顺铂、紫杉醇全身化疗对减小肿瘤体积,缓解临床症状具有一定的作用,但治疗后残留的EOCSCs能够短时间内重建肿瘤组织,是卵巢癌复发和难治的根本原因.深入了解EOCSCs的生物学特性,探索EOCSCs的发生发展机制,研究针对EOCSCs的靶向治疗药物,是抗肿瘤治疗的关键.     

Novel target antigens for dendritic cell-based immunotherapy against ovarian cancer

Identification of tumor-specific target antigens has been a major hurdlefor the treatment of malignant disease by vaccination or immunotherapy. A second challenge has been the induction of therapeutically effective immune responses to these ‘self’ antigens. The recent recognition of dendritic cells as powerful antigen-presenting cells capable of inducing primary T-cell responses in vitro and in vivo – in combination with identification of tumor-specific antigens – has generated widespread interest in dendritic cell-based immunotherapy against a wide variety of tumors. In this review, a series of recently identified novel ovarian tumor antigens is discussed, and the potential for therapeutic dendritic cell vaccination targeted against these antigens is assessed.     

流感疫苗促进髓系白血病骨髓细胞来源树突状细胞的功能

目的: 研究流感疫苗对髓系白血病骨髓源性树突状细胞（dendritic cells,DCs）功能的影响及其机制。方法：分离髓系白血病患者\[急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)19例, 慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML) 8例\]骨髓单个核细胞（mononuclear cell,MNC）,用GMCSF和IL4诱导7 d,获得未成熟白血病DCs,然后加入全病毒灭活流感疫苗（whole inactivated influenza vaccine, WIV）、裂解病毒流感疫苗（split influenza vaccine,SIV）或TNFα继续培养24 h。R显带法分析DCs染色体核型,流式细胞仪检测DCs表型,ELISA法测定DCs培养上清IL12的水平,CCK8法检测DCs诱导的CTL对自体白血病细胞的细胞毒作用。结果：19例AML患者中的15例及8例CML患者的MNC全部成功诱导出DCs。与TNFα刺激的白血病DCs相比,流感疫苗刺激的白血病DCs表面分子（CD80、CD83、CD86、HLADR）表达明显上调（P<005）,培养上清中IL12的分泌水平明显增加（P<0.05）,其诱导的CTL可显著杀伤自体白血病细胞（P<0.05）;WIV刺激的DCs在表型、IL12分泌水平及细胞毒作用方面均较SIV刺激的DCs显著增高（P<0.05）。结论： 流感疫苗促进髓系白血病源DCs表型成熟及IL12的分泌,增强其诱导的CTL对自体白血病细胞的杀伤作用。