重组人IL-2对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群及NK细胞的影响

目的　研究妊娠期感染弓形虫的小鼠脾脏T细胞亚群和NK细胞水平的变化及IL - 2对二者的影响。方法　BALB/c孕鼠被随机分为 4组 :空白对照、感染对照、两个IL - 2处理组。于妊娠第 8d ,空白对照腹腔注射 0 2ml生理盐水 ,其余组腹腔接种 4 0 0个弓形虫速殖子。在感染的 - 1、0、1d ,IL - 2处理组分别腹腔注射rhuIL - 2 5 0 0u(低剂量组 )和 10 0 0u(高剂量组 )。妊娠第 10、12、14、16d取孕鼠脾 ,流式细胞术检测T细胞亚群和NK细胞水平。结果与空白组相比 ,在妊娠各期感染组的脾CD4 + T细胞水平显著降低 ,而CD8+ T细胞水平显著升高 (第 10、12、14d) ,二者比值明显倒置 ;NK细胞水平明显下降。高剂量IL - 2处理组的CD4 + T细胞水平在妊娠第 10、12d高于感染组 ,CD8+ T细胞水平在妊娠第 10、14d低于感染组 ,CD4 + /CD8+ T细胞比值在妊娠第 10、12、14d高于感染组。低剂量IL - 2处理组CD4 + T细胞与感染组无显著性差异 ,CD8+T细胞水平仅在妊娠第 14d显著性低于感染组。结论　感染弓形虫孕鼠的外周免疫受到一定抑制 ,妊娠各期脾CD4 + /CD8+T细胞比例失衡 ;感染孕鼠NK细胞数量减少 ;注射适量rhuIL - 2可以使倒置的CD4 + /CD8+ T细胞比值逆转 ,促进NK细胞增殖 ,提高母体免疫水平。     

重组人IL-2及IFN—γ对感染弓形虫妊娠鼠T细胞亚群的影响

目的研究重组人IL-2及IFN-γ对感染弓形虫孕鼠T细胞亚群CD4＋、CD8＋水平的影响。方法取BALB／c孕鼠80只，随机分为空白对照组、感染对照组、IL-2组及IFN-γ组。于妊娠第8天空白对照组腹腔注射0．2ml生理盐水，其余各组腹腔注射200个弓形虫速殖子，并于妊娠第7、8、9天IL-2组每只孕鼠腹腔注射1000UIL-2，IFN-γ组每只孕鼠腹腔注射1000UIFN-γ。其余两组腹腔注射0．2ml生理盐水。妊娠第10、12、14、16、18天取妊娠鼠尾静脉抗凝血100μl，流式细胞仪检测CD4＋及CD8＋水平。结果与空白对照组相比，其他各组小鼠CD4＋T细胞水平在妊娠第10、12、14、16、18天均显著降低，而CD8＋T细胞在妊娠第10、12天显著升高，CD4＋／CD8＋T细胞比值倒置。但与感染对照组比较，其他各组CD4＋T细胞在妊娠第10、12、14天显著升高，CD8＋T细胞在妊娠第10、12天显著降低，CD4＋／CD8＋T细胞比值在妊娠第10、12、14天明显升高。而在妊娠第16、18天，CD4＋、CD8＋及CD4＋／CD8＋T细胞水平与感染对照组比较无明显差异。结论弓形虫攻击孕鼠后，免疫调节失衡，机体抗抵力下降，而重组人IL-2及IFN-γ可以改善机体细胞免疫功能，提高母体免疫力。     

重组人IFN-γ对感染弓形虫孕鼠细胞免疫及垂直传播的影响

目的观察重组人IFN-γ对感染弓形虫孕鼠细胞免疫状态及垂直传播的影响。方法取BALB/c孕鼠60只随机分为阳性感染对照组、治疗组及空白对照组。感染对照组与治疗组在孕鼠妊娠第8天用弓形虫速殖子攻击。治疗组于妊娠第7、8、9天用1000UIFN-γ治疗。所有各组孕鼠在妊娠第10、12天尾静脉采抗凝血,流式细胞仪检测CD4^＋、CD8^＋T细胞水平。并在妊娠第12天解剖孕鼠,观察活胎率及胎仔脑组织弓形虫感染情况。结果感染对照组及IFN-γ治疗组与空白对照组比,在孕后第10、12天CD4^＋T细胞水平显著降低,而CD8^＋T细胞水平显著升高,CD4^＋/CD8^＋T细胞比值倒置明显;但治疗组与感染对照组比较,治疗组在妊娠第10、12天CD4^＋T细胞显著升高,CD8^＋T细胞显著降低,CD4^＋/CD8^＋T细胞比值明显升高,活胎率也明显升高,宫内胚胎弓形虫感染率明显降低。结论IFN-γ治疗可以改善感染弓形虫孕鼠的细胞免疫功能,提高孕鼠免疫力,减少垂直传播概率。     

