Bcl-2介导的芹菜素抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用

目的探讨芹菜素(apigenin,Api)在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用,并阐明Api对心肌损伤的保护作用是否主要由Bcl-2介导。方法培养H9c2心肌样细胞;随机分为正常对照(Cont)组、缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation,A/R)组、Api预处理组、Api+ABT-737组。MTT法检测细胞存活率;Western blot法检测Bcl-2表达;比色法检测培养液LDH活性、细胞SOD及GSH-Px活性、MDA含量;流式细胞仪检测心肌细胞ROS含量、线粒体膜电位及细胞凋亡。结果 Api预处理25 h后,心肌细胞Bcl-2表达呈剂量依赖性上调(P<0.01);细胞存活率升高,培养液LDH活性降低,细胞SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量与ROS生成减少,线粒体膜电位更为稳定,细胞凋亡减少(P<0.01);Bcl-2抑制剂ABT-737则可取消Api的上述心肌保护作用。结论Api抗心肌A/R损伤作用涉及Bcl-2信号通路,至少部分依赖于其对Bcl-2表达水平的上调。     

新型褪黑素受体激动剂Neu-P11激活AMPK减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的研究新型褪黑素受体激动剂Neu-P11对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及分子机制。方法实验分为对照组、缺氧/复氧模型组(H/R组)、H/R+Neu-P11组、H/R+Compound C组、H/R+Neu-P11+Compound C组。构建H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型,检测各组心肌细胞凋亡情况,细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、SOD活性及MDA含量及心肌细胞AMPK的活性。结果与缺氧/复氧组细胞相比,Neu-P11预处理组细胞凋亡率明显减少,CK、LDH、MDA含量明显下降,SOD活性增加,心肌细胞AMPK活性明显增高,而AMPK特异性抑制剂Compound C可以阻断Neu-P11的保护作用。结论 Neu-P11能够减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,这一保护作用与激活AMPK有关。     

二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达的影响

目的研究二甲双胍(metformin,Met)对高糖培养下的H9c2细胞缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)表达的影响及其机制。方法高糖培养的大鼠H9c2心肌细胞分别加入3和5μmol·L-1的两种不同浓度的二甲双胍继续培养24 h。MTT实验检测H9c2细胞活力;LDH释放实验检测细胞毒力;细胞免疫荧光实验检测Cx43的表达和分布;荧光法检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western blot检测Cx43、pAMPK、AMPK和GAPDH的表达。结果 Met能增加H9c2细胞活力,降低细胞内ROS水平,对LDH释放差异无显著性;Met使AMPK磷酸化水平明显升高,增加心肌Cx43表达,改善Cx43的分布。结论 Met可能通过激活AMPK途径,增加心肌细胞Cx43的表达和减少细胞内ROS的产生,进而发挥心血管的保护效应。     

白藜芦醇对抗线粒体电压依赖性阴离子通道介导心肌损伤作用的研究

目的从细胞水平探讨白藜芦醇抗心肌损伤保护作用机制,明确其与线粒体电压依赖性阴离子通道(VDAC)的关系。方法以pFLAG质粒为载体,构建VDAC1真核表达载体pFLAG-VDAC1。H9c2心肌细胞随机分为5组,Control组、缺氧/复氧(A/R)组、白藜芦醇组、pFLAG-VDAC1-白藜芦醇组和pFLAG-白藜芦醇组。Western blot法测定VDAC1的蛋白表达,MTT法检测细胞存活率,生化自动分析仪测定LDH、CPK活性,线粒体肿胀实验检测线粒体通透性转换孔道(mPTP)的开放。结果 A/R处理后,VDAC1表达上调,细胞存活率下降,LDH和CPK活性增高,mPTP开放;而白藜芦醇则能抑制VDAC1的上调,并降低mPTP开放程度,对抗A/R损伤;但VDAC1高表达的pFLAG-VDAC1-白藜芦醇组则可取消白藜芦醇的心肌保护作用。结论白藜芦醇抗A/R损伤作用与VDAC1密切相关,其可通过下调VDAC1从而防止mPTP的开放,保护心肌细胞。     

