犬类新的肠道病毒(续完)

三、犬细小病毒 3.兽疫流行学 a.宿主范围有关自然宿主范围和影响地方流行性和自然疫源性的因素的资料有限。犬是主要宿主,其它犬科包括鬣狼、丛林犬、郊狼和食蟹狐等也有发病。1979年还报导了由一种细小病毒引起的水貂严重性肠炎。水貂的分离物对犬具有致病性。浣熊也可能易感CPV。家猫对实验性CPV感染具有易感性,但患病不明显。尽管猫与CPV病犬频繁密切接触,但此种犬的病毒从未使猫发病。由于FPV和CPV之间有交互的抗原关系,因而关于野生动物对FPV的易感性的血清学调查均未得到确切结论。没有CPV感染人的迹象。抽检300多份与CPV感染患犬密切接触的人血清,均未发现这种病毒的抗体(HI)。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPV VP2基因进行扩增,将CPV VP2基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPV VP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPV VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPV VP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

犬类新的肠道病毒(续一)

三、犬细小病毒 (一)、引言在犬体内现已确认的细小病毒属有3种:(1)犬的微小病毒(MVC)(2)缺陷性犬腺病毒相关病毒(CAAV)和(3)最新发现的致病性细小病毒(CPV)。只有MVC和CAAV已正式分类(Bachmann等1979)。最早确认的犬微小病毒(MVC),是于1967年从正常犬的粪便中分离到的(Binn等1970),它不同于其它种类的细小病毒,也与CPV无亲缘关系。宿主范围十分狭窄,仅在一种细胞系(Walter Reed犬细胞系)中培养时不引起CPE。有较高比例的犬体内和犬球蛋白制剂中都可发现其特异性血凝素抑制(HI)抗体。对犬的致病性尚未解决,但应用免疫电镜在患轻度腹泻的成年犬粪便中可检出。也是幼犬非致死性一过性腹泻的病因。     

犬细小病毒的分离与鉴定

应用猫肾F-81系传代细胞,采用同步接毒的方法及无牛血清细胞培养法,从临床患出血性肠炎犬粪中分离到一株病毒。通过对第6代细胞培养病毒液进行电镜形态观察、病毒理化特性试验、核酸型测定、幼犬人工感染试验、血凝及血凝抑制试验,以及用标准抗CPV免疫血清进行病毒中和试验及免疫电镜观察等系统鉴定,证明该病毒株为犬细小病毒。在病毒的分离培养过程中,比较了细胞培养维持液中牛血清成份对病毒增殖的影响,发现含2％胎牛血清的细胞维持液对犬细小病毒的生长有抑制作用。采用无牛血清的细胞培养维持液,则有利于犬细小病毒的增殖。建议采用无牛血清细胞维持流培养犬细小病毒,以利提高犬细小病毒的产率。     

湖南省2003年急性弛缓性麻痹病例病毒学监测结果分析

目的 总结分析湖南省急性驰缓性麻痹(AFP)病例病毒学监测结果，为我省维持无脊髓灰质炎状态提供科学依据。方法 采集AFP病例双份粪便标本，接种L20B、RD两种细胞进行病毒分离；阳性毒株采用微量中和实验进行型别鉴定；脊灰(PV)阳性毒株送国家脊灰实验室进行型内鉴别。结果 湖南省2003年共报告AFP病例199例，采集粪便标本199例，病毒分离阳性45例。其中脊灰病毒21例，非脊灰肠道病毒(NPEV)24例。所有PV毒株经国家脊灰实验室鉴定，除一株为I型疫苗变异株外，其余均为疫苗相关株。     

犬细小病毒核酸诊断方法的建立和应用

目的建立犬细小病毒的核酸诊断方法（PCR方法）并应用于临床诊断。方法根据犬细小病毒VP2基因序列设计引物，以犬细小病毒标准株、犬传染性肝炎病毒和正常增殖细胞DNA为模板，犬细小病毒扩增出221bp的特异带，将PCR产物连接到pMD18-T Vecter，转化大肠杆菌JM109菌株。重组质粒经测序并经blast比较，与GenBank中已登录的犬细小病毒VP2基因序列进行比较。同时将建立的PCR方法应用于30份犬粪便和病犬组织的检测，并测序。结果PCR产物测得的序列与GenBank的基因序列同源性为100％，粪便检测均无犬细小病毒的特异带，从病犬组织中有6份样品扩增出221bp的特异带，经测序比较，同源率为100％。结论建立了犬细小病毒的PCR检测方法，并能应用于临床诊断。     

