SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

SLC2A4基因启动子区rs5418位点变异对基因表达的影响

目的: 研究葡萄糖转运蛋白4(SLC2A4)基因启动子区rs5418多态位点G→A变异对基因表达的影响。方法: PCR法扩增SLC2A4基因核心启动子区序列。采用基因重组、定点突变等技术,构建rs5418位点含有不同等位基因的SLC2A4基因启动子重组表达载体。脂质体转染法将重组质粒转入HEK293T细胞,采用双萤光素酶报告系统,观察携带不同等位基因的重组质粒中下游报告基因的表达活性。结果: PCR扩增获得长度为716 bp的SLC2A4基因核心启动子序列,成功构建pGL3-SLC2A4-prom(A)和pGL3-SLC2A4-prom(G)重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,携带A等位基因的载体启动下游报告基因表达的相对活性(19.49±4.41)比携带G等位基因的载体(13.04±4.45)强,两者存在显著差异(P<0.05)。结论: SLC2A4基因启动子区rs5418位点的G→A突变能显著增强启动子活性,从而影响SLC2A4基因表达活性。     

IPO8基因启动子区rs35100176位点变异对基因表达的影响

 目的：研究人importin 8（IPO8）基因启动子区rs35100176多态性位点CCT插入/缺失对基因表达的影响。方法：PCR扩增IPO8基因启动子区包含rs35100176多态位点的342 bp序列,通过测序获得了49例DNA样本的基因多态性分布。以CCT/CCT插入纯合子或-/-缺失纯合子DNA样本为模板,扩增含有不同插入/缺失序列的IPO8基因启动子片段,插入萤光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3-3N Insertion 和pGL3-3N Deletion重组表达载体。重组质粒经Fugene 6.0转染入细胞,采用双萤光素酶报告系统,检测携带不同多态性序列的重组质粒中报告基因的表达活性;real-time PCR检测各不同基因型细胞中IPO8 mRNA表达。结果：通过测序发现rs35100176多态位点存在CCT/CCT、CCT/-和-/- 3种表型,其基因分布频率分别为1837%、5510%和2653%。成功构建pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,pGL3-3N Insertion启动下游报告基因表达的相对活性与pGL3-3N Deletion相比显著减弱,两者存在显著差异（P<005）;real-time PCR结果显示,CCT纯合插入的HEK293细胞中IPO8 mRNA的表达显著低于CCT纯合缺失的Saos-2细胞。结论：IPO8基因启动子区rs35100176位点的CCT碱基插入变异能显著抑制启动子活性,从而影响IPO8基因的转录。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

人ADAM17启动子荧光素酶报告质粒的构建与鉴定

目的构建人去整合素-金属蛋白酶17(ADAM17)启动子的荧光素酶报告质粒,对不同位点进行定点突变,分析其转录活性。方法通过生物信息学分析ADAM17启动子区域的叉头转录因子M1(FoxM1)结合位点,以人胃癌细胞系MGC-803基因组为模板,PCR扩增ADAM17基因启动子-1 365～+51片段,连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中;对FoxM1结合的3个位点进行定点突变;转染至293T细胞后用双荧光素酶报告系统分析其转录活性。结果测序结果显示,ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体均构建成功;与pGL3-basic组相比,pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05);与对照组相比,过表达FoxM1组介导的荧光素酶活性明显升高(P0.05),且pGL3-ADAM17(-1 365～+51)组高于突变组(P0.05)。结论成功构建了人ADAM17启动子荧光素酶报告基因及其突变体,初步验证了ADAM17受转录因子FoxM1的转录调控。     

人GDDR基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆人GDDR基因的启动子;构建GDDR启动子的报告基因载体并进行活性分析.方法:设计合成GD-DR启动子引物,采用PCR技术从人基因组DNA中扩增GD-DR启动子;将扩增片段插入T载体并利用酶切与测序进行鉴定;亚克隆该基因至pGL3-Basic荧光报告基因载体;瞬时转染细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:PCR扩增得到人GDDR基因启动子;成功构建pGL3-GDDR-promoter 报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性.结论:成功地构建人GDDR基因启动子的克隆及其报告基因载体的构建,为深入研究GDDR转录表达的调控机制提供基础.     

