含人IL—12基因的重组质闰p2Bac—hIL—12p35p40的构建

用ＰＣＲ技术克隆ｈＩＬ－１２ｐ３５和ｐ４０两个亚基的ｃＤＮＡ，经酶切反应和琼脂电泳，获得的ｐ３５和ｐ４０基因的大小分别为０．７７ｋｂ和１．１ｋｂ，ＳＫ质粒酶切后和ｐ３５，ｐ４０片段分别进行连接，形成ＳＫ＾＋－ｐ３５和ＳＫ＾＋－ｐ４０重组质粒，再经酶切反应，ｐ３５，ｐ４０片段先后连接至ｐ２Ｂａｃ质粒中，形成同时含有ｈＩＬ－１２两个亚基因的重组质粒ｐ２Ｂａｃ－ｈＩＬ－１２ｐ３５ｐ４０，ＳＫ＾＋－ｐ３５     

人端粒重复序列结合因子1^33—277在大肠杆菌中的？…

目的：建立能高效表达人端粒重复序列结合因子１第＾３３－２７７位（ＴＲＦ１＾３３－２７７）氨基酸的菌株并制备多抗。方法：设计一对引物,分别带有Ｋｐｎ Ｉ和ＥｃｏＲＩ位点,从已经克隆了ＴＲＦ１ｃＤＮＡ全长的重组质粒ｐＣＲⅡ－ＴＯＰＯ－ＴＲＦ１扩增ＴＲＦ１＾３３－２７７ｃＤＮＡ片段,克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ质粒,测序和酶切图谱鉴定,ＥｃｏＲＩ酶切后亚克隆入ｐＧＥＸ－３Ｘ的ＥｃｏＲＩ位点之间,筛选在向插入重组子     

含抑癌基因p16转移载体的构建

目的：为获得高表达有活性的ｐ１６蛋白,构建含ｐ１６ｃＤＮＡ的重组转移载体。方法：ＥｃｏＲＩｘｈｏＩ双酶切克隆质粒ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ－ｐ１６,低融点琼脂糖回收０．８ｋｂ的Ｐ１６ＣＤＮＡ片段,插入质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３,构建含Ｐ１６的重组载体ＰＸ３－Ｐ１６,并对重组子以菌落原位杂交和酶切电泳两种方法进行鉴定。结果：电泳证实低融点琼脂糖回收的片段为０．８ｋｂ。菌落原位杂交筛选８个阳性克隆,酶切电     

质粒P^JSB15DNA的提取及鉴定研究

质粒Ｐ＾ＪＳＢ１５ＤＮＡ含有ＩＬ－２ＲαｃＤＮＡ６７３ｂｐ片段，本研究从３０００ｍｌ菌液中提取出７．９２ｍｇｇ质粒Ｐ＾ＪＳＢ１５，收获率为２．６４ｍｇ／Ｌ。同时对其纯度，浓度，分子量及酶切图谱进行了鉴定和分析。     

质粒DNA的提纯与鉴定

质粒ＤＮＡ的提纯与鉴定生物化学教研室王以薇，徐桦关键词质粒，载体ＤＮＡ，限制性内切酶中图号Ｒ５０３基因重组是当代生物工程技术中广为应用的一种新手段。目前常用的载体之一是细菌质粒。细菌质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，结构为环状ＤＮＡ，大小相当于细...     

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。本实验首次将ＥＢＶ－ＤＮＡ酶全基因片段克隆到高效表达载体ｐＢＶ２２１上获得成功     

人白细胞介素—6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术座人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ｐＵＣ１８质粒中，经转化，筛选，酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体。     

人白细胞介素－6受体cDNA的克隆

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从人的外周血单个核细胞中扩增出人ＩＬ－６受体的特异性ｃＤＮＡ片段，经琼脂糖电泳证实扩增片段大约为１４００碱基对。运用ＤＮＡ重组技术，将获得的片段连接到ＰＵＣ１８质粒中，经转化、筛选、酶切鉴定构建出重组质粒ｐＵＣＩＬ－６受体；经序列分析证实为编码人ＩＬ－６受体的ｃＤＮＡ片段。     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ＰＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因，快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＥＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＥＣ物理图谱上３．２ｋｂ至４．８ｋｂ区间内，其分隔量约１．６ｋｂ。     

构建人CD23及其反义RNA的逆转录病毒表达重组体

利用ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因克隆ｐＵＣＤ９７６，分别以限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ酶切该重组质粒ＤＮＡ，回收１．０ｋｂ的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因、ＨｉｎｄⅢ酶切后回收３’端６０７ｂｐ的结合区段基因以及ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅡ酶切回收５’端４０３ｂｐ的调控区段基因。将各回收片段先以Ｋｌｅｎｏｗ酶补平后，插入已补平的ｐＺＩＰ逆转录病毒载体ＢａｍＨⅠ单切点，利用地高辛素标记的ＣＤ２３ｃＤＮＡ全基因探针，以斑点核酸杂交筛选逆转录病毒重组体，结合用限制性内切酶ＢａｍＨＩ和／或ＢｇｌⅡ酶切鉴定插入方向，最终获得正、反向插入的ＣＤ２３全基因－逆转录病毒重组体各２个，反向插入３’端和５’端部分基因片段的重组体分别为４个和１个。为进行ＣＤ２３反义ＲＮＡ的研究和真核表达ＣＤ２３提供了可靠的物质基础。     

