先天性巨结肠RET基因转录水平的研究

目的 探讨ＲＥＴ基因的表达情况与先天性巨结肠发生的关系。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ技术对１２例先天性巨结肠的狭窄段,移行段及扩张段分别做ＲＥＴ基因的表达,并以Ｇ３ＰＤＨ作内参标,观察ＲＥＴ基因的表达情况。结果 发现ＲＥＴ基因的表达从扩张段→移行段→狭窄段是逐渐减低的。结论 提示ＲＥＴ基因与先天性巨结肠的发生有一定的关系。     

神经生长因子受体在先天性巨结肠表达的意义

目的 探讨神经生长因子受体（ＮＧＦＲ）在先天性巨结肠（ＨＤ）中的分布情况及其意义。方法 应用ＮＧＦＲ免疫组化方法对１０例３周￣２岁的ＨＤ患儿及８例对照组患儿结肠进行染色观察。结果 丰富的ＮＧＦＲ染色阳性神经纤维分布于正常结肠环肌层及粘膜下层,少量分布于纵肌层,ＮＧＦＲ染色阳性神经元分布于肌间神经丛及粘膜下神经丛;ＮＧＦＲ染色阳性神经纤维在ＨＤ无肌间神经节细胞肠段肌层及粘膜下层内明显减少或缺如,而肌     

先天性巨结肠患儿肠道内Smoothelin的表达

目的 本研究旨在探讨先天性巨结肠(Hirschsprung's disease,HD)肠壁中Smoothelin(SM)的变化和临床意义. 方法 自2007年1月至2013年1月,随机选取53例经病理证实先天性巨结肠患儿术中切除的肠段样本(狭窄段即无神经节细胞段、移行段和扩张段即有神经节细胞段).男33例,女20例,年龄3月龄~4岁(平均年龄1.3岁).取材分别为狭窄段、移行段和扩张段肠壁组织各1.0cm3大小,迅速用pH7.4的PBS液冲洗,不同浓度的蔗糖溶液中脱水,-80℃保存.同时留取相同部位的肠壁组织做组织HE染色病理学检查外,辅以PGP9.5、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及S-100免疫组织化学染色,证实符合HD诊断.采用RealTime-PCR和免疫蛋白印记法方法从RNA和蛋白水平对SM在HD患儿肠道组织内的表达进行检测,并分析其参与HD发病过程的可能机制. 结果 SM mRNA表达在先天性巨结肠病扩张段、移行段和狭窄段分别为(27.13±16.44)×10-3、(21.60±10.02)×10-3和(19.66±9.92)×10-3;蛋白表达分别为43.13±12.44、36.83±9.43、23.63±4.97.移行段和狭窄段SM mRNA和蛋白均低于扩张段(P<0.05).结论 SM可能参与HD的发病过程.     

血红素氧合酶-2基因表达与先天性巨结肠发病关系的初步探讨

目的：探讨血红素氧合酶－2（HO－2）基因表达水平与先天性巨结肠症（HD）发病机制的关系。方法：2001年8月－2002年1月收治的15例HD患儿（男12例，女3例），年龄21d-6岁（平均1．8岁），其中短段型3型，常见型9例，长段型3例，标本于术中发别取自狭窄段和正常近心端肠段，提取肠组织总RNA后利用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术进行HO－2mRNA表达的半定量分析。结果：发现HO－2 mRNA在正常近心肠段均有正常表达，狭窄段则表达缺失，结论：HD患儿狭窄肠段HO－2表达缺失，提示HO－2基因表达缺可能与HD的发病有关。     

先天性巨结肠GDNF基因转录水平的研究

先天性巨结肠症是胚胎期后肠神经元发育不良性疾病 ,活产婴儿的发病率为 1/ 5 0 0 0 [1] 。其主要病理特点是先天性远端结肠和 /或直肠壁内神经节细胞完全缺如 ,原因尚不清楚。胶质细胞源性神经营养因子 (ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是Ｌｉｎ等[2 ]于 1993年发现并成功克隆的一种新的神经营养因子。国外有资料表明ＧＤＮＦ蛋白与ＥＮＳ发育[3 5] 和ＨＤ发病[6,7] 有关。本研究在基因转录水平探讨ＧＤＮＦ与ＨＤ神经节细胞缺如的关系。材料和方法一、取材及组织制备收集 1998…     