芪苈强心胶囊通过PI3K/AKT/GSK3β信号通路延缓氧化应激损伤心肌细胞线粒体途径凋亡

目的探讨芪苈强心胶囊对氧化应激损伤心肌细胞线粒体途径凋亡的作用及机制。方法动物实验:通过结扎SD大鼠左冠状动脉前降支建立心梗后慢性心力衰竭(慢性心衰)大鼠模型,按分组分别灌胃给予芪苈强心超微粉(QLQX)或生理盐水4周。彩超检测心功能,ELISA法及荧光法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)释放水平、活性氧(ROS)表达水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性,TUNEL检测心肌细胞凋亡率,Western印迹法测凋亡相关蛋白表达水平及信号通路相关因子p-AKT/AKT和p-GSK3β/GSK3β表达相对比。细胞实验:使用H9c2心肌细胞给予或不给予QLQX或PI3K抑制剂LY294002,然后暴露于H2O2中共孵育24 h,MTS检测H9c2细胞生存活性,检测LDH和ROS表达水平及SOD活性,QRT-PCR法检测血红素氧合酶(HO-1)和过氧化氢酶(CAT)mRNA表达水平。流式细胞术测H9c2细胞凋亡率,Western印迹法测凋亡相关蛋白及信号通路相关因子蛋白表达水平。同时评估线粒体分裂、线粒体通透性转运孔(m PTP)开放和线粒体膜电位(MMP)水平。结果动物实验结果显示,与假手术组相比,模型组大鼠血清LDH和ROS水平显著增加,SOD活性降低(P<0.01);心肌细胞凋亡率明显增加,促凋亡蛋白Bax、细胞色素c、凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)、活化胱天蛋白酶9、活化胱天蛋白酶3蛋白表达水平升高(P<0.01);Bcl-2蛋白表达水平、p-AKT/AKT及p-Gsk3β/Gsk3β蛋白表达相对比降低(P<0.01),心功能下降(P<0.01)。给予不同剂量QLQX后均不同程度降低心衰大鼠血清LDH释放水平和ROS表达水平,升高SOD活性(P<0.05);抑制心肌细胞凋亡率及促凋亡蛋白表达,升高Bcl-2蛋白表达、p-AKT/AKT和p-GSK3β/GSK3β相对比,提高心衰大鼠心功能(P<0.05)。细胞实验结果显示,与H2O2组相比,QLQX促进H2O2损伤H9c2心肌细胞24 h后细胞增殖,抑制LDH释放水平和ROS表达水平,升高SOD活性、HO-1及CAT mRNA表达水平(P<0.01);抑制H9c2细胞凋亡率,下调上述促凋亡蛋白表达水平,上调Bcl-2蛋白表达、p-AKT/AKT及p-Gsk3β/Gsk3β相对比(P<0.01)。同时,QLQX抑制H2O2损伤H9c2细胞线粒体分裂、mPTP开放及MMP下降(P<0.01)。然而,QLQX改善氧化应激诱导H9c2心肌细胞线粒体损伤及凋亡作用可被PI3K抑制剂LY294002阻断。结论 QLQX可能通过激活PI3K/AKT/Gsk3β通路延缓氧化应激损伤心肌细胞线粒体依赖性凋亡。     