阿奇霉素和IFN-γ联用治疗小鼠弓形虫病效果

目的 观察阿奇霉素和IFN-γ联用治疗小鼠弓形虫病的效果及小鼠体内细胞免疫功能的变化.方法 将100只BALB/c小鼠随机分为感染对照组(A组)、阿奇霉素治疗组(B组)、阿奇霉素和IFN-γ治疗组(C组)、IFN-γr治疗组(D组)及空白对照组(E组)5组.A、B、C、D组均用弓形虫速殖子腹腔感染小鼠.B、C、D组于感染后24 h给药,连续5 d,观察10 d内小鼠的平均存活时间.同时在感染后第2、3、5天取小鼠尾静脉血测其CD4~+、CD8~+T细胞水平.结果 C组小鼠存活时间明显延长,各时段CD4~+T细胞水平均显著升高,CD8~+T细胞水平显著降低,CD4~+与CD8~+T细胞比值明显升高.结论 阿奇霉素和IFN-γ联用可提高小鼠弓形虫病的治疗效果,改善弓形虫感染后小鼠体内的细胞免疫功能.     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫脾淋巴细胞免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,脾T细胞亚群的动态变化。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用10μlPBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,制备脾淋巴细胞悬液并涂片,免疫细胞化学法检测脾CD4 、CD8 T细胞亚群。结果攻击后第16、19天TSo IFN-γ组脾CD4 T细胞比率较第10天升高(P<0.05);脾CD8 T细胞第10、13、16、19天呈现较高水平;CD4 /CD8 比值第10、13天出现倒置。结论TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可激发系统免疫反应,提高其细胞免疫应答水平,增强脾CD8 T细胞的细胞毒作用,抵抗弓形虫感染。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。     

经口灌胃感染弓形虫诱导的BALB/c小鼠肠道粘膜免疫应答

目的 研究BALB/c小鼠经口感染(灌胃)弓形虫速殖子后肠液IgA抗体分泌的动态变化及肠道粘膜组织诱导与效应部位T淋巴细胞亚群的变化,探讨肠道粘膜免疫应答机制.方法 将6～8周龄BALB/c小鼠100只随机分为对照组和感染组.感染组经口感染(灌胃)弓形虫RH株速殖子5×104个/只,对照组给予等量PBS.于感染后第2、4、6、8、10、13、16、19、22、25 d处死小鼠,每次5只.收集各时间点肠道冲洗液,用ELISA法测定肠液IgA水平;分离第2、4、6、8、10 d Peyer's Patches(PP)、肠系膜淋巴结(MLN)及小肠上皮内淋巴细胞(IEL),制备悬液并涂片,用免疫细胞化学方法测定CD4+、CD8+T细胞亚群水平.结果 在感染后第4、6、8、13 d实验组的肠液IgA抗体分泌显著高于对照组(P＜0.01).实验组PP结CD4+T细胞水平在6、8、10 d显著高于对照组(P＜0.05);CD8+T细胞水平与对照组无显著性差异,CD4+/CD8+比值在6、8、10 d显著升高(P＜0.05).肠系膜淋巴结的CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值各时间点均无显著变化.感染后第6、8、10 d,效应部位小肠上皮内淋巴细胞CD8+T细胞增高显著(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值倒置(P＜0.05).结论 经口感染弓形虫BALB/c小鼠的肠道产生高水平的IgA抗体,作为局部首道屏障,发挥着重要的抗虫作用.诱导部位PP CD4+T细胞水平明显增高,诱导对弓形虫抗原的处理提呈作用;效应部位IEL CD8+T细胞亚群增殖明显,在清除虫体的过程中起主导作用.     

弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞的影响

目的　观察弓形虫感染对小鼠和人子宫自然杀伤细胞（uterine natural killer cells, uNK cells）比例、数量、分化和功能的影响,探讨uNK细胞在弓形虫感染致早孕流产中的作用。方法　妊娠第6.5天给予孕鼠腹腔注射弓形虫速殖子,建立孕早期弓形虫感染致流产小鼠模型,妊娠第9.5天分离小鼠子宫淋巴细胞。取人正常妊娠孕早期流产新鲜蜕膜组织,分离人子宫淋巴细胞,与弓形虫RH株速殖子体外共培养48 h（弓形虫与子宫淋巴细胞比例分别为0.5∶1、1∶1、2∶1）。采用流式细胞术检测小鼠uNK细胞表型（CD122、NK1.1、DX5）、人uNK细胞表型（CD3、CD56、CD11b、CD27）及胞内细胞因子γ⁃干扰素（interferon⁃γ, IFN⁃γ）和肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α, TNF⁃α）表达水平。磁珠分选小鼠和人uNK细胞,以小鼠YAC⁃1或人K562细胞作为靶细胞、以小鼠或人uNK细胞作为效应细胞,采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法检测效应细胞/靶细胞比例分别为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时uNK细胞的杀伤功能。结果　妊娠第9.5天,弓形虫感染组小鼠流产率较对照组显著上升（83.02% vs. 3.51%;[χ2] = 71.359,P < 0.001）。与对照组比较,弓形虫感染组小鼠uNK细胞绝对数量显著降低[（4 547 ± 1 610）个/只 vs.（8 978 ± 3 339）个/只;U = 2.000,P < 0.05]、细胞表面NK1.1表达水平显著下降[（74.53 ± 8.37）% vs.（93.00 ± 1.11）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1⁃DX5⁃细胞比例显著上升[（20.10 ± 8.03）% vs.（5.04 ± 0.68）%;U = 0.000,P < 0.05]、NK1.1+DX5+细胞比例显著下降[（21.70 ± 12.48）% vs.（45.75 ± 2.26）%;U = 0.000,P < 0.05]、IFN⁃γ表达水平显著升高[（16.74 ± 1.36）% vs.（8.13 ± 1.90）%;U = 0.000,P < 0.05],但TNF⁃α表达水平无显著改变[（67.98 ± 9.20）% vs.（52.93 ± 10.42）%;U = 2.000,P > 0.05]。弓形虫感染组小鼠uNK细胞表现出较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对YAC⁃1细胞的杀伤活性分别为2.30%、4.32%、8.12%和12.65%,对照组分别为1.21%、1.63%、2.51%和3.22%。将人子宫淋巴细胞与弓形虫RH株速殖子共培养48 h后,弓形虫感染组人uNK细胞在子宫淋巴细胞中所占比例较对照组显著降低[弓形虫2∶1组 vs. 对照组：（6.61 ± 1.75）% vs.（17.48 ± 4.81）%;F = 7.307,P < 0.01]、绝对数量显著减少[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（12 104 ± 5 726）个/孔 vs.（65 285 ± 21 810）个/孔;H =11.540,P < 0.01]。弓形虫感染组uNK细胞中,CD56brightCD16⁃调节型NK细胞亚群比例较对照组减少（弓形虫2∶1组vs. 对照组：（25.25 ± 5.90）% vs.（36.03 ± 4.51）%;F = 3.213,P > 0.05]、CD56dimCD16+杀伤型NK细胞亚群比例增加[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（11.15 ± 2.15）% vs.（7.09 ± 2.24）%,F = 2.992,P > 0.05],两者比值显著降低[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（2.37 ± 0.92）vs.（5.58 ± 2.39）;H = 8.228,P < 0.05];CD11b+CD27⁃细胞比例显著上升[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（30.28 ± 6.91）% vs.（17.48 ± 4.67）%;H = 6.556,P < 0.05],IFN⁃γ [弓形虫2∶1组vs. 对照组：（14.13 ± 1.28）% vs.（15.19 ± 1.64）%;F = 1.639,P > 0.05]、TNF⁃α表达水平无显著改变[弓形虫2∶1组vs. 对照组：（54.76 ± 10.02）% vs.（50.33 ±3.67）%;F = 0.415,P > 0.05]。弓形虫感染组人uNK细胞具有较强杀伤能力,且杀伤作用随着效应细胞/靶细胞比例升高逐渐增强;效应细胞/靶细胞比例为1∶1、5∶1、10∶1、20∶1时,感染组uNK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为11.90%、28.11%、49.91%和73.35%,对照组分别为11.21%、21.63%、33.51%和48.22%。结论　弓形虫感染对小鼠和人uNK细胞分化和分泌功能产生了不同影响,但均可引起小鼠和人uNK细胞绝对数量减少、杀伤功能增强。     