用实时定量PCR和DGGE技术检测先天性巨结肠SIP1基因的表达与异质性

目的 建立简单、有效的SIP1基因在先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HD)中表达情况及异质性筛查技术,并获取其相应的散发性HD人群频率分布.方法 采用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 方法 检测180例HD及正常人外周血SIP1基因的mRNA 转录水平;采用PCR-DGGE(PCR degenerating gel gradient elactrophoresis, PCR-DGGE)法检测SIP1基因外显子1-rs11544569和外显子2-rs57148397的异质性.结果 SIP1基因在62.2%(112/180)的正常人和90.5%(163/180)的HD中阳性表达.HD患儿中SIP1基因在mRNA转录水平的表达均高于正常人外周血(P＜0.05). rs11544569和rs57148397两位点分别有104例和119例HD观察到异质性,其发生率为57.8%和66.1%.180例正常人中均未发现异常电泳条带.结论 检测SIP1 mRNA 含量可作为判断HD的良好参考指标.PCR-DGGE是一种简单、灵敏、高效的SIP1基因多态性及异质性检测技术,可应用于医学实践.     

先天性巨结肠与其同源病的RET基因突变的研究

目的 了解先天性巨结肠与巨结肠同源病RET基因突变及其突变的差异。方法 30例散发性先天性巨结肠，14例巨结肠同源病，10例正常对照。取外周血，提取DNA，聚合酶链反应(PCR)扩增RET基因第13外显子；单链构象多态(SSCP)分析外显子突变，并通过测序明确突变的位点和类型。结果 30例散发性先天性巨结肠RET基因13外显子检测5例存在基因突变，共发现三种突变类型：有3例在碱基18888位点，胸苷酸残基T被鸟苷酸残基G置换，导致亮氨酸的静默突变；有1例在碱基18919位点，腺苷酸残基A被鸟苷酸残基G置换，导致赖氨酸突变为谷氨酸，为错义突变；有1例在碱基18974位点，插入一个鸟苷酸残基G，导致框架移位突变。RET基因13外显子突变率为16.7％(5／30)。巨结肠同源病和正常对照组未见RET基因13外显子突变。结论 先天性巨结肠与RET基因突变有关，而巨结肠同源病未发现RET基因突变，提示这两种疾病具有分子遗传学差异。     

先天性巨结肠患儿肠道组织内DPF3、Smarcd3和MEF2的表达

目的 通过对DPF3、Smarcd3及MEF2基因在先天性巨结肠(HD)患儿肠道组织内的检测,验证DPF3、Smarcd3及MEF2基因在肠道组织内的表达情况,并探讨DPF3、Smarcd3及MEF2基因在HD发病过程中的可能作用.方法 随机选取28例重庆医科大学附属儿童医院HD患儿手术标本,并根据手术标本取材的位置分为:痉挛段组和吻合口组.利用RealTime-PCR、免疫蛋白印迹法及免疫组织化学染色法从RNA和蛋白水平对DPF3、Smarcd3及MEF2基因在HD患儿肠道组织内的表达进行检测,验证DPF3、Smarcd3及MEF2在肠道组织内的表达,并分析其参与HD发病过程的可能机制.其中,利用BIO-RAD对mRNA数据半定量分析;Genesnap系统及软件对蛋白数据进行分析;免疫组织化学法及光学显微镜数码摄片进行蛋白染色分析;GraphPad Prism5绘图,SPSS(version 17.0)进行数据统计.结果 DPF3 mRNA在患儿吻合口和痉挛段的表达为1.76±1.30和1.07±0.93;蛋白的表达分别为2.31±0.62和1.95±0.57.Smarcd3 mRNA在患儿吻合口和痉挛段的表达为0.68±0.62和0.38±0.42;蛋白的表达分别为0.85±0.43和0.61±0.34;MEF2 mRNA在患儿吻合口和痉挛段的表达为1.01±0.63和0.68±0.39;蛋白的表达分别为2.29±0.38和1.83±0.76.DPF3、Smarcd3及MEF2 mRNA及蛋白在患儿痉挛段的表达较吻合口均降低(P＜0.05),且趋势相一致.DPF3、Smarcd3及MEF2在吻合口神经节细胞处可见阳性的棕色颗粒状染色,而在痉挛段未见明显染色.结论 DPF3、Smarcd3及MEF2可能参与HD的发病过程.     

先天性巨结肠结肠组织钾离子通道的表达变化

目的 通过离子通道芯片及Western blot实验证实先天性巨结肠(Hirschsprungdisease,HD)病变肠段的钾离子通道表达与正常的结直肠存在差异.方法 2012年8月到2013年12月在哈尔滨医科大学附属第一医院手术治疗先天性巨结肠患儿30例,通过病史、直肠测压、钡剂灌肠造影、术中冰冻及术后病理等确诊为HD,术中结肠切除完成后,分别取正常及病变狭窄段肠组织,大小为1.0 cm×1.0 cm;标本置入液氮中冻存以待进一步实验.取其中6组标本,应用人类神经离子通道PCR芯片(neuronal ion channels PCR array)进行筛选表达具有差异性的钾离子通道;全部30例标本应用Western blot检测所筛选出钾离子通道的表达情况.结果采用Image-Pro Plus魔棒选取蛋白条带,利用IOD算法计算条带灰度.结果 我们将表达变化在2倍以上的基因认定为是差异表达基因,从而通过芯片筛选出表达具有差异性的钾离子通道1 5个,其中无神经节肠段表达增强1个,表达降低14个,共包括电压门控性的钾离子通道9个、大电导Ca2+激活的K+通道2个、小电导Ca2+激活的K+通道2个、内向整流性钾离子通道2个.利用Westernblot验证大电导Ca2+激活的K+通道的Maxi K通道及电压门控性钾离子通道的Kv11.1通道a亚基蛋白的表达.并经统计学分析,认定差异具有显著差异性.结论 先天性巨结肠结肠组织中确实存在表达下调的钾离子通道.     

先天性巨结肠的分子生物学研究

先天性巨结肠又称Ｈｉｒｓｃｈｓｐｒｕｎｇ’ｓｄｉｓｅａｓｅ(ＨＤ) ,其主要病因是患儿在胚胎期肠神经发育过程中 ,肠神经元发育出现停顿 ,肠壁肌间神经丛的神经节细胞缺失 ,以致受累肠段异常收缩 ,其近端结肠代偿性扩张与肥厚 ,形成巨结肠。临床上表现为完全性或不完全性肠梗阻症状。ＨＤ为多基因遗传病 ,致病原因不甚明了 ,随着生物分子克隆技术的发展 ,我们已能从分子基因水平进一步探讨ＨＤ的发病机理及治疗方法 ,为临床ＨＤ的诊断及治疗开辟新的途径。一、遗传学倾向ＨＤ在先天性畸形中发病率居第２位 ,据统计平均每５０００个成活新…     

先天性巨结肠神经生长因子及神经生长因子受体基因表达

目的探讨神经生长因子(nerve growth factor，NGF)及其神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)对先天性巨结肠(Hirschsprungs disease，HD)的调控作用。方法采用RT-P(永技术检测新鲜标本正常对照肠管、痉挛段、移行段和扩张段各22例NGF和NGFR mRNA的表达，分析并统计其与临床病理特点之间的关系。结果22例正常对照肠管21例NGF mRNA表达阳性(95．5％)，20例NGFR mRNA表达阳性(90．9％)；痉挛段5例NGF mRNA表达阳性(22．7%)，6例NGFR mRNA表达阳性(27．3％)；移行段9例NGF mRNA表达阳性(49．9％)，7例NGFR mRNA表达阳性(31．8％)；扩张段18例NGF mRNA表达阳性(81．8%)，19例NGFR mRNA表达阳性(86．4％)。NGF和NGFR mRNA正常肠管与扩张段肠管中表达高度一致；痉挛段和移行段均为NGF mRNA和NGFR mRNA低表达。结论NGF和NGFR与HD病理形态有相关性；HD的痉挛段和移行段肠管NGF及NGFR表达异常，提示NGF和NGFR基因可能与HD的发生有关。     

先天性巨结肠症原癌基因RET结构的PCR-SSCP分析

目的：明确中国散发先天性巨结肠症是否有原癌基因ＲＥＴ突变。方法：３０例中国散发先天性巨结肠症。提取基因组ＤＮＡ；聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＲＥＴ基因第６、１３、１５、１７外显子；单链构象多态（ＳＳＣＰ）分析上述外显子是否有突变。结果：６例长段型先天性巨结肠症，２例有ＲＥＴ基因突变；普通型及短段型未见ＲＥＴ基因突变。２例突变位点均是ＲＥＴ基因的第１３外显子。结论：中国散发先天性巨结肠症长段型有ＲＥＴ基因突变，提示原癌基因ＲＥＴ与先天性巨结肠症的发生有关     

免疫组织化学方法在先天性巨结肠诊断中的应用

目的观察不同抗体在先天性巨结肠(HD)手术切除标本中的表达情况,寻找一个特异性抗体帮助快速、正确诊断HD。方法选择5个抗体包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、S100、组织蛋白酶D(CathepsinD,CAD)、外周蛋白(Peripherin),蛋白基因产物(PGP9.5),利用免疫组织化学方法分别标记HD手术切除后标本的远端及近端根部。结果PGP9.5、NSE、Pe-ripherin在肠壁肌间、黏膜下神经丛及神经节细胞中均阳性表达,S100阳性表达黏膜下、肌间神经丛,对神经节细胞则阴性表达,CAD仅阳性表达神经节细胞而不表达神经丛。结论与其他抗体相比,CAD具有结果明显、易判断、快速等特点,是帮助诊断HD的一个特异性抗体。     

Hirschsprung's Disease: A Viral Etiology?

This study investigates the hypothesis that Hirschspiung's disease (HD), congenital rectal agangliosis, may be etiologically linked to antenatal cytomegalovirus (CMV) infection. Bowel specimens from 72 HD patients, 144 control I infants (Hirschsprung-like symptoms, normal histology), and 36 control 11 infants (deaths from nongastrointestinal causes) were analyzed for CMV genomes by polymerase chain reaction. Positive results were obtained in 6 HD patients (8.8%) and none of the controls. Our findings suggest that antenatal CMV infection, a potentially preventable condition, may be one of the etiological factors in HD.     

软骨源性视黄酸敏感蛋白基因在先天性马蹄内翻足中的表达

目的 探讨先天性马蹄内翻足肌肉组织中的软骨源性视黄酸敏感蛋白(cartilage-de-rived retinoic acid sensitive protein,CD-RAP)基因的表达是否存在异常.方法 留取25例先天性马蹄内翻足患儿行Mckay松解术时切除的足外展拇肌,5例正常对照组织标本来源于3例创伤、1例足月引产胎儿及1例尸检(均经本院的医学伦理委员会批准).采用半定量RT-PCR方法检测马蹄内翻足及正常外展拇肌中CD-RAP基因mRNA的表达情况.结果 半定量RT-PCR研究表明马蹄内翻足患儿足外展拇肌组织中CD-RAP基因与β-actin基因平均密度(ADV)比值为0.376±0.241,相应正常组织二者比值为0.067±0.033,两组间差异具有统计学意义(t=6.143,P<0.001).结论 先天性马蹄内翻足患儿足外展拇肌组织中CD-RAP基因表达水平明显高于正常对照组,表明先天性马蹄内翻足患儿足外展拇肌组织中的CD-RAP基因表达上调,CD-RAP基因或其调节基因可能与先天性马蹄内翻足的发生有关.     

嘌呤受体亚型P2Y2在先天性巨结肠中的表达及意义

目的 研究HD患儿各段肠管中ATP受体亚型P2Y2的表达情况.初步探讨P2Y2受体表达与HD发生的关系.方法 随机选取2000至2008年在我院行手术治疗的HD患儿结肠标本共30例,将HD患儿正常段肠管设为对照组,移行段及痉挛段肠管设为实验组,应用免疫组化及RT-PCR法观察ATP受体P2Y亚型P2Y2在各肠段的表达情况.结果HD患儿正常段肠管的神经节细胞中有大量P2Y2阳性细胞的表达,而在痉挛段肠管中没有P2Y2阳性细胞的表达,移行段组织中可见P2Y2阳性细胞的表达,但其数量明显少于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05).RT-PCR结果显示mRNA水平的表达与免疫组化一致.结论 HD患儿痉挛段肠管中ATP受体P2Y2的表达缺失,P2Y2的表达缺失可能与HD的发生有关.