脑源性神经营养因子可减轻 H9c2 心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的 探讨脑源性神经营养因子（BDNF）预处理对 H9c2 心肌细胞缺氧/复氧（H/R）损伤的影响及其作用机制。方法 体外培养 H9c2 心肌细胞并以缺氧 （95%N2+5%CO2） 培养 4 h 后复氧 （95%O2+5%CO2） 培养 12 h 建立 H/R 模型, 并分为 Control 组、 H/R 组、 不同浓度 （1、 10、 100 μg/L） BDNF 预处理后 H/R 组、 酪氨酸蛋白激酶受体 B （TrkB）inhibitor 组 （同时加入 100 μg/L BDNF 和 1∶1 000 的 TrkB inhibitor 预处理后 H/R 组）。利用 MTT 方法检测各组心肌细胞的细胞存活率; 并测定各组心肌细胞 H/R 损伤后乳酸脱氢酶（LDH）、 肌酸激酶（CK）、 丙二醛（MDA）、 超氧化物歧化酶（SOD）含量及活性; 流式细胞术测定各组心肌细胞的凋亡率; Western-blot 检测 TrkB、 Bcl-2、 Bax 蛋白表达。结果 与 Control 组相比, H/R 组细胞存活率明显下降, LDH、 CK 和 MDA 含量升高, SOD 活性降低, 细胞凋亡率升高, 抗凋亡 Bcl-2 蛋白表达下降, 促凋亡 Bax 蛋白表达升高（均 P < 0.05）。与 H/R 组相比, 不同浓度 BDNF 预处理H9c2 心肌细胞后 H/R, 各组细胞存活率均明显上升, CK、 LDH、 MDA 含量逐渐下降, SOD 活性升高, 细胞凋亡率下降, TrkB 和 Bcl-2 蛋白表达升高, 而 Bax 蛋白表达降低, 但 BDNF 的作用均受到 TrkB inhibitor 的抑制。结论 BDNF预处理能够提高 H9c2 心肌细胞 H/R 损伤的细胞存活率, 通过降低细胞凋亡率和提升细胞抗氧化能力而发挥保护作用, 并与 BDNF-TrkB 信号通路有关。     

内质网应激相关蛋白 1过表达对缺氧 /复氧诱导的 H9c2心肌细胞凋亡的影响

目的 研究内质网应激相关蛋白1(SERP1)过表达对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠胚胎H9c2心肌细胞凋亡的影响.方法 2018年1—12月将中国科学院上海细胞库大鼠H9c2心肌细胞系建立H/R损伤大鼠心肌细胞模型,采用pCMV6质粒为载体构建内质pCMV6-网应激相关蛋白1(pCMV6-SERP1)过表达重组质粒,分别设H9c2心肌细胞为正常对照组(NC组),H/R损伤(缺氧4 h/复氧4 h)H9c2心肌细胞为H/R组,H/R损伤H9c2心肌细胞转染pCMV6空质粒为H/R+pCMV6组,H/R损伤H9c2心肌细胞转染pCMV6-SERP1过表达重组质粒为H/R+pCMV6-SERP1组,采用噻唑蓝(MTT)法检测各种H9c2心肌细胞存活率,采用Annexin V-FITC/PI双染技术检测各组H9c2心肌细胞凋亡率,采用实时定量PCR(RT-qPCR)和免疫印迹法分别检测各组细胞SERP1蛋白及凋亡相关蛋白的表达水平.结果 与NC组[(1.06±0.21)、(0.41±0.07)]比较,H/R组、H/R+pCMV6组H9c2心肌细胞SERP1 mRNA[(0.47±0.09)、(0.48±0.08)]及蛋白表达水平[(0.25±0.04)、(0.26±0.05)]显著降低,H/R+pCMV6-SERP1组H9c2心肌细胞SERP1 mRNA(2.94±0.52)及蛋白表达水平(0.83±0.12)显著增加(P<0.05),与H/R组、H/R+pCMV6组比较,H/R+pCMV6-SERP1组H9c2心肌细胞中内质网应激相关蛋白1微小RNA(SERP1 mRNA)及蛋白水平显著升高(P<0.05).与NC组[(100.00±00.00)％、(4.45±0.62)％]比较,H/R组、H/R+pCMV6组、H/R+pCMV6-SERP1组H9c2心肌细胞存活率[(49.86±5.14)％、(48.75±5.23)％、(89.72±8.61)％]、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白水平显著降低(P<0.05),H9c2心肌细胞凋亡率[(35.84±4.13)％、(33.66±4.07)％、(10.96±1.74)％]、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与H/R组、H/R+pCMV6组比较,H/R+pCMV6-SERP1组H9c2心肌细胞中存活率、Bac-l蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05).结论 SERP1过表达可能通过上调Bacl-2蛋白,下调Bax、Caspase-3蛋白表达,对缺氧/复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡有一定保护作用.     

