抗Sj14-3-3特异性IgY的制备及其诊断日本血吸虫病循环抗原的价值

目的制备抗重组日本血吸虫信号转导蛋白14-3-3(Sj14-3-3)的鸡卵黄免疫球蛋白(IgY),建立双抗体夹心ELISA诊断体系(IgY-ELISA),探讨用于日本血吸虫病的诊断价值。方法利用Sj14-3-3制备并纯化卵黄抗体IgY和兔多克隆IgG抗体;以IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体建立双抗体夹心ELISA诊断方法,检测72例急性血吸虫病患者、128例慢性血吸虫病患者、132例正常人、42例肺吸虫患者、60例华支睾吸虫患者和46例钩虫感染者血清。探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值。结果成功制备并鉴定了抗Sj14-3-3特异性IgY和IgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为73.6%和48.4%,正常人血清的阴性率为94.7%;与肺吸虫患者、华支睾吸虫患者、钩虫感染者血清的交叉反应分别为7.1%、6.7%、6.5%。结论建立了基于IgY的双抗体夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫病患者血清的检测具有较高的敏感性和特异性,可用于日本血吸虫病的辅助诊断。     

基于IgY的ELISA用于日本血吸虫病循环抗原的检测

目的 以鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)替代哺乳动物来源的IgG抗体,建立双抗体夹心ELISA用于日本血吸虫病的诊断.方法 制备并纯化抗日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)的卵黄抗体IgY和抗SEA的兔多克隆IgG抗体;以抗SEA的IgG为捕获抗体,IgY为检测抗体的双抗体夹心ELISA诊断方法,共检测血清443份,其中急性血吸虫病患者血清68例,慢性血吸虫病患者180例,正常人100例,肺吸虫感染者20例,华支睾吸虫感染者48例和钩虫感染者血清27例.探讨基于IgY的循环抗原检测的应用价值.结果 成功制备并鉴定了特异性IgY和lgG抗体,建立了双抗体夹心ELISA检测体系;检测急性血吸虫病患者和慢性血吸虫病患者血清的阳性率分别为79.4%和64.4%,最低灵敏度为9.3μg/L;正常人血清的阴性率为92%;与肺吸虫、华支睾吸虫、钩虫感染者血清的交叉反应分别为20%、20.8%、14.8%.结论 建立了基于lgY的双抗夹心ELISA检测体系,用于日本血吸虫SEA的检测具有一定特异性和较高的敏感性,可试用于日本血吸虫病的辅助诊断.     

用日本血吸虫成虫抗原ELISA检测血吸虫病抗体的现场应用

用日本血吸虫成虫抗原(AAg)和虫卵抗原(EAg)ELISA检测血吸虫病疫区粪检阳性病人134例,其阳性率分别为99.25％和98.51％。134例中45例儿童和89例成人用AAg检测,其阳性率分别为100％和98.88％,而用EAg检测的阳性率分别为97.78％和98.88％。AAg和EAg检测26例正常人均为阴性。结果表明:AAg与EAg的检出率以及儿童与成人的检出率均相似。     

日本血吸虫重组32kD抗原的纯化和诊断应用

用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结合电渗洗脱的方法分离、纯化日本血吸虫重组３２ｋＤ抗原（ｒＳｊ３２）；用酶联免疫印迹技术（ＥＩＴＢ）分析纯化抗原的免疫活性。用纯化抗原、日本血吸虫成虫抗原（ＡＷＡ）和可溶性虫卵抗原（ＳＥＡ）分别检测慢性血吸虫病人、肺吸虫病人、肝吸虫病人、钩虫病人和健康人血清抗体。结果表明：纯化的ｒＳｊ３２分子量为３７ｋＤ，有较好的免疫活性；用其检测日本血吸虫病的敏感性和特异性与虫源性抗原（ＡＷＡ和ＳＥＡ）无显著性差异。提示ｒＳｊ３２可代替ＡＷＡ和ＳＥＡ用于日本血吸虫病诊断     

