小鼠胎肝间质干细胞的纯化与分化多能性研究

目的： 分离纯化小鼠胎肝间质干细胞（flMSCs）并探讨其分化潜能。方法： 通过改良贴壁法分离BABL/c小鼠胎肝间质干细胞；流式细胞术测定细胞周期和表型；体外诱导贴壁细胞向脂肪、软骨、骨组织以及神经细胞分化；化学染色、RT-PCR和免疫细胞化学染色鉴定分化。结果： 改进贴壁法分离的flMSCs呈均一梭形，(83.76±2.88)%处于G₀/G₁期,表达CD44、CD29,不表达造血细胞表面标志CD45、CD11b,诱导后能向脂肪、软骨、骨以及神经方向分化。结论： 贴壁法可以分离纯化小鼠flMSCs，小鼠flMSCs具有较强的分化潜能和“可塑性”，可用于干细胞治疗疾病的进一步研究。     

骨髓间质干细胞诱导为肌样细胞分化相关基因的表达

目的：研究骨髓间质干细胞向肌样细胞分化前后骨骼肌特异性基因的表达。方法:体外分离成年SD大鼠骨髓干细胞，培养增殖，用5-氮杂胞苷诱导分化，RT-PCR检测分化前和分化后1 d、2 d、5 d和7 d骨骼肌特异性转录因子生肌决定因子MyoD、肌细胞生成素myogenin、MRF4以及肌肉特异性肌酸磷酸激酶MCK的表达 。结果:MyoD在诱导前后均有表达，在诱导后1 d表达显著上调（P＜0.05）；myogenin、MRF4和MCK在诱导前无表达，诱导后2 d开始出现myogenin和MRF4的表达，诱导后7 d开始出现MCK的表达。结论：骨髓间质干细胞能表达一定水平的骨骼肌细胞的分化调控基因MyoD，它向肌样细胞的分化可能与MyoD、myogenin和MRF4有关。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组（MSC组）和生长因子共培养组（GF-MSC组）.MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基（IMDM）、2％胎牛血清（FBS）、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C（VitC）、50 μg/L成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、10 μg/L成骨蛋白2（BMP-2）、2μg/L胰岛素样生长因子1（IGF-1）、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）和结蛋白（Des）表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平（ng/L）高于MSC组（HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05）.结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.     

人骨髓间质干细胞向造血细胞分化潜能的实验研究

目的:在体研究人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)向造血细胞分化的潜能。方法:将hBMMSCs经尾静脉注射给环磷酰胺处理的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,利用流式激活细胞分析系统(FACS)检测hBMMSCs输注后存活35d的SCID小鼠外周血、骨髓和脾脏中人源性造血细胞的表型和水平。结果:hBMMSCs输注组外周血(PB)、骨髓(BM)和脾脏(spleen)中可检测到人CD45⁺/H-2D^d-、CD34⁺/H-2D^d-细胞,而对照组PB、BM和脾脏均未检测到上述表型的人造血细胞。结论:hBMMSCs具有向造血细胞分化的潜能。     

新生乳鼠视网膜细胞诱导骨髓间质干细胞向视网膜神经样细胞分化

目的：探讨体外培养的新生乳鼠视网膜细胞对骨髓间质干细胞的诱导分化作用。方法： 取成年Wistar大鼠股骨全骨髓细胞体外培养，经多次传代后获得高纯度的骨髓间质干细胞。以新生乳鼠视网膜细胞作诱导条件，采用分层共培养的方法诱导骨髓间质干细胞。倒置相差显微镜观察骨髓间质干细胞与新生乳鼠视网膜细胞共培养后形态的改变；免疫组织化学法检测诱导后的细胞巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微丝微管相关蛋白-2(Map-2)、Thy 1.1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)等特异性标记物的表达；RT-PCR进一步分析诱导后细胞表达nestin、NF、NSE、Thy 1.1及Ran等mRNA的情况。结果：新生乳鼠视网膜细胞作诱导剂，诱导48 h后可见部分细胞长出突起并向视网膜神经元特性样的细胞分化，最长可维持10 d。结论： 骨髓间质干细胞在体外培养的新生乳鼠视网膜细胞的诱导作用下可以向视网膜神经元样细胞分化。     