吗啡预处理对H9c2心肌细胞缺氧/复氧时microRNA表达的影响

目的探讨吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia reoxygenation,H/R)时microRNA(miRNA)表达的影响,为明确其机制提供参考。方法培养H9c2心肌细胞,随机分为3组(n=4):1正常对照组(CON):H9c2心肌细胞置于DMEM/F12细胞培养液常规培养;2缺氧/复氧组(H/R):对心肌细胞行缺氧5h/复氧1h处理;3吗啡预处理组(MPC+H/R):在H/R前,应用1μmol·L~(-1)吗啡预处理10 min。处理结束后,采用CCK-8法检测细胞增殖、化学比色法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、Annexin-V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、Western blot法检测细胞内Fas蛋白表达、荧光定量RT-PCR法检测细胞miRNA表达水平。结果与CON组比,H/R组细胞活力降低,LDH活性升高,细胞凋亡率增加,Fas蛋白水平升高(P<0.01);MPC可明显提高细胞活力,降低LDH活性,抑制细胞凋亡,降低Fas蛋白水平(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,与CON组相比,H/R组miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let-7e-5p表达明显下调,而MPC能明显地抑制H/R对这些miRNA表达的下调作用(P<0.01)。结论吗啡预处理减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤可能与调控miR-133a-5p、miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216和let7e-5p等miRNA表达有关。     

香青兰总黄酮通过VEGF-B/AMPK通路缓解氧化应激抗H9c2细胞缺血再灌注损伤

香青兰总黄酮(total flavonoids of Dracocephalum moldavica L., TFDM)是从维吾尔医药传统药材香青兰中提取分离出来的有效部位,香青兰具有补益心脑、活血化瘀等功效,长期广泛用于治疗心脑血管疾病。本研究旨在确定香青兰总黄酮对H9c2 (大鼠心肌细胞)细胞缺氧复氧(hypoxia/re-oxygenation, H/R)损伤的影响及其作用机制。采用缺氧缺糖9 h合并复氧复糖2 h建立H9c2细胞缺氧/复氧损伤模型,模拟心肌缺血再灌注心肌损伤,考察香青兰总黄酮对细胞活力、心肌细胞损伤标志物、氧化应激水平、活性氧自由基(reactive oxygen radical, ROS)含量的影响,并应用Western blot法检测血管内皮生长因子B (vascular endothelial growth factor B, VEGF-B)和磷酸腺苷激活蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]通路相关蛋白表达。结果显示,香青兰总黄酮显著提高H/R损伤后心肌细...     

氯离子参与心肌细胞缺氧复氧损伤机制的研究

目的研究氯离子参加心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤的机制。方法采用原代培养新生大鼠的心肌细胞A/R损伤模型,去除细胞外的氯离子(Cl--free),或分别给予Na+-K+-2Cl-共同转运体阻断剂bumetanide,Cl-/HCO3-离子交换系统抑制剂SITS和氯通道阻断剂9-AC,观察细胞存活率、MDA含量、LDH、SOD、GSH-Px酶活性变化及细胞内的钙含量、NF-κB活性变化。结果A/R组与对照组比,MDA含量、LDH活性、细胞内的钙含量、NF-κB活性升高,细胞存活率、SOD、GSH-Px活性降低;bumetanide及9-AC组与A/R组比,各项指标无统计学意义。Cl--free、SITS处理后较A/R组,MDA含量、LDH活性、细胞内的钙含量、NF-κB活性降低,而细胞存活率、SOD、GSH-Px明显升高。结论Cl-/HCO3-离子交换系统在心肌细胞A/R损伤中起了重要作用,Cl-参与心肌A/R损伤的机制与钙超载及NF-κB活性升高有关。     