日本血吸虫成虫抗原检测先天性感染仔兔血清抗体动态的研究

目的 观察仔兔血清抗体动态变化，探讨家兔日本血吸虫病先天性传播的免疫学规律。方法 5只怀孕晚期母兔分别人工感染500条日本血吸虫尾蚴／只，仔兔出生后43天起每2周采血收集血清，至仔兔发育成熟(约出生后113天)。分别运用日本血吸虫成虫抗原(AWA)和可溶性虫卵抗原(SEA)，ELISA法检测血清中特异性IgG、IgM抗体，观察动态变化。结果 仔兔先天性感染率为60％(12／20)，其中5只双性感染，7只单性感染。20只仔兔，抗AWA-IgG、抗AWA-IgM抗体检测始终呈阴性；抗SEA-IgG检测，5只双性感染仔兔有4只于出生后57天起陆续呈阳性，其余16只始终为阴性；20只仔兔抗SEA-IgM也始终呈阴性。结论 先天性感染日本血吸虫病的仔兔呈低免疫应答状态，可能存在免疫耐受。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值

目的 探讨纯化的日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白14—3—3(rSjl4—3—3)诊断血吸虫病的价值。方法 利用纯化的rSjl4—3—3抗原与成虫抗原，间接EUSA法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清。结果 急、慢性血吸虫患者血清rSjl4—3—3抗体检出率为100％和92．0％，与正常人血清未出现交叉反应；抗AWA抗体检出率为98．0％和94．0％，与正常人有7．3％的交叉反应。结论 rSjl4—3—3为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性，具有实用价值。     

应用日本血吸虫病患者血清特异性抗体亚类考核疗效

用纯化的日本血吸虫成虫３１／３２ＫＤ抗原建立的ＢＡ－ＥＬＩＳＡ系统检测慢性血吸虫病患者治疗前、后血清中的ＩｇＧ１，ＩｇＧ３和ＩｇＧ４抗体水平；同时用常规ＥＬＩＳＡ检测ＩｇＧ和ＩｇＭ特异抗体。结果表明：各类抗体均未见假阳性，亦未与肝吸虫病和肺吸虫病患者血清出现交叉阳性。提示ＩｇＧ１和ＩｇＧ４抗体的敏感性和特异性高，具有诊断和疗效考核的价值。     

血吸虫病循环抗原诊断研究进展

综述了血吸虫病循环抗原（CAg）的分类及循环抗原的诊断方法两方面的研究进展。     

旋毛虫肌蚴可溶性抗原与日本血吸虫病患者血清的交叉反应

应用ＥＬＩＢ技术观察旋毛虫肌蚴抗原（ＴｓＭＬＳＡ）与６种寄生虫病人血清的交叉反应。结果表明：ＴｓＭＬＳＡ中３１～１００ＫＤａ内的蛋白大部分可被急性血吸虫病人血清所识别，而慢性血吸虫病人血清仅识别其中的４４／４５，５１／５３，６２／６４及１００ＫＤａ蛋白；小于６０ＫＤａ者可与丝虫病、钩虫病、肺吸虫、蛔虫病和肝吸虫病人血清呈不同程度的交叉反应，以前三者为最明显；４５ＫＤａ蛋白可被部分正常人血清识别。提示，旋毛虫肌蚴抗原与多种寄生虫有共享成分，但与血吸虫的交叉可依据４组区带用以鉴别诊断此二种寄生虫病。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的免疫诊断价值评估

目的探讨重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3（rSj14-3-3）间接ELISA用于血吸虫病免疫诊断的价值。方法表达并利用纯化的rSj14-3-3建立间接ELISA法，比较其与可溶性虫卵抗原（SEA）ELISA和间接血凝试验（IHA）检测急慢性日本血吸虫病患者的阳性率及其它寄生虫患者和正常人血清的交叉反应。结果rSj14-3-3-ELISA、SEA-ELISA和IHA3种方法的敏感性分别为90．8％、94．2％和90．0％，特异性分别为87．0％，84．8％和84．8％，差异无显著性（P〉0．05）。结论rSj14-3-3抗原间接ELISA法具有可用于日本血吸虫病免疫诊断的价值。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶在虫卵阶段的定位