2019年云南省文山州柯萨奇病毒A16型的基因特征

  目的  对云南省文山州2019年手足口病（hand，foot and mouth disease，hfmd）病原分离情况和14株柯萨奇病毒a16型（coxsackievirus a16，cv-a16）的基因特征进行分析。  方法  对文山州2019年hfmd实验室送到云南省疾病预防控制中心hfmd实验室的595份手足口病患者粪便标本进行病毒分离，并对分离到的74株肠道病毒（enterovirus，ev）vp1区基因进行扩增和测序定型，对cv-a16病毒进行基因特征和分子流行病学分析。  结果  共从595份标本中分离到74株ev，ev分离率为12.44%（74/595），其中a组病毒（enterovirus species a，ev-a）72株，占97.30%（72/74），ev-b组病毒2株，占2.70%（2/74），未分离到ev-c和ev-d组病毒。ev-a组病毒中，cv-a6病毒最多，共44株，占ev-a组分离数的61.11%（44/72），cv-a16次之，共14株，占ev-a组病毒的19.44%（14/72），ev-a10 9株，占12.50%（9/72）。基因进化分析表明，14株cv-a16均为b1基因亚型（subgenotype b1）。它们分为2个不同的进化分支（b1a和b1b），其中8株为b1a，6株为b1b。  结论  2019年文山州hfmd病原以cv-a6组为主，cv-a16次之。cv-a16病毒b1a和b1b两个分支同时在文山州流行。     

犬细小病毒抗体在该病毒感染的诊断与防治中的应用

作者采用犬细小病毒单克隆抗体(CPVMAb),用双抗夹心酶标免疫法测定了101例临床上疑似犬细小病毒病的犬粪便,共检出阳性犬87例,其中6月龄以下78例。将87例病犬分为对症治疗、对症加CPVMAb静脉滴注、对症加CPV高免血清静脉滴注3个治疗组,结果,3组治愈率分别为52.6％、95.5％和89.1％。在疫苗接种前1周,先肌注CPVMAb或CPV高免血清可提高预防效果。     

从一名亚急型克山病病人血液中分离到一株柯萨奇 B_4型病毒

1974年我们在克山病流行区采集了一部分患者、死亡病例以及非流行区健康儿童的血液、粪便、尸检、血清等标本共147份,进行了病毒学和血清学的检查。结果从19例病人粪便标本中分离出4株病毒,分别鉴定为柯萨奇病毒 A9、B4型、肠道孤儿(ECHO)病毒2型及一株未定型;从5份尸检脏器标本、2份心包液、3份心血、5份咽拭及17份白血球标本中均未     

医学病毒学诊断方法的发展现状与展望

医学病毒学诊断方法的发展标志着医学病毒学的进展水平,它与分子生物学方法的发展密切相关。目前,应用于病毒学领域中医学病毒学诊断的常规方法包括利用敏感细胞进行病毒的分离培养;运用诊断电镜技术和免疫电镜技术进行病毒的电镜检查;应用免疫荧光技术、免疫沉淀和免疫电泳技术、放射免疫技术检查病毒抗原;应用凝集试验技术、血溶试验技术、补体结合试验等血清学方法进行病毒检测等。随着分子生物学方法的不断发展以及它在医学病毒学诊断方法的应用,又开始以单克     

犬细小病毒弱毒株的分离及疫苗应用

目的 从犬四联弱毒样品中分离获得一株细小病毒（ＣＰＶ）弱毒株,用于投疫苗制备。方法 根据犬副流感的血球吸附特性,细胞培养特性以及异种病, 清阻断法分离病毒,该病毒简称为ＣＰＶ－ＸＮ１株,并对犬细小病毒疫苗的免疫性和动物安全性进行了研究。结果病毒分离后共血疚效坐（ＨＶ）值为１：１０２４～、：４０９６或１０＾７．６ＴＣＩＤ６０;在电镜下可见较典型的犬细小病毒形态结构特征,免疫电镜下见到抗体分子已被吸     