柚皮苷预处理通过抑制内质网应激凋亡途径减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的研究柚皮苷(naringin,Nar)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中内质网应激凋亡途径的影响及其分子作用机制。方法体外培养H9c2心肌细胞,并随机分为5组:正常对照组(C)、缺氧/复氧组(H/R)、Nar低剂量组(L)、中剂量组(M)和高剂量组(H)。C组心肌细胞正常培养至实验结束,H/R组行缺氧4 h后复氧24 h,H/R+Nar低、中、高剂量组分别于缺氧前6 h给予10、20、40 mg·L~(-1)的Nar培养,再行缺氧4 h后复氧24 h。实验后,MTT法测定细胞存活率;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡;Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化转录因子4(ATF4)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)及其磷酸化水平(p-eIF2α)、双链RNA样内质网激酶(PERK)及其磷酸化水平(p-PERK)。结果与C组相比,H/R组明显降低H9c2心肌细胞存活率,诱导细胞凋亡,增加CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α和p-PERK/PERK表达(P<0.05);与H/R组比较,Nar 3个剂量组均能提高H9c2心肌细胞存活率,降低细胞凋亡,CHOP、ATF4、p-eIF2α/eIF2α和p-PERK/PERK表达下调,以Nar中、高剂量组效果最明显(P<0.05)。结论 Nar预处理可以减轻心肌细胞H/R损伤所致的心肌细胞凋亡,提示PERK-eIF2α-ATF4-CHOP途径参与Nar减轻内质网应激相关凋亡的作用。     

ERK介导的碘化N-正丁基氟哌啶醇非L-型钙通道依赖地保护缺氧复氧心肌细胞的研究

目的研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对大鼠心肌细胞无外钙(零钙液)缺氧/复氧(H/R)时环磷酸腺苷(c AMP)/蛋白激酶A(PKA)/细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路及细胞损伤的作用。方法建立新生大鼠心肌细胞零钙液H/R模型,于正常培养基、缺氧液和复氧液中加入F2(1×10-6 mol/L)。采用蛋白印迹法检测心肌细胞磷酸化ERK(p-ERK1/2)、总ERK1/2及PKA蛋白表达;酶联免疫吸附法(ELISA)测定心肌细胞c AMP的水平;比色法检测培养细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)的含量;Hoechst 33342染色法检测心肌细胞凋亡情况。结果零钙液H/R可激活心肌细胞ERK1/2,使心肌细胞培养液中LDH浓度升高,心肌细胞凋亡增加;F2和ERK1/2抑制剂U0126及PD98059可下调零钙液H/R所致p-ERK1/2蛋白高表达,抑制细胞LDH漏出,减少细胞凋亡;ERK1/2激动剂表皮生长因子(EGF)可拮抗F2对零钙液H/R心肌细胞p-ERK1/2高表达的抑制作用,进而拮抗F2的心肌保护作用。零钙液H/R对培养心肌细胞c AMP含量及PKA蛋白表达无影响,F2对零钙液H/R状态下心肌细胞c AMP含量及PKA蛋白表达无影响。结论 F2可通过非L-型钙通道依赖机制拮抗心肌细胞H/R损伤,这可能与其抑制非L型钙通道依赖的ERK1/2信号通路激活有关,但与c AMP/PKA信号通路无关。     

西格列汀通过调控自噬和凋亡减轻棕榈酸诱导的心肌细胞损伤

目的：观察西格列汀是否通过调节心肌细胞自噬来减轻棕榈酸诱导的H9c2心肌细胞凋亡。方法：棕榈酸和西格列汀处理H9c2细胞24 h后,CCK-8试剂盒检测细胞存活率;共聚焦和Western blotting检测自噬标志蛋白LC3的表达情况;TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况;Western blotting分析凋亡相关蛋白C-Casp3、C-PARP和Cyt C以及相关调控因子AMPK和mTOR等的表达。结果：棕榈酸抑制H9c2细胞活性,减少LC3的蛋白表达,增加TUNEL阳性的凋亡细胞比率,增加凋亡相关蛋白的表达,抑制AMPK的磷酸化;而西格列汀可抑制PA对H9c2的这些作用,促进LC3蛋白表达,减少凋亡蛋白表达和凋亡细胞比率,增加AMPK的磷酸化。结论：本研究显示西格列汀可能通过促进自噬和减轻细胞凋亡来对抗棕榈酸诱导的细胞损伤,且这种作用可能是通过AMPK信号通路介导的。     