骨髓间质干细胞抑制肝星状细胞增殖与活化的体外研究

目的：探讨骨髓间质干细胞（MSCs）对活化态肝星状细胞（HSCs）增殖的影响。 方法： 分别从骨髓和肝脏分离纯化培养大鼠MSCs及HSCs，塑料板传代培养激活HSCs；在半透膜（transwell insert）上接种MSCs，在6孔塑料培养板上接种HSCs，建立上下双层细胞共培养体系；大鼠正常肝细胞系（BRLs）及HSCs培养分别作为对照。免疫细胞化学检测平滑肌激动蛋白（α-SMA）与结蛋白的表达，IBAS 2.5软件分析阳性染色表达量。 结果： HSCs与MSCs共培养24 h，HSCs表现轻度增殖抑制，随着培养时间延长，HSCs增殖活性受抑制更明显，在48 h和72 h的抑制率分别达15.7%与30.3%，与BRLs共培养体系比较有显著差异；与MSCs共培养72 h, HSCs表达α-SMA量明显低于两个对照组BRLs及HSCs培养体系（50.2% vs 90.2%、95.6%, P＜0.01）；而结蛋白表达的量在3组共培养体系中均无显著差异。 结论： MSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs增殖活性的潜能,在治疗肝纤维化中可能发挥作用。     

胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究

目的　探索体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的最佳条件 ,为研究其分化的调控机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法　将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养 ,以不同的羊膜铺布方式 ,分 4个实验组 :(1)羊膜上皮面向上铺布全孔底 ,(2 )羊膜基底面向上铺放全孔底 ,(3)羊膜上皮面向上铺布半孔底 ,(4)羊膜基底面向上铺布半孔底 ,以未加羊膜为对照组 ,倒置显微镜下观察细胞的生长和形态分化 ,用抗 β1整合素单克隆抗体免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果　培养 4～ 5d后 ,实验组 (3)中的ES细胞分化为表皮样干细胞 ,细胞呈多边形 ,体积增大 ,排列紧密 ,形成大面积细胞单层 ,而其他各实验组 ,ES细胞虽可分化为表皮样细胞 ,但呈集落生长 ,不形成细胞单层 ;对照组大量细胞死亡 ,形态各异。各实验组的细胞绝大多数呈现 β1整合素阳性 ,而对照组未见 β1整合素阳性细胞。结论　与羊膜共培养可诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞 ,羊膜上皮面向上铺布半孔底的效果最佳     

骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的潜能

背景：研究表明,在一定条件下骨髓间充质干细胞可诱导分化为肝样细胞,为治疗急性肝衰竭等终末期肝病提供了新的思路。 目的：对骨髓间充质干细胞的发现、分离培养、诱导分化及应用前景等方面做一综述。 方法：计算机检索中国期刊网全文数据库以及PubMed数据库1999至2014年期间有关骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的文章。检索词分别为“肝样细胞,骨髓间充质干细胞,细胞分化”和“hepatocyte-like cells,bone marrow mesenchymal stem cells,differentiation”。最后选择52篇文章纳入结果分析。 结果与结论：目前,肝组织工程的首要问题是寻找性状稳定具有肝特异性功能的种子细胞,成熟肝细胞获取难度较大,并具有产生免疫排斥反应、体外培养困难等缺陷,严重限制了肝移植的开展。骨髓间充质干细胞具有多向分化、自我更新快、易于扩增及培养等优点,被认为是最有前途的细胞来源。已有研究表明骨髓间充质干细胞在体内外均可分化为肝细胞,并具有肝细胞的合成和分泌功能。但如何大量扩增此类细胞的同时又能保持其良好的分化潜能、体外培养的最佳条件、诱导分化机制和临床应用的安全性等尚需进一步研究和探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

