c—myc基因特异核酶的设计及其对靶mRNA的切割

目的：针对ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列设计核酶，探讨生理温度下核酶的切割活性，方法：计算机模拟分析ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分二级结构，选择核酶切位点，设计核酶，分别构建ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列和核酶体外转录载体并经双脱氧末端终止法测定核酶序列正确无误，体外转录核酶和靶ＲＮＡ分子，生理温度下测定核酶切割活性，结果：所设计的核酶可有效地切割靶ｍＲＮＡ分子。结论：所设计的核酶在生理温度下具     

c-myc基因mRNA核酶真核表达载体的构建和鉴定

0　引言　冠状动脉腔内球囊成形术 (PTCA)被公认为是治疗冠心病最有效的非手术方法 ,然而 PTCA术后 6 mo球囊扩张动脉段再狭窄的发生率达 30 %以上 ,其中血管平滑肌细胞的增殖、向内膜下迁移是再狭窄的主要病理改变之一 [1 ] .研究表明 ,c- myc基因属于速发 -早期基因 ,编码产物为核内DNA结合蛋白 ,在核内的信息传递过程中起重要作用 ,可促进与细胞增殖有关的基因开放 ,产生细胞增殖效应 ,是血管平滑肌细胞增殖、迁移的触发和调控因素 ,在再狭窄的发生过程中起重要作用 [2 ,3] .我们在计算机辅助下设计了特异性切割c- myc基因 m RNA的…     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构,选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因,以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体,以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后,通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体;核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导,转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs,经G418筛选出细胞克隆,流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体,DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确;经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆,扩大培养获得转染细胞;细胞周期分析显示,pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化,S期和G2/M期比率明显减少,细胞生长阻滞于G0/G1期,细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

特异性切割大鼠c—myc癌基因mRNA核酶的设计

核酸(ribozyme)为具有催化活性的RNA分子,能序列特异性地切割靶RNA.与传统的蛋白质酶所不同的是,核酶通过两侧的引导序列与底物以碱基互补形成杂交链,具有更高的底物特异性;核酶切割完靶RNA后即从杂交链上解离下来,可对新的靶RNA进行切割.因此,核酸成为近年来基因治疗的一种新方法.锤头状核酶具有分子小、设计简单、易于合成的特点,人们对核酸在基因治疗中作用的研究大部分是采用锤头状核酸.我们以Forster等总结的由13个保守碱基和3个螺旋区组成的锤头状核酸为模型,选择大鼠c-myc癌基因mRNA为靶RNA,在计算机辅助下设计了能特异性切割大鼠c-myc癌基因mRNA的核酸.     

原癌基因K-ras mRNA的体外核酶定点切割

目的：确定人工设计的梅核Ｒｘ１９９对原癌基因Ｋ－ｒａｓ ｍＲＮＡ的体外切割活性，为Ｋ－ｒａｓ特异性核酶的体内应用提供依据。方法：利用ＤＮＡ重组技术构建Ｋ－ｒａｓ外显子１及核酶Ｒｚ１９９的体外转录质粒，以Ｔ７ＲＮＡ聚合酶进行转录获得核酶Ｒｚ１９９对其靶ＲＮＡ分子进行切割。结果：Ｋ－ｒａｓ体外转录体为２５４ｎｔ的ＲＮＡ分子，能被核酶Ｒｚ１９９切割成大小分别为９０，１６４ｎｔ的２个片段。结论：梅核Ｒａ１     