目的探讨谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)在虫卵阶段的表达、定位和重组蛋白(rSj26GST)的免疫诊断价值。方法从感染日本血吸虫尾蚴6周的兔肝脏中分离虫卵,分别用RT-PCR和免疫印迹(Western blotting)法检测Sj26GST基因在虫卵阶段的转录和翻译;同时用兔肝做免疫组化观察Sj26GST在虫卵内的分布。利用纯化的rSj26GST和日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA),采用间接ELISA法检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从血吸虫虫卵中扩增670bp的基因片断,Western blotting证明在虫卵阶段Sj26GST的表达;同时免疫组化显示Sj26GST主要分布在虫卵内毛蚴两边的侧腺。rSj26GST检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清的阳性率分别为92%、80%和0;用SEA检测以上标本,阳性率分别为96%、84%和2%。结论Sj26GST是SEA的主要组分之一,能刺激机体产生高滴度的抗体;rSj26GST为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性,具有实用价值。     

Hsp70-2及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

目的检测Heat shock protein 70-2(Hsp70-2)及14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)组织中的表达,探讨两者在肿瘤发展中的作用及临床意义。方法收集人膀胱尿路上皮癌标本48例,膀胱尿路上皮癌旁组织标本20例,利用免疫组织化学S-P法、Western blot和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Hsp70-2、14-3-3zeta在蛋白水平和mRNA水平的表达,分析两者与膀胱尿路上皮癌的病理分级、临床分期等因素间的关系。结果 3种检测方法均显示Hsp70-2、14-3-3zeta在癌旁组织中低表达,在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,其表达量随病理分级程度及浸润深度增高而增高,组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Hsp70-2与14-3-3zeta蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达均增高,两者呈正相关(r=0.516,P<0.05)。结论 Hsp70-2与14-3-3zeta在膀胱尿路上皮癌组织中高表达,与病理分级,临床分期呈正相关,且两者之间也呈正相关,提示两者在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。     

14-3-3/HIP-55复合体增强HIP-55蛋白稳定性

目的:用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术验证HIP-55与14-3-3在HEK293细胞中存在相互作用,并进一步研究其生物学意义. 方法:利用GATEWAY系统构建PDEST-N-Venus-HIP-55WT(野生型),PDEST-N-Venus-HIP-55AA(突变体S269A/T291A),PDEST-GST-HIP-55WT及PDEST-C-Venus-14-3-3τ重组质粒,利用双分子荧光互补及免疫共沉淀技术检测两者的相互作用,同时应用14-3-3蛋白相互作用抑制肽R18和HIP-55蛋白突变体( HIP-55AA突变体S269A/T291A不能与14-3-3相互作用)作为工具研究两者结合后对嘌呤霉素诱导的HIP-55蛋白表达的影响. 结果:外源转入的Venus-HIP-55WT、Venus-HIP-55AA及Venus-14-3-3蛋白能够在HEK293细胞中表达;双分子荧光互补实验结果表明HIP-55与14-3-3存在相互作用,HIP-55蛋白的S269/T291位点介导HIP-55与14-3-3的相互作用;免疫共沉淀技术表明内源性HIP-55与14-3-3存在相互作用;进一步研究发现HIP-55与14-3-3复合体增强HIP-55蛋白的稳定性,保护HIP-55不被降解. 结论:14-3-3与HIP-55存在相互作用,14-3-3/HIP-55复合体可以促进HIP-55蛋白的稳定性.     

KLH与SEA皮试法现场诊断日本血吸虫病效果的比较

应用KLH和SEA皮试法 (intraderminaltest,IDT)在血吸虫病疫区对加藤法粪检确诊的 32例阳性人群和31例阴性人群作平行检测。结果显示 :KLH 和SEA IDT二法与粪检阳性符合率分别为 90 %和 1 0 0 % ,差异无显著性(P >0 .0 5) ;KLH 和SEA IDT与粪检阴性符合率为 71 9%和 2 5 % ,差异有高度显著性 (P <0 .0 1 ) ;在 31例粪检阴性人群中 ,两IDT检出均为阳性者 9例 ,SEA IDT单一阳性者 1 5例 ,KLH IDT无 1例为单一阳性。在双皮试检出阳性者中经粪孵毛蚴法追踪 ,查出 2例阳性 ,而SEA IDT单阳者中无 1例阳性 ;2 7例治后 1年的人群中 ,KLH IDT检出 6例阳性 ,阴转率为 77 8% ,SEA IDT检出 2 1例阳性 ,阴转率为 2 2 2 %。提示 :KLH作为诊断抗原用于现场皮试不仅具有较高的敏感性而且有较好的考核疗效价值     