小儿骨髓间质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞

BACKGROUND:In the past, the culture and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in vitro were mostly reported in the adult or animal rather than in children. OBJECTIVE:To explore the ability of bone marrow mesenchymal stem cells from children differentiating into neural stem cells and nerve cells. METHODS:Bone marrow mesenchymal stem cells from children were isolated and cultured, and passage 12 cells were cultured in the pre-induction medium (DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and 1 mmol/L β-mercapto ethanol) and induction medium (DMEM containing 2% dimethyl sulfoxide and 150 μmol/L butylated hydroxyanisole). Expression of nestin and β-tublin III was detected using immunocytochemistry method at 30 minutes and 7 days after induction, while RT-PCR was used to detect nestin mRNA expression at 0, 5.5, 6 days after induction. RESULTS AND CONCLUSION: After combined induction, the cells shrank from round shape to tapered, polygonal or oval shape, and cell processes extended gradually and became filament-like shape. Interconnected cells formed a network at 6 days after combined induction. The expression of nestin antigen was positive at 30 minutes after induction, while the expression of β-tublin was positive at 7 days. RT-PCR findings showed that positive expression of nestin mRNA was detected at 5.5 hours of induction, and then disappeared at 6 days. These findings show that the combined use of dimethyl sulfoxide and butylated hydroxyanisole can induce bone marrow mesenchymal stem cells from children to differentiate into neural stem cells and nerve cells in vitro.     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向内皮细胞定向诱导分化的研究

目的：体外分离、扩增成人骨髓间质干细胞（MSCs）和向内皮细胞（ECs）定向诱导分化，开辟心血管组织工程种子细胞的新来源。 方法： 采用Percoll(1 073 g/L)从正常成人骨髓中分离出MSCs，纯化和扩增后流式细胞仪鉴定其纯度；用血管内皮生长因子(VEGF)诱导MSCs向ECs分化，Ⅷ因子(vWF)免疫组化和透射电镜(TEM)鉴定细胞性质。 结果： 5.0×105个MSCs在体外扩增15代后，获得8.0×1012个MSCs，扩增了约1.6×107倍；MSCs在加入VEGF诱导培养大约14-21 d，80%-90%的诱导细胞对Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；TEM可观察到胞浆内有Weible-palade小体，证实为ECs。 结论： 成人骨髓MSCs在体外具有定向诱导分化为ECs的潜能，这为心脏组织工程瓣体外构建, 尤其是在小儿先天性心脏病组织工程研究中种子细胞的来源提供了可能性。     

胎肝条件培养液体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为造血细胞的研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）体外造血分化潜能。方法： 选用孕12.5-14.5 d（12.5-14.5 dpc）的昆明小鼠，分别制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液（FLSC-CM）及胚胎成纤维细胞饲养层（FD），将体外扩增的CD34-CD45-hMSCs分别接种于含FLSC-CM、FD和IL-6及SCF组合的培养体系中，培养7 d后，通过形态学、表型、粒-单/巨噬细胞系集落培养（CFU-GM）对分化细胞进行鉴定。结果： hMSCs与FLSC-CM共培养组产生的非贴壁细胞明显增多，形态类似于单核或小淋巴细胞，部分细胞可表达人造血细胞特异性表面分子（CD34和CD45），在含人粒-单集落刺激因子（GM-CSF）的甲基纤维素培养体系中能够形成CFU-GM，而FD和IL-6+SCF诱导组无上述作用。结论： FLSC-CM可诱导CD34-CD45-hMSCs分化为造血细胞，提示hMSCs具有体外造血分化潜能。     

人胎盘来源的间充质干细胞向血管内皮细胞分化潜能的研究

目的: 探讨人胎盘来源的间充质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells,PDMSCs)在体外分化为血管内皮细胞的潜能。方法: 利用组织块种植法体外分离培养PDMSCs,流式细胞术鉴定其表面抗原,应用含50 μg/L VEGF和10 μg/L bFGF的诱导分化液定向诱导PDMSCs向内皮细胞分化。免疫细胞化学检测分化过程中不同时点内皮特异性标志的表达变化。透射电镜和体外血管生成实验分别检测内皮特异性结构和内皮细胞功能。结果: PDMSCs表面抗原 CD105和CD166阳性,CD31、CD34和CD45阴性。诱导分化的内皮细胞形态呈鹅卵石样,早期内皮标志Flk-1/KDR在4 d表达最强;成熟的内皮标志CD31、vWF、CD144/VE-cadherin在内皮细胞分化过程中呈现时间依赖性表达(0 d、4 d、8 d和12 d)。透射电镜下可见内皮特异性结构:Weibel-Palade小体。细胞接种在细胞外基质凝胶中可形成毛细血管样结构。结论: 胎盘中可分离出大量PDMSCs,并且PDMSCs在体外可分化为具有功能特性的内皮细胞,因此胎盘组织可能成为血管组织工程和再生医学的理想种子细胞来源。     