Wilson病ATP7B基因启动子区突变对基因表达的影响

目的 探讨Wilson病ATP7B基因启动子区突变与Wilson发病的关系。方法 在48例患者中发现2例存在-183（C→T）突变，对发现存在突变的样本的DNA片段进行分离，克隆入pGL2荧光素酶报告基因，转染细胞，测定荧光素酶的活性，以野生型的ATP7B基因启动子作为对照，分析ATP7B基因启动子点突变对转录活性的影响。结果 含正常与含突变ATP7B启动子区序列的pGL2载体的荧光素酶转录活性相比较差异无统计学意义（n=3，P〉0．05）。结论 启动子区-183（C→T）突变不影响基因转录活性。提示该突变的意义有待进一步的探讨。     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

以p53为靶点的新型抗肿瘤化合物细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有p53蛋白结合位点的p21或survivin基因启动子区的荧光素酶报告基因重组质粒,并获得稳定转染的细胞模型用于抗肿瘤化合物筛选。方法将含有p53蛋白结合位点的p21或survivin启动子区序列连接到pGL4.17-basic载体上,分别获得报告基因重组质粒pGL4.17-p21和pGL4.17-survivin;将两种重组质粒分别转染A549细胞,经G418筛选获得稳定转染细胞株A549-p21和A549-survivin;对该细胞模型进行条件优化,并将可调节p53蛋白表达的多种抗肿瘤药物作用于稳定转染细胞,通过荧光素酶检测和western blot方法验证细胞模型用于药物筛选的可行性。结果成功建立了分别含有p21或survivin启动子报告基因的A549-p21和A549-survivin稳定细胞模型,多种抗肿瘤药物作用该细胞后能够通过调节p53蛋白表达而影响报告基因荧光素酶活性。结论构建的稳定转染细胞模型可以用于筛选以p53为靶点的抗肿瘤化合物。     

人BAFF-R基因启动子活性的初步研究

目的以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域。方法克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞,检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域。结果8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性最强,pGL3-B8启动子活性最低。结论BAFF-R基因5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域。     

载脂蛋白AⅠ基因启动子和内含子1中的单核苷酸多态性对其表达的影响

目的构建含ApoAⅠ基因调控区和荧光素酶报告基因的真核表达载体，探讨ApoAⅠ基因启动子区域-75bp G→A置换及第1内含子＋83bp C→T置换对ApoAⅠ表达的影响。方法采用PCR方法扩增人染色体中含ApoAⅠ基因-145～＋289bp的DNA片段，筛选出含ApoAⅠAA／CC基因型（-75bp变异，＋83bp无变异）、GG／TT基因型（-75bp无变异，＋83bp变异）及GG／CC（-75bp和＋83bp均无变异）的DNA片段，构建含以上3个基因片段的pUC重组载体，经SacⅠ和BglⅡ酶切后，再将不同的DNA片段连接到含荧光素酶报告基因的pGL2载体中，获得多个重组克隆。采用阳离子脂质体转染法将携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒和携带海肾荧光素酶报告基因的对照质粒共转染HepG2细胞，经48h培养，用化学发光法测定细胞裂解液中荧光素酶的活性，以反映ApoAⅠ的表达水平。结果质粒重组获得3个pGL2-ApoAⅠ-L（-2500～＋289bp）长片段质粒和3个pGL2-ApoAⅠ-S（-145～＋289bp）短片段质粒，分别含AA／CC、GG／TT及GG／CC3种基因型。荧光素酶报告基因活性显示：ApoAⅠAA／CC或GG／TT基因型携带者引起荧光素酶相对活性明显低于GG／CC基因型者。结论基因启动子ApoAⅠ-75bp G→A置换和＋83bp C→T置换对ApoAⅠ转录活性起抑制作用，这可能是-75A和＋83T等位基因携带者高密度脂蛋白血浆水平降低的原因。     

干扰素刺激反应元件Ⅰ/Ⅱ在维甲酸诱导基因G表达调控中的作用

目的 深入研究维甲酸诱导基因G(retinoic acid-induced gene G,RIG-G)启动子上所含的干扰素刺激反应元件(interferon-stimulated response elements,ISRE)对RIG-G基因表达的调控作用.方法 根据RIG-G基因启动子所包含的ISRE序列,利用定点突变技术分别构建野生型和位点突变型的报告基因质粒,然后采用报告基因转染实验检测RIG-G基因启动子中ISRE序列的功能活性.结果 研究发现单独突变RIG-G基因启动子上的ISRE Ⅱ元件不影响报告基因的表达,而单独突变ISRE Ⅰ则会对报告基因的表达产生明显的抑制作用;同时突变ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件则会使报告基因完全失去对转录因子的反应性.结论 RIG-G基因启动子所包含的ISRE Ⅰ和ISRE Ⅱ元件是诱导该基因表达的转录因子复合物的作用位点,是该基因表达的分子基础,且ISRE Ⅰ元件的作用要优先于ISRE Ⅱ.     