香菇多糖预处理对急性弓形虫感染小鼠中枢神经系统损伤的保护性作用研究北大核心CSCD

目的探究香菇多糖预处理对急性弓形虫感染小鼠脑中枢神经系统的保护性作用。方法将C57BL/6小鼠随机分为对照组(NC)、模型组(TDI)和香菇多糖预处理组(pre-10dLNT TDI)。弓形虫感染前10d,pre-10dLNT组小鼠连续10d腹腔注射LNT(1mg/kg体重,1次/d),弓形虫感染后无任何处理;TDI组小鼠腹腔注射弓形虫悬液0.5 mL/只鼠;NC组小鼠感染前10d开始腹腔注射同等体积的生理盐水(1次/d)。通过观察小鼠的死亡时间及数量计算各组小鼠的存活率,使用流式细胞仪检测感染后第8d小鼠脑组织中CD8+IFN-γ+T细胞百分比,ELISA法检测感染后第4d和第8d小鼠外周血中IFN-γ、GABA和DA水平,应用SoftMax Pro 4.3.1LS软件绘制标准曲线计算各项指标的含量(pg/ml)。采用Grapad 8.0软件进行处理和分析。结果TDI组小鼠第8d存活率为0%,pre-10dLNT TDI组小鼠第8d存活率为60%;与NC组相比,TDI组和pre-10dLNT TDI组CD8+IFN-γ+T细胞亚群水平均明显增高;与TDI组小鼠相比,pre-10dLNT预处理明显降低了弓形虫感染的C57BL/6J小鼠脑组织中CD8+IFN-γ+细胞数量(P<0.01)、明显降低了小鼠第4d和8d的外周血中IFN-γ产生水平(P<0.05;P<0.01)、第8d小鼠外周血中DA和GABA的产生水平显著增加(P<0.01)。结论LNT预处理可以显著提高急性弓形虫感染小鼠的存活率,通过减少CD8+T细胞通过血脑屏障进入CNS,降低神经系统的广泛炎症反应,通过降低脑组织中CD8+IFN-γ+T细胞数量,调节神经递质的分泌水平,从而改善小鼠脑部的炎症反应,对急性弓形虫小鼠中枢神经系统的损伤具有明显的保护作用。     

可溶性弓形虫速殖子抗原联合蜂胶和IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的比较蜂胶、IFN-γ佐剂以及两种佐剂混合鼻内免疫辅助STAg增强机体细胞免疫应答的水平,探讨两种佐剂联合应用的免疫效果。方法将5~6周龄雌性BALB/c小鼠60只随机分为4组:20μg STAg组,20μg STAg+40μg蜂胶组,20μg STAg+1 000 U IFN-γ组和20μg STAg+40μg蜂胶+1 000 U IFN-γ组。将抗原和佐剂溶于20μl PBS中,双侧鼻孔(10μl/鼻孔)滴鼻免疫。免疫2次,间隔14 d,末次免疫后第10 d用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。逐日观察小鼠存活情况。攻击后第43 d处死全部存活小鼠,免疫细胞化学(ICC)法检测小鼠PP结、IEL和脾T淋巴细胞亚群水平。结果与STAg组相比,各佐剂组小鼠T淋巴细胞亚群比例有升高的趋势,其中IFN-γ、蜂胶+IFN-γ佐剂组小鼠PP结CD4+、CD8+T淋巴细胞,IEL、脾CD8+T淋巴细胞数显著高于STAg组,CD4+/CD8+T淋巴细胞比值倒置。结论在抗弓形虫感染中,IFN-γ的佐剂作用优于蜂胶,有效激发机体细胞免疫应答,可用作鼻内免疫抗弓形虫感染的粘膜佐剂。IFN-γ+蜂胶佐剂鼻内免疫效果优于单独蜂胶、IFN-γ佐剂,应用联合佐剂是抗弓形虫感染免疫的一个新思路。     