广西AFP病例脊髓灰质炎病毒核苷酸变异情况分析

目的及时发现可能出现的疫苗衍生脊灰病毒（VDPV）病例。方法按照WHO要求对广西2007～2009年急性弛缓性麻痹（AFP）病例的粪便标本进行病毒分离与鉴定,并进行核苷酸序列测定。结果从报告的846例AFP病例粪便标本中分离到27株脊髓灰质炎病毒株（PV）,其中I型7株I,I型7株I,II型6株,混合型7株,将混合株进行单型分离后,共得到34株,以II型PV为主,均为疫苗变异株;发病年龄在1岁以内占67.65%,男性发生变异多于女性。结论广西分离到的脊髓灰质炎病毒疫苗株有部分变异,局部地区发现高变异病毒,未发现循环病例。     

以CpG为佐剂的犬细小病毒基因疫苗的初步研究

目的研制犬细小病毒(CPV)基因疫苗。方法以CPV VP2基因为基因免疫的目的基因,以pcDNA3和pcDNAK质粒为基因免疫的载体,以非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)为核心的免疫刺激序列为免疫佐剂,构建重组质粒并免疫BALB/c小鼠和毕格犬。结果经pcDNA3-VP2C1(含1个拷贝CpG基序)基因免疫的BALB/c小鼠能产生抗CPV血凝抑制抗体;对于经CPV灭活苗初次免疫的毕格犬,用pcDNAK-VP2C2(含2个拷贝CpG基序)质粒免疫产生的再次免疫应答优于pcDNA3-VP2C1。结论VP2基因、pcDNAK和犬源CpG可用于CPV基因疫苗的进一步研究。     

抗传染性犬肝炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备传染性犬肝炎病毒单克隆抗体。方法将用纯化的犬腺病毒1型（CAV-1）免疫的BALB／c小鼠脾细胞与SP2／0细胞在聚乙二醇作用下融合，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫酶试验（1EA）筛选，以有限稀释法克隆3次，制备单克隆抗体，并对制备完成的单克隆抗体进行生物学鉴定。结果成功得到2株能稳定分泌抗CAV-1的单克隆抗体杂交瘤细胞，命名为1B、2H3，经鉴定其亚型分别为IgG2a和IgG2a，2株均为kappa链。腹水的ELISA效价可达10^7-10^8，IEA效价可达1：2560—1：5120。该单克隆抗体与CPV、CDV、FPV、CCV病毒无交叉反应。结论成功制备了抗CAV-1单克隆抗体，为进一步建立相关诊断方法奠定了基础。     

江西省流行性乙型脑炎病毒的鉴定

早在1940年,颜春辉氏在北京曾由死亡脑炎患者脑内分离出一株病毒,鉴定属于流行性乙型脑炎病毒(1)直至1949—1950年黄祯祥、王逸民二氏在同一地区,由死亡脑炎患者脑内分离出三株病毒(2),1951年鄱阳地区分离出10株(3),1952年汪美先等氏在西安分离出5株(4),经鉴定均属于流行性乙型脑炎病毒。以上各地的病毒学研究指出:近十余年来,我国各地所发生的脑炎绝大部分均为流行性乙型脑炎病     