人Egr-1启动子的克隆及其在肿瘤细胞中的辐射诱导反应

目的:克隆人Egr-1基因的启动子, 插入荧光素酶报告基因载体中, 并检测电离辐射对其活性的影响.方法:采用PCR技术从人乳腺癌细胞系MCF-7基因组中扩增出Egr-1启动子, 将其克隆到pGL3-basic载体中;将重组质粒转染人肿瘤细胞, 测定Egr-1启动子在不同辐射条件下转录活性的改变.结果:成功构建了Egr-1启动子的荧光素酶报告基因;在不同剂量的γ射线照射后, Egr-1的启动子活性均明显高于未照射组;在同一剂量照射后48 h, Egr-1的启动子活性达峰值.结论:本实验构建的Egr-1启动子具有辐射激活的功能, 为进一步研究放射-基因治疗奠定了基础.     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

人大麻素受体启动子真核报告质粒的构建及活性分析

目的:利用双荧光素酶报告基因体系,根据大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,cnr1)启动子序列不同部位的转录活性来初步确定其活性区域,为脊髓缺血耐受保护中cnr1高表达的转录调控的研究奠定基础。方法:从NCBI中获取cnr1基因转录起始点5’端向上约1800 bp的核苷酸序列,按照300 bp的距离间隔,设计6个不同长度的截短体PCR引物,以人全血基因组DNA为模板,分别扩增cnr1启动子区域的截短体片段,并克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒中。将含有不同截短体的重组质粒分别转染Hela、Jurket和A549细胞后行荧光素酶活性检测。根据不同截短体转录活性检测结果,确定cnr1启动子活性区域。结果:成功将cnr1启动子区6个不同长度(1800、1500、1200、900、600和300 bp)的截短体克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒。在3种细胞系Hela、Jurket和A549的荧光素酶活性检测均显示600 bp的截短体转录活性最强。结论:成功构建了cnr1启动子的报告基因重组质粒,初步证实-600 bp到-200 bp区为cnr1的启动子的活性区域,从而为进一步研究cnr1的转录调控奠定了基础。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

人NKX3.1基因启动子的克隆及在不同肿瘤细胞系中启动子活性的测定(英)

目的：克隆NKX3.1基因启动子并检测其启动子活性，为研究NKX3.1 基因转录调控的基本机制奠定基础。 方法： 采用PCR方法从人基因组中扩增NKX3.1基因上游 1.04 kb 启动子片段并分别克隆到报道基因载体pGL3-basic和 pEGFP-1中，通过转染细胞、荧光素酶活性测定及荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，检测其启动子活性。 结果： DNA测序结果证实克隆的 1.04 kb 启动子片段序列正确；pGL3-1.04 kb 启动子转染LNCaP细胞后，双荧光素酶活性测定M1/M2=2.7, 为pGL3-control 活性的1.5倍，为pGL3-basic活性的50倍。表明克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性。为检测此 1.04 kb 启动子在不同组织细胞中的活性，分别将pGL3-1.04 kb 启动子和pEGFP-1.04 kb启动子转染入不同的肿瘤细胞系，检测荧光素酶和绿色荧光蛋白的表达。结果显示 1.04 kb 启动子在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。采用TRANSFAC数据库分析，发现在 1 040 bp 片段内含有多种顺式作用元件，它们的功能性将需要进一步实验证明。 结论： 克隆的人NKX3.1基因上游 1.04 kb 片段具有较强的启动子活性，并且在前列腺癌细胞LNCaP中活性最高。     

Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响

目的 探讨CCNH基因启动子区-1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响.方法 通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及-1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响.结果 在AD293细胞中,-1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%(P<0.05).结论 -1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性.     

Cyclin H基因启动子区-1 SNP对转录活性的影响

目的　探讨CCNH基因启动子区- 1SNP位点碱基变异对CCNH基因转录活性的影响。方法 通过PCR和定点突变技术,构建了含CCNH基因基础启动子及- 1G突变启动子,用双荧光素酶报告系统观察此SNP对CCNH基因启动子转录活性的影响。结果　在AD293细胞中, -1G突变启动子活性比CCNH基础启动子活性低26%（P<0.05）。结论 -1T→G碱基变异可显著降低CCNH基因启动子转录活性。     

小鼠CXCR4基因启动子的克隆和报告基因载体构建

目的:克隆小鼠CXCR4基因启动子, 并建立CXCR4报告基因系统.方法:设计合成PCR引物, 从小鼠基因组DNA中扩增并克隆小鼠CXCR4基因的启动子区.序列测定确认后, 用克隆的启动子片段构建CXCR4荧光素酶报告基因载体pGL-CXCR4.转染细胞, 用双报告基因系统检测报告基因载体的活性.结果:成功扩增了小鼠CXCR4基因的启动子区.克隆入质粒载体后经DNA序列测定证实了其序列.通过转染细胞和荧光素酶分析, 证实所构建的报告基因可以反映CXCR4启动子的活性.结论:成功扩增、克隆了小鼠CXCR4基因启动子, 并成功建立起其报告基因系统, 为后续的研究奠定了基础.