弓形虫感染孕鼠T淋巴细胞亚群在外周血及蜕膜变化的研究

目的　探讨弓形虫感染孕鼠T淋巴细胞亚群在外周血及蜕膜的变化。方法　正常及弓形虫感染 (感染后 72h)孕鼠均于孕 1 8天 ,采用流式细胞仪技术检测外周血及蜕膜CD+ 4、CD+ 8T细胞百分率。结果　 (1 )在外周血 ,T淋巴细胞的变化表现为CD+ 4T细胞增多 (P <0 0 1 ) ,CD+ 8T细胞几乎无改变 ,CD+ 4/CD+ 8细胞比值增大 (P <0 0 1 )。 (2 )在蜕膜 ,T淋巴细胞的变化表现为CD+ 4T细胞减少 (P <0 0 5) ,CD+ 8T细胞增多 (P <0 0 5) ,CD+ 4/CD+ 8细胞比值减小 (P <0 0 1 )。结论　蜕膜局部对于阻断弓形虫感染孕鼠的母婴垂直传播可能起着重要的作用     

旋毛虫感染小鼠IgG、IL-2和T淋巴细胞亚群动态变化的观察

目的　了解小鼠感染旋毛虫后 Ig G抗体水平、IL - 2分泌量和 T淋巴细胞亚群的动态变化。方法　分别于旋毛虫感染后第 7、14、2 1、2 8和 35天 ,采用 EL ISA方法检测血清特异性 Ig G抗体水平和 IL- 2含量 ,采用流式细胞仪检测 CD4+、CD8+T细胞百分率。结果　 Ig G抗体水平在感染后逐渐上升 ,感杂后 35天达最高值 ;T淋巴细胞的变化表现为 CD4+T细胞减少、CD8+T细胞增多 ,CD4+/ CD8+细胞比值下降 ,以感染后第 14天最为显著 ,直到感染后第 35天仍未见恢复。IL - 2分泌量以感染后第 7天达高峰 ,然后迅速下降 ,到感染后第 35天低于正常组。讨论　旋毛虫感染的急性期 ,小鼠出现免疫抑制现象。抗旋毛虫感染的保护性免疫是由细胞免疫与体液免疫协同完成的。     

弓形虫感染大鼠外周血T淋巴细胞亚群及IFN-γ、TNF-α、IL-4动态变化

目的 观察弓形虫感染大鼠外周血T淋巴细胞亚群及干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-4（IL-4）动态变化。 方法 将54只清洁级Sprague-Dawley（SD）成年大鼠随机分成9组,其中8组每鼠腹腔注射经纤维素-11（CF-11）纯化的活弓形虫速殖子悬液2 ml（2×10⁵/L）。分别于弓形虫感染后1、3、7、14、28、35、42、60 d时取大鼠外周全血,流式细胞术检测T细胞亚群变化,ELISA检测外周血IFN-γ、TNF-α、IL-4动态变化。对照组腹腔注射2 ml生理盐水。 结果 T淋巴细胞亚群CD8+水平在感染弓形虫后3 d（14.22%）、7 d（14.93%）、14 d（16.08%）均显著低于正常水平（23.08%）（P＜0.05）,至感染后28 d恢复正常水平,而CD4+水平在整个感染过程中无明显变化。IFN-γ和IL-4水平在感染后第7 d分别升高至6.73 pg/ml和6.91 pg/ml（P＜0.05）,至感染60 d仍高于正常水平;TNF-α至感染后28 d（14.37 pg/ml）及60 d均高于正常水平（10.81 pg/ml）（P＜0.05）。 结论 弓形虫感染后大鼠外周血CD8+水平一度降低,28 d后恢复正常,CD4+无明显变化,IFN-γ、IL-4和TNF-α均高于正常水平,但出现时间有差异。     

致敏IEL过继转移诱导抗弓形虫感染的机制

目的分离供体鼠感染弓形虫后不同时间点的小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)并过继转移,研究其诱导受体鼠抗弓形虫感染作用及其机制。方法BALB/c小鼠经口感染弓形虫速殖子5×104个/只,对照组未感染,作为供体提供IEL。同品系小