HIV-1SF_2env重组克隆近PL启动子序列的测定

①目的确定ＨＩＶ－１ＳＦ２ｅｎｖ重组克隆的近启动子ＤＮＡ序列及其读码框架。②方法使用ＡＢＩ公司的３７３Ａ自动测序仪，对插入有ＨＩＶ－１ＳＦ２株ｅｎｖ基因的原核表达质粒ｐＳＦ２ｅｎｖ近启动子ＤＮＡ序列进行了序列测定。③结果该质粒的近启动子ＤＮＡ序列读码框架正确，重组表达质粒ｐＳＦ２ｅｎｖ构建成功。④结论使用限制性内切酶可以进行重组克隆的定向插入。     

一种简单有效的平端PCR产物克隆方法

介绍一种使用ｐＵＣ质粒做为载体进行平端ＰＣＲ产物连接的方法。首先将特异的ＰＣＲ扩增产物纯化，不经任何处理，与用ＳｍａⅠ内切酶消化的载体ｐＵＣ质粒进行连接，并在连接体系中加入ＳｍａⅠ内切酶，２３℃连接１８～２０小时。转化宿主菌后，挑选白色菌落进行重组鉴定。在ＰＣＲ产物＜５００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化菌白色菌落的７０％，而＞１０００ｂｐ的ＤＮＡ片段重组阳性率占转化白色菌落的１０～２０％。     

携带内皮型一氧化氮合酶基因重组腺病毒载体的构建

目的：构建带有内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）基因的重组腺病毒载体。方法：将ｅＮＯＳ　ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＣＡ１４，得到重组质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ。采用磷酸钙ＤＮＡ沉淀法将质粒ｐＣＡ１４－ＣＭＶ－ｅＮＯＳ与腺病毒拯救质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞，通过同源重组，生成带有ｅＮＯＳ基因的复制缺陷型重组腺病毒载体（ＡｄＣＭＶｅＮＯＳ）。ｅＮＯＳｃＤＮＡ重组进入腺病毒Ｅ１区并受ＣＭＶ启动子控制。结果：经形态学、病毒ＤＮＡ酶切、ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ等方法的鉴定，证实了载体构建的正确性。结论：带有ｅＮＯＳ基因的重组腺病毒载体的成功构建，为心血管等疾病的基因治疗打下了基础。     

卵巢癌的p53基因治疗实验研究：人野生型p53基因真核细？…

本实验构建了人野生型Ｐ５３基因与真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的重组体,为进行卵巢癌基因治疗研究打下基础,方法：利用分子生物学基固然我隆技术从质粒ｐＧＥＸ＾－ｐ５３中用双酶切下目的片段,挤压法回收与ｐｃＤＮＡ３构成重组体。结果成功的构建了人野生型Ｐ５３基因真核细胞表达质粒。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

重组丙型肝炎病毒基因载体的构建与表达

应用基因重组技术。从载体ＣＤＺ２酶切获得１．７３ｋｂＤＮＡ片段（含１６ｄ９３ｂｐ的ＨＣＶ结构区ｃＤＮＡ，其特异性已为ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实）。将ＨＣＶｃＵＮＡ片段插入载体ｐｃＤＮＡ３，构建ＨＣＶ重组体。经在大肠杆菌中表达，筛选、酶切分析，获得重组ＨＣＶ（ＰｃＤＮＡ３－ＨＣＶ）。以重组质粒转染Ｈ９细胞（ＣＤ淋巴细胞系），用Ｇ４１８筛选出抗性细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ、ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ验证表明，ｐｃＤＮＡ３－ＨＣＶ能在Ｈ９细胞中进行复制、转录和表达。这为丙型肝炎发病机理的研究提供了一个有用模型。     

人乳头瘤病毒16型完整E6开放读码框的基因克隆和鉴定

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）基因组中扩增得到５５５ｂｐ的Ｅ６ＤＮＡ片段，并重组到载体ｐＧＥＭＥＸ＾ＴＭ－１中，构建克隆扩增质粒ｐ１６Ｅ６－Ｇ，将此重组质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，经菌落原位杂交鉴定和限制性酶切图谱分析，证实该产物为Ｅ６基因完整开放读码框（ＯＲＦ），从而为获得Ｅ６ＯＲＦ基因片段提供了一个高效、方便的新方法。     

人G—CSF重组表达系统稳定性的实验研究

将构建好的人Ｇ－ＣＳＦ表达工程菌，连续培养１４０代，其抗生素抗性无改变，重组质粒ＤＮＡ酶切鉴定及目的的蛋白表达率与原始菌基本一致。     

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ｐＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因。快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＦＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＦＣ物理图谱上３２ｋｂ至４８ｋｂ区间内，其分子量约１６ｋｂ。该基因包含有ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ、及ＰｖｕⅡ位点。     

PCR克隆EB病毒潜伏膜蛋白-1基因

目的：构建ＥＢ病毒潜伏膜蛋白－１重组表达质粒。方法：ＰＣＲ克隆技术,即用ＰＣＲ方法从Ｂ９５－８细胞中钓出ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因ＤＮＡ序列,然后定向克隆到真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１中,以此构建成ｐｃＤＮＡ３．１－ＬＭＰ重组质粒。结果：经酶切鉴定,确定已获得重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＬＭＰ１。结论：在真核表达质粒中已成功地克隆了ＥＢ病毒ＬＭＰ１基因。