14-3-3β蛋白特性及与卡波肉瘤的关系

酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白(14-3-3蛋白)是高度保守的可溶性酸性蛋白家族,它们在细胞有丝分裂、生长、分化、增殖和凋亡等过程中起重要的调控作用。其中14-3-3β蛋白在卡波肉瘤组织中高表达,与其发生、发展相关。本文就14-3-3β蛋白的特性以及与卡波肉瘤的关系予以综述。     

重组弓形虫14-3-3抗原用于弓形虫血清抗体的检测

目的　探讨重组弓形虫信号转导蛋白14- 3- 3(Toxo14- 3- 3)在弓形虫病免疫诊断中的价值。方法　根据弓形虫Beverly株猫肠上皮细胞增殖阶段的14- 3 -3编码基因,设计合成引物,自RH株速殖子基因组克隆Toxo14- 3 -3的ORF,克隆pET 28a质粒,转化大肠杆菌,获得表达产物并纯化融合蛋白,以此抗原包被反应板进行ELISA检测,并与粗制抗原及市售试剂进行比较。结果　对400份血清标本的平行检测,Toxo14 -3 -3抗原、粗制抗原和市售试剂盒的阳性率分别为2 5%、3 0%和3 .25%,三者之间差异无显著性(P>0 .05);三者之间的符合率为99 0%、98.8%和99 .0%,差异无显著性(P>0. 05 )。结论　重组Toxo14 -3- 3抗原检测弓形虫血清抗体具有潜在价值。     

肺癌患者14-3-3σ基因启动子甲基化与其mRNA表达水平的关系

目的:探讨肺癌患者14-3-3σ基因启动子CpG岛甲基化状况与其mRNA表达水平的关系。方法:用实时定量PCR检测14-3-3σ基因mRNA在肺癌组织、正常肺组织及肺癌细胞株A549中的表达;用甲基化特异性PCR检测这些组织、细胞中14-3-3σ启动子区CpG岛甲基化状态。结果:14-3-3σ基因启动子在肺癌组织和正常肺组织中发生甲基化的频率分别为51.11%(23/45)和17.39%(4/23)(2χ=7.229,P=0.007)。14-3-3σmRNA在正常组织中全部表达,在肺癌组织中表达缺失率为15.56%(7/45),且表达量低于正常肺组织(t=10.309,P<0.001),不同肿瘤病理分型(SCLC、NSCLC)之间14-3-3σmRNA有显著差异(t=5.256,P<0.023),不同年龄、性别、肿瘤大小之间无显著差异(P>0.05)。14-3-3σ启动子甲基化与其表达量下降密切相关(r=0.48,P=0.04).结论:在肺癌中14-3-3σ启动子甲基化与其mRNA表达下调或缺失有密切关系,在肺癌发生中14-3-3σ异常甲基化起一定作用。     

抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原及疗效考核价值的初步研究

目的探讨抗重组日本血吸虫14-3-3(rSj14-3-3)的单克隆抗体检测血吸虫循环抗原对血吸虫病疗效考核的价值.方法制备纯化的抗日本血吸虫14-3-3的单克隆抗体,以纯化的兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶联免疫吸附试验(P-M-ELISA)法,分别对同批治疗前及治疗后2、4、6、12个月的血吸虫病患者和感染兔血清进行检测,并与常规检测抗体的可溶性虫卵抗原-酶联免疫吸附试验(SEA-ELISA)法比较.结果 P-M-ELISA法对治疗前血吸虫病患者检测阳性率为98.2%,而检测抗体的SEA-ELISA为95.5%.P-M-ELISA法对治愈后2、4、6、12个月血清循环抗原检测阴转率分别为17.7%、41.9%、55%、85%,而检测抗体的SEA-ELISA法分别为3.2%、6.5%、12.5%、15%.结论该法既有较好的诊断价值,又有较好的疗效考核价值.     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。