c-myc反义核苷酸对淋巴瘤细胞系CA46凋亡的作用

目的 研究c—myc反义核苷酸对体外培养的淋巴瘤细胞系CA46基因表达及诱导凋亡的作用。方法 c—myc反义核苷酸(ASPO)为人工合成的针对c—myc基因的一段外源性基因片段，以无义的寡核苷酸作为对照，导入CA46细胞后观察其基因表达及诱导凋亡的作用。流式细胞仪检测c—myc基因产物表达，荧光染色观察CA46细胞的凋亡形态，流式细胞仪定量检测凋亡百分率，TUNEL检测加用VP16后的CA46原位凋亡。结果 c—myc反义核苷酸(ASPO)作用CA46细胞后，RT—PCR示c—myc mRNA表达降低。荧光染色ASPO组细胞胞体缩小，胞膜完整，核质浓缩，出现黄绿色不规则或局部致密荧光，凋亡细胞约占23．3％，而SPO组及空白组未见明显凋亡细胞，细胞呈均匀绿色荧光。流式细胞仪检测仅用VP16 10mg／L 3d，ASPO作用2d后加VP16 10mg／L 1d及ASPO作用3d均出现凋亡峰，凋亡率分别为16％，72％及52％，而SPO组及空白但均未见凋亡峰。流式细胞仪检测CA46细胞c—myc蛋白为95．3％，经ASPO作用后降为23．7％，同时SPO组c—myc表达率为90．6％，TUNEL检测ASPO组凋亡细胞为25．5％，加用VP16后的CA46凋亡率为36．7％。结论 体外实验中CA46特异地被c—myc反义核酸抑制生长，细胞出现凋亡表现，c—myc mRNA癌基因表达降低。     

核酶及突变核酶在体外对HBV mRNA的切割作用

目的：探讨多位点核酶对乙型肝炎病毒（HBV）信使核糖核酸（mRNA)的切割作用，以及保守碱基突变后对切割活性的影响。方法：利用计算机辅助设计针对HBV C区基因的多位点核酶及保守碱基突变的双位点核酶，构建多位点核酶及双位点突变核酶的自剪切载体（pGEMRz123,pGEMmRz12)，观察核酶及突变核酶对RNA的切割作用。结果：构建后的多位点串联核酶及突变核酶的自剪切转录载体在体外转录后，其顺式核酶可发生自剪切，并可将目的的核酶释放出来。多位点核酶对HBV mRNA有明确的切割作用，而保守碱基突变后对HBV mRNA则无切割作用。结果 ：抗HBV多位点酶在体外可明确切割HBV靶RNA，突变后的核酶无切割活性，保守碱基为核酶保持活性所必需。     

锤头状核酶RCP对HBV的P基因体外转录物的作用

本文根据Ｈａｓｅｌｏｆｆ和Ｇｅｒｌａｃｈ发表的锤头状核酶结构，设计合成了针对ＨＢＶａｙｗ株Ｐ基因５＇－端２３６０位点（ＧＵＣ）的核酶ＲＣＰ，其作用底物为ＨＢＶａｙｗＰ基因的翻译起始区（２１４０－２４２２区段），运用基因克隆结合体外转录的方法，评价了ＲＣＰ的切割活性，结果表明，ＲＣＰ在体外成功地切割了长为３４０个核苷酸的靶ＲＮＡ分子，这一工作为多们进一步在细胞内评价ＲＣＰ抑制ＨＢＶ全基因组复制及其知     

紫外线照射对DNA修复基因RAD24转录的影响

目的：紫外损伤对ＤＮＡ修复基因ＲＡＤ２４转录的影响。方法：以酿酒酵母ＨＹ６８４为实验对象，用波长２５４ｎｍ紫外线分别在０、３７、５０和７０Ｊ／ｍ２等强度下照射不同时间，提取总ＲＮＡ，应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交方法检测ＲＡＤ２４基因转录水平的变化。结果：３７Ｊ／ｍ２及５０Ｊ／ｍ２分别照射２０～１２０ｍｉｎ明显提高ＲＡＤ２４基因转录水平。结论：低剂量紫外线照射可提高ＲＡＤ２４基因转录水平，该基因的表达具有损伤诱导性。     