吡那地尔、美托洛尔、谷氨酰胺、胰岛素单独及联合使用对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制

目的研究吡那地尔(pinacidil,Pin)、美托洛尔(metoprolol,Met)、谷氨酰胺(glutamine,Glu)、胰岛素(insulin,Ins)四药联用对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)所致H9c2心肌细胞损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法将培养的H9c2心肌细胞随机分为7组,即①正常对照(Con)组;②H/R组;③Pin组;④Met组;⑤Glu组;⑥Ins组;⑦四药联用(PMGI)组。测定各组H9c2心肌细胞的存活率;收集培养液测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;Western印迹法检测保护性蛋白热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)的表达情况。结果对于H/R损伤的H9c2心肌细胞,四药联用组与药物单用组或H/R组相比能明显提高细胞存活率,保护细胞膜,减少LDH渗漏;增加抗氧化能力,提高SOD含量;增加HSP70的表达。结论联合用药组与药物单用组相比保护作用增强。     

碘化N-正丁基氟哌啶醇通过抑制线粒体凋亡通路抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤

目的研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中线粒体凋亡通路的影响,并探讨其分子作用机制。方法建立H9c2心肌细胞H/R损伤模型,将H9c2心肌细胞随机分为5组:正常对照组(C组)、缺氧/复氧组(H/R组)、F_2低、中、高剂量组。流式细胞术分析测定细胞凋亡率;采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测细胞色素C(Cyto C)、Bcl-2、和Bax蛋白表达变化;比色法测定caspase-3的活性。结果与H/R组相比,F_2低、中、高剂量组可明显降低H9c2细胞缺氧/复氧损伤后细胞凋亡率;提高Bcl-2/Bax比值;抑制线粒体中Cyto C的释放;减少caspase-3的活性。结论 F_2能够降低H/R后H9c2心肌细胞凋亡率,其机制可能与抑制线粒体通路的细胞凋亡有关。     

PPARα/PGC-1α信号通路在磷酸肌酸钠对阿霉素所致H9c2心肌细胞损伤中的作用

目的探讨磷酸肌酸钠对阿霉素损伤H9c2心肌细胞的影响及对细胞PPARα/PGC-1α信号通路的影响。方法实验分为3组:即对照组、阿霉素组(ADM)和磷酸肌酸钠预处理组(ADM+CP)。在使用药物处理后,使用阿霉素建立心肌损伤模型。用DCFH-DA标记细胞用荧光显微镜观察细胞中绿色荧光的含量来分析细胞中ROS的含量;RTPCR检测H9c2心肌细胞PPARα、PGC-1α和P300mRNA的表达;Western blot检测H9c2心肌细胞内PPARα、PGC-1α和P300蛋白的表达;采用Gilson高效液相色谱系统测定H9c2心肌细胞腺嘌呤核苷酸的含量。结果阿霉素处理H9c2心肌细胞后,细胞内ROS含量升高(P0.05),当用磷酸肌酸钠预处理2 h后,可明显降低阿霉素引起的ROS含量升高(P0.05)。与对照组相比,阿霉素可降低H9C2心肌细胞内PPARα、PGC-1α和P300mRNA及蛋白的表达(P0.05)。当用磷酸肌酸钠预处理2 h后,可以增加阿霉素引起的PPARα、PGC-1α、P300mRNA及蛋白的表达(P0.05)。与对照组相比,阿霉素可降低H9c2心肌细胞内ATP、ADP和AMP的含量(P0.05),而磷酸肌酸钠组的ATP、ADP和AMP的含量与阿霉素组相比明显升高(P0.05),但与对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论在本试验条件下,一定剂量的磷酸肌酸钠可在一定程度上抑制阿霉素引起的心肌细胞的损伤,激活PPARα/PGC-1α信号通路,改善阿霉素引起腺苷酸含量减少。     

田蓟苷调控p53/NOX4信号通路抗缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤的机制

目的:探究田蓟苷(tilianin, Til)预处理对缺氧/复氧(H/R)诱导的H9c2心肌细胞的保护作用。方法:体外培养H9c2心肌细胞，将其分为正常(Normal)组、模型(H/R)组、田蓟苷(Til)组、p53激动剂(Nutlin-3a)组、田蓟苷+p53激动剂(Til+Nutlin-3a)组，缺氧12 h再复氧6 h,建立H/R模型。CCK-8法测H9c2细胞活力，化学荧光法测ROS水平，试剂盒测LDH、MDA、SOD水平，JC-1法测线粒体膜电位(ΔΨ_m),Annexin-FITC/PI和Fluo-3 AM分别结合流式细胞仪检测细胞凋亡率和Ca²⁺荧光强度，RT-PCR测定p53、NOX4、Bax、Bcl-2 mRNA表达，免疫蛋白印迹法检测p53、NOX4、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表达，免疫荧光法测定p53、NOX4蛋白表达。结果:相较于H/R组，Til组H9c2细胞活力增强(P<0.01),ROS、LDH、MDA水平下降(P<0.01),SOD水平上升(P<0.01),ΔΨ_m     