小鼠胎肝Sca-1+细胞分化为骨骼肌细胞

探讨小鼠胚胎肝组织中干细胞抗原-1阳性的细胞(Sca-1+细胞)向骨骼肌细胞分化的潜能.取14.5d的小鼠胎肝,制作细胞悬液;用单克隆免疫磁珠细胞分离技术分离Sca-1+细胞;用PCR鉴别Y染色体性别决定区域(SRY)基因序列;将2×103个雄性小鼠Sca-1+细胞输注给经致死剂量(10Gy)60钴全身照射的雌性小鼠体内;于移植后2个月,处死受体小鼠,取骨骼肌组织固定、制片;用免疫组织化学染色和荧光原位杂交检测雌性受体小鼠骨骼肌组织内供体小鼠胎肝Sca-1+细胞向骨骼肌细胞分化情况.结果在骨骼肌组织内发现存在Y染色体阳性的供体来源的细胞,同时呈现骨骼肌组织的部分特征,表型为Dystrophin+/Flt-1-/CD45-F4/80-.提示小鼠胎肝Sca-1+细胞(其中绝大部分是造血干细胞)具有向骨骼肌组织细胞分化的潜能.     

同一组织来源的肝癌干细胞分化能力异质性的体外研究

目的通过比较肝癌干细胞的不同单细胞克隆的体外分化能力,分析同一组织来源的肿瘤干细胞分化能力是否具有异质性,以进一步明确肿瘤干细胞的分化特性,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供实验依据。方法通过有限稀释法对肝癌干细胞进行单细胞克隆培养,获得的单细胞克隆通过MTT测定比较其增殖能力。然后分别挑选增殖速度较快和较慢的3个克隆,采用RT-PCR方法比较其干细胞标志物表达水平。对干细胞标志表达水平高的3个克隆(A2、A3和B2)进行向成骨、软骨和脂肪方向的诱导分化。采用实时荧光定量PCR方法检测诱导前后成骨、软骨和脂肪标志分子的表达。结果获得的20个单细胞克隆增殖能力不同,并且增殖能力快的克隆表达干细胞标志物CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin比增殖能力慢的克隆强。向成骨方向诱导后,A2、A3和B2克隆I型胶原mRNA表达水平分别升高了(4.71±0.11)、(2.13±0.15)和(3.82±0.3)倍;骨钙素mRNA的表达水平分别升高(8.55±0.18)、(7.02±0.03)和(7.91±0.09)倍,说明A2克隆向成骨细胞分化能力最强。向软骨方向诱导后,B2分化能力最强,软骨标志分子蛋白聚糖和II型胶原的表达分别上调(25.01±0.19)倍和(17.49±0.19)倍,而在A2未发生明显变化,A3只轻微上调。向脂肪方向诱导后,A2、A3和B2克隆脂联素mRNA表达水平分别升高了(6.12±0.15)、(11.45±0.36)和(12.41±1.03)倍,过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA的表达水平分别升高(4.92±0.02)、(9.54±0.18)和(8.96±0.11)倍。结论来源于同一组织的肝癌干细胞在分化能力上具有异质性,这可能是导致肿瘤组织异质性的原因之一,也提示靶向肿瘤干细胞的治疗需要联合用药。     

梗死心肌组织裂解液对鼠骨髓间充质干细胞诱导分化作用的体外研究

 目的 探讨梗死心肌组织裂解液对骨髓间充质干细胞（MSC）向心肌细胞分化的诱导作用。 方法 取 SD 大鼠梗死区心肌组织及其周围区域正常心肌组织分别制备梗死心肌组织裂解液和正常心肌组织裂解液；用 Balb/c 小鼠骨髓细胞进行 MSC 培养，取生长较好的第 2 代 MSC 制备 MSC 贴片，分别用 DMEM 培养基（空白对照组）、加入正常心肌组织裂解液的 DMEM 培养基（正常心肌组织裂解液组）和加入梗死心肌组织裂解液的 DMEM 培养基（梗死心肌组织裂解液组）培养。取各组培养 14 d 的 MSC，透射电镜下观察细胞超微结构；并进行免疫细胞化学染色，观察 α-肌动蛋白（actin）、心肌特异性转录因子 4（GATA-4）、心肌特异性肌球蛋白重链（MHC）、心肌特异性肌钙蛋白 T（cTnT）、心肌特异性肌钙蛋白 I（cTnI）、心肌增强因子 2（MEF-2）、连接蛋白（Cx）43 和 Cx45 的表达情况。 结果 超微结构观察显示空白对照组细胞器结构正常；正常心肌组织裂解液组细胞内未见明显的肌丝样结构；而梗死心肌组织裂解液组部分细胞内可见细小的肌丝样结构。免疫细胞化学染色分析显示，空白对照组 MSC 不表达心肌细胞特异性蛋白；正常心肌组织裂解液组 MSC 仅表达 α-actin；而梗死心肌组织裂解液组 MSC 表达 α-actin、GATA-4、MHC、cTnT、cTnI 和 MEF-2 等心肌特异性标志蛋白，但不表达 Cx43 和 Cx45。 结论 梗死心肌组织裂解液可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。     

β-巯基乙醇与全反式维甲酸对小鼠胎肝间充质细胞神经胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的:探讨β-ME与RA对体外胎肝间充质细胞神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法:无菌条件下获取胎龄14.5d的胎肝细胞,DMEM/HEPES/F12(20％FCS)培养弃去非黏附细胞,得到间充质细胞并传代,第5代细胞经β-巯基乙醇(β-ME)与全反式维甲酸(RA)程序化诱导处理后5h、5d用免疫细胞化学鉴定GFAP抗原表达,同时以β肌动蛋白基因为内对照,用半定量RT-PCR检则GFAPmRNA表达情况。结果:胎肝间充质细胞经β-ME,RA诱导处理后大多数细胞呈现神经细胞样的形态。免疫细胞化学显示处理后的细胞约85％表达GFAP;半定量RT-PCR结果显示处理后的细胞GFAP基因mRNA水平表达增加(P＜0.01)。结论:胎肝间充质细胞在体外培养条件下,经过β-ME与RA程序化处理,GFAP表达阳性。     

脐带血造血前体细胞在间质干细胞微环境中的增殖和分化特性研究

目的： 用间质干细胞（MSC）体外模拟造血微环境，探讨脐带血造血前体细胞在MSC微环境中的增殖和分化特性。方法： 实验组（CK+MSC组）以MSC为基质层细胞，建立基于MSC的体外造血细胞扩增体系，接种脐带血单个核细胞，培养体系中加入外源性造血生长因子SCF、Flt3L、TPO和IL-6，培养第1、2、3、4周对扩增的细胞进行细胞计数、集落培养，对照组为单纯细胞因子组（CK组，无MSC基质层细胞）和单纯MSC组（无脐带血单个核细胞）。结果： (1)第4周时CK+MSC组的细胞数扩增108倍，而CK组只有7.8倍。(2)CK+MSC组和CK组扩增的集落形成细胞（CFC）数量在第3周时达高峰，第4周时CFC数量已迅速下降。(3)红系CFC和高增殖潜能集落形成细胞（HPP-CFC）均于扩增1周后到达高峰，CK+MSC组的扩增效率要优于CK组，到第3周时两组均降为零。(4)粒单系CFC则在扩增第3周时到达高峰，CK+MSC组扩增效率优于CK组，从第4周开始出现回落。(5)扩增1周后，单位细胞（10⁴个MNC）中的CFC数到达高峰，CK+MSC组优于CK组，从第2周开始每104个MNC中的CFC数迅速呈下降趋势，到第4周时已降至低于扩增前水平。(6)单纯MSC组无造血细胞生长。结论： (1)体外扩增脐带血造血前体细胞时，基于MSC的扩增体系要优于单纯细胞因子体系。(2)MSC在体外有利于脐带血造血前体细胞扩增的同时，并不能阻止其分化。(3)红系扩增出现在体外扩增的早期，粒单系扩增持续的时间比红系长，扩增的CFC数量更多。