核酶切割per基因所致的缓解吗啡成瘾作用研究

目的：探讨per基因与阿片类成瘾的相关性，进而寻找治疗阿片成瘾的基因戒毒疗法。方法：设计并合成特异性per锤头状核酶基因和per核酶靶mRNA组分基因，并分别重组人体外转录质粒，而后将经体外转录反应得到per核酶RNA和地高辛标记的per核酶靶mRNA组分。将转录产物混合，在不同条件下进行体外切割反应后，采用地高辛化学发光法检测per核酶的体外切割效率。小鼠脑室注射直接导入脂质体包裹的重组质粒pcDNA 3.1-per RZ DNA，按剂量递增法建立吗啡依赖动物模型，用纳洛酮催瘾，观察戒断反应的变化。结果：per核酶对per核酶靶mRNA组分的体外切割效率达到60％。重组质粒组小鼠的刻板跳跃、“湿狗”样抖动和打洞次数与空质粒组、生理盐水组相比明显减少，但并不抑制小鼠的体重下降。结论：per核酶具有体外定点切割per基因mRNA组分的活性。经小鼠吗啡成瘾模型检测，该重组质粒能成功转染活体小鼠脑细胞并在脑组织内稳定表达per核酶，发挥阻断per基因表达的作用，有效地减轻吗啡成瘾的戒断症状。     

Site-specific cleavage of oncogene Ki-ras mRNA by ribozyme in vitro

Rasisaprotooncogeneencodingguaninenucleotidebindingprotein,ras--p21islocatedinthe.innerplasmamembraneandtransductssignalfromreceptortyrosinekinasetoraff.Ras--pZIproteinparticipatesintheregulationofcellgrowthanddifferentiation[lj.Mutationofras,Ki--rasinparticular,playsanimportantroleincellmalignanttransforming.ThemutantrateofKi--rasinhumanpancreaticadenocarcinomaisashighas95%['].So,blockingrasexpressionshouldbeapotentialmethodforcancertherapy.RibozymeisasmallcatalyticRNAmolecule.Recently,it…     

膀胱移行细胞癌尿脱落细胞和血细胞中hTERT及c-myc的表达

目的 :探讨hTERT和c mycmRNA在膀胱移行细胞癌 (TCC)患者尿脱落细胞和外周血细胞的表达、临床意义及关系 .方法 :采用RT PCR法同时检测膀胱肿瘤细胞株 ,2 8例TCC患者和 15例正常对照尿脱落细胞和外周血的hTERT和c mycmRNA表达 .结果 :尿脱落细胞hTERT和c myc阳性表达率分别为 85 .7%和 71.4 % ,对照组为 13.3%和 2 6 .7% ;血细胞两指标的阳性表达率分别为 78.6 %和 5 7.1% ,对照组为 6 .7%和 33.3% ;肿瘤组与对照组比较具有显著性差异 (P <0 .0 1) ,两指标不同组间比较具有相关性 (P <0 .0 1) .结论 :hTERT和c mycmRNA在TCC中的表达具有相关性 ;二者可作为膀胱癌的良好诊断指标 ,hTERT较c myc特异和灵敏 ;尿脱落细胞较血细胞对TCC的诊断更准确和方便     

在小鼠着床前胚胎中c-myc的表达

目的: 观察小鼠着床前胚胎细胞中c-myc基因的表达, 了解其对早期胚胎发育可能影响的作用. 方法: 采用原位杂交及免疫组织化学ABC法,分别检测小鼠着床前胚胎细胞中c-myc mRNA及c-myc蛋白. 结果: 在小鼠2细胞、4细胞、6细胞、8细胞和囊胚期胚细胞中均检测到原癌基因c-myc转录产物的表达,c-myc mRNA分布于胚细胞的胞质和胞核. 免疫组织化学方法也发现,2细胞至囊胚期胚胎细胞的 c-myc蛋白均呈免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞核中, 胚胎透明带则呈阴性反应. 结论: 小鼠早期胚胎有c-myc基因表达,c-myc基因对小鼠着床前胚胎发育可能起重要调节作用.     

c-myc、hTERT在4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯诱导NB4细胞分化中的作用

目的 探讨c-myc、hTERT在4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)诱导NB4细胞分化中的作用.方法 NB4细胞按不同处理方式分为以下各组:以RPMI 1640培养基作空白对照,乙醇作溶剂对照,全反式维甲酸(ATRA,1 μmol/L)作阳性对照,ATPR(1 μmol/L)处理组.采用RT-PCR法和We...     