胞外信号调节激酶1/2通路在阿霉素引起的心肌细胞损伤中的作用

目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)通路在阿霉素(doxorubicin,DOX)引起的心肌细胞损伤中的作用。方法应用DOX处理H9c2心肌细胞建立细胞损伤的体外模型,在DOX处理前应用ERK 1/2抑制剂PD98059抑制ERK 1/2的活化;检测细胞存活率、ERK 1/2的活化、胞内活性氧(ROS)水平、线粒体膜电位(MMP)以及胱硫醚γ-裂解酶(CSE,为内源性硫化氢的合成酶)的表达。结果 5μmol·L-1DOX处理H9c2心肌细胞1～6 h,呈时间依赖性地促进ERK1/2的活化;5μmol·L-1DOX对心肌细胞具有明显的损伤作用,表现为细胞存活率下降、ROS水平升高、MMP丢失及CSE表达降低;在DOX处理H9c2心肌细胞前30min,应用ERK1/2抑制剂10μmol·L-1PD-98059预处理能明显拮抗DOX对心肌细胞的损伤作用,使ROS水平降低,细胞存活率MMP和CSE表达水平均升高。结论 ERK1/2通路参与DOX对H9c2心肌细胞的损伤作用。     

Pim-3对抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的研究

目的研究原癌基因Pim-3对心肌细胞急性缺氧/复氧(A/R)损伤的保护作用。方法采用原代培养新生大鼠的心肌细胞A/R损伤和缺氧预适应(APC)保护模型,将已经构建好的pEGFP-N2/Pim-3质粒导入原代培养的乳鼠心肌细胞中,实验结束后测定Pim-3mRNA及蛋白表达水平(RT-PCR、Western blot法)的改变,同时检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、四唑盐(MTT)比色试验测定细胞存活率、TUNEL法检测细胞凋亡。结果RT-PCR和Western blot结果显示,Pim-3在正常组几乎不表达,A/R组表达明显升高,缺氧预适应(APC)+A/R组表达则进一步升高;转染pEGFP-N2/Pim-3质粒后24h,荧光倒置显微镜显示转染效率达30%;在A/R损伤后,Pim-3基因转染组较未转染组的心肌细胞LDH值明显降低,细胞存活率则明显升高,心肌细胞的凋亡指数明显下降。结论在细胞水平,Pim-3参与心肌APC保护作用,导入外源性的Pim-3基因能对抗急性A/R损伤。     

Bcl-2/Bad/mPTP通路介导14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤

目的探讨Bcl-2/Bad/mPTP通路在14-3-3γ对抗脂多糖所致心肌损伤中的作用。方法构建pFLAG-14-3-3γ重组质粒,转染至原代乳鼠心肌细胞中,然后行LPS损伤处理。处理结束后,取培养液检测LDH活性,MTT比色法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,线粒体肿胀实验检测mPTP开放,Western blot检测14-3-3γ、Bad、phospho-Bad以及线粒体Bcl-2蛋白表达。结果 LPS损伤使心肌细胞LDH活性升高、细胞存活率下降、凋亡细胞增加、mPTP开放加剧,转染pFLAG-14-3-3γ重组质粒后再行LPS损伤,则LDH活性下降、细胞存活率升高、mPTP开放与细胞凋亡减少,同时phospho-Bad蛋白表达增加,线粒体Bcl-2蛋白表达增加。结论 pFLAG-14-3-3γ能够对抗脂多糖所致的心肌细胞损伤,其机制可能与磷酸化Bad,释放Bcl-2至线粒体,抑制mPTP的开放有关。