深圳市登革1型病毒株全基因组特征及系统进化分析

目的对深圳市2014年登革病毒1型(DENV-1)流行株进行全基因序列测定,分析其分子病毒学特征,探讨其可能来源。方法采集2例登革热患者急性期血清标本,用BHK-21细胞培养分离病毒,RT-PCR进行病毒血清型别鉴定,并用RT-PCR进一步扩增全基因组序列,测序后进行同源性比较、系统进化树分析和遗传变异分析。结果 2例深圳DENV-1分离株进行全基因组测序结果显示同源性为100.0%,其基因组全长均为10 735 bp,编码3 329个氨基酸,与新加坡DENV-1流行株核苷酸和氨基酸同源性最高,分别为99.3%和99.7%。全基因组序列系统进化分析显示,深圳DENV-1株为基因Ⅰ型,与Fujian2004、Zhuhai2007和Singpore2008的亲缘关系较近,均在同一进化分支上。与广州DENV-1株GZ/80相比,深圳2014年DENV-1分离株发生了碱基变异430个,氨基酸变异42个,5’UTR存在1处点突变,3’UTR序列共有8处位点发生变异。结论 2014年深圳市DENV-1株可能来源于东南亚一带。病毒在进化过程中出现一些位点变异,这些变异的生物学意义有待进一步研究。     

犬瘟热病毒（CDV）ELISA检测方法的建立与应用

目的 建立犬CDV抗体ELISA检测方法.方法培养vero细胞,接种CDV病毒,制备vero正常抗原和CDV特异抗原,滴定酶结合物和抗原最佳工作浓度,并进行精密性、敏感性、稳定性、特异性实验.结果正常、特异抗原和酶结合物最佳工作浓度分别为1∶32 000、10 μg/mL和1∶8 000;正常、特异抗原批内变异系数分别为9.1%和5.8%,批间平均变异系数分别为8.8%和6.6%;检测灵敏度为1∶2 560;与犬细小病毒(CPV)、犬肝炎病毒(ICHV)均无交叉反应.稳定性试验相对偏差小于25%.结论建立的ELISA方法重复性、稳定性好,特异性、敏感性强.可用于犬CDV抗体的检测.     

中国寨卡病毒分离株E基因B细胞抗原表位多态性分析

目的研究中国寨卡病毒分离株的E基因多态性及其B细胞抗原表位的分布及变异情况。方法从NCBI中下载所有中国分离的寨卡病毒株、主要输入地委内瑞拉和萨摩亚的病毒株,从免疫表位数据库中检索获得寨卡病毒的B细胞抗原表位。使用MEGA7.0软件进行序列比对,分析中国寨卡分离株的基因变异情况及抗原表位的多态性。结果中国所有寨卡分离株均为亚洲型,E基因上有19个单核苷酸突变,其中3个异义突变,只有5个突变位点与来自委内瑞拉和萨摩亚的病毒株的突变位点相同。已验证的寨卡病毒B细胞抗原表位均存在于E蛋白上,尤其是DⅢ结构域。中国分离株和MR766株相比有3个B细胞表位发生改变,中国分离株自身产生的变异导致1个表位改变,B细胞表位的变异位点主要存在于DⅢ结构域。结论中国寨卡分离株总体变异率不高,与输入地病毒株相比也产生变异。有3个B细胞表位发生变异,DⅢ结构域是E蛋白上重要的抗原位点所在域且突变率高。     

犬副流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

目的分离并鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对该病毒N、HN和F基因进行序列分析,研究其遗传变异情况;为CPIV诊断、治疗以及预防奠定分子生物学基础。方法用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺组织,盲传3代,观察病变情况,收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性以及形态学观察。同时,用3对特异性引物,扩增N、HN和F全基因,进行序列测定和分析,并制作系统进化树。结果从犬肺中成功分离出一株犬副流感病毒,并命名为QF20100726。该病毒能凝集豚鼠、猪、鸡和人O型血,电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明,与人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比,N基因核苷酸同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性为97.4%~99.6%,其中有两处氨基酸发生新的变异,分别是第257位由V变成了A,第301位由A变成了T;HN基因核苷酸同源性为95.5~99.8%,氨基酸同源性为96.3~99.6%,F基因核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%。有两处发生特异变异,分别是56位由T变成了S,89位由T变成了M。结论成功分离犬副流感病毒QF20100726分离株,其血凝特性及超微形态特征均符合CPIV特性,N、HN和F全基因生物进化树显示,该分离株与犬副流感病毒分离株08-1990(登录号:KC237063)亲缘关系最近;N基因氨基酸在第257位(由V变成了A)和第301位(由A变成了T),F基因氨基酸在第56位(由T变成了S)和89位(由T变成了M)发生了特异性变异。这些数据将为CPIV的防控奠定基础。