As2O3对NB4细胞PTTG和c-myc基因表达的影响

目的探讨As2O3对NB4细胞PTTG和c-myc基因表达的影响。方法用RT-PCR的方法检测As2O3对NB4细胞PTTG和c-myc的表达的影响。结果0.5、1.0、2.0μmo1/L的As2O3作用NB4细胞24、48h后PTTG基因的表达强度逐渐减弱;与未加As2O3的NB4细胞对照组比较P<0.05。c-myc基因的表达强度亦逐渐减弱,与未加As2O3干预的NB4对照组比较P<0.05。结论PTTG和c-myc在NB4细胞中也有高表达,提示PTTG和c-myc的高表达在急性早幼粒细胞白血病(APL)发病过程中可能起着重要作用,As2O3能有效地下调NB4细胞PTTG和c-myc的表达。     

c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的关联性分析

目的：探讨c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的关系。方法：采用 ⁶⁰Co（剂量率0.382 Gy•min^-1,总剂量7 Gy）分别照射C57BL/6J和BALB/c小鼠建立小鼠胸腺淋巴瘤模型,6个月后处死小鼠,取胸腺组织,用Promega DNA纯化试剂盒提取胸腺淋巴瘤细胞基因组DNA,以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对c-myc基因rs51048361（C/T）、k-ras基因rs30221756（A/G）和rs30161609（T/C）单核苷酸多态性进行检测。结果：⁶⁰Co照射引起2种小鼠的胸腺瘤发生率不同,对应的 rs51048361位点基因型分别为C/C和T/T,rs30221756位点基因型分别为A/A和G/G,rs30161609位点基因型分别为T/T和C/C。结论：辐射敏感性不同的C57BL/6J和BALB/c 小鼠 ⁶⁰Co照射后rs51048361、rs30221756和rs30161609　位点基因型不同,推测c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发胸腺淋巴瘤有关联。     

c-myc反义寡核苷酸联合5-Fu对胃癌的体外及裸鼠体内抗肿瘤作用

目的:探讨c-myc反义寡核苷酸(ASODN)联合5-Fu对胃癌MKN-45细胞株的体内、外抗肿瘤作用.方法:采用脂质体介导c-myc反义寡核苷酸转染人胃癌细胞系,用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价c-myc ASODN联合5-Fu对胃癌细胞增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期;RT-PCR及免疫组化方法检测c-myc基因表达变化;建立荷瘤小鼠模型,通过皮下瘤体内注射药物观察肿瘤体积和抑瘤率的变化.结果:c-myc反义寡核苷酸联合5-Fu可显著抑制细胞增殖,细胞凋亡率(23.4±1.9)%,较单用c-myc反义寡核苷酸(10.6±1.1)%和5-Fu(12.5±1.0)%的抑制作用更为显著(P＜0.01);RT-PCR及免疫组化显示ASODN和5-Fu均使c-myc mRNA和蛋白表达下降;体内实验显示c-myc反义寡核苷酸联合5-Fu可明显减少肿瘤体积,抑制肿瘤生长,抑瘤率达46.7%;较单一治疗组明显(P＜0.05).结论:c-myc基因反义寡核苷酸联合5-Fu能明显抑制胃癌MKN-45细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调c-myc蛋白水平;且可有效抑制人胃癌裸鼠皮下肿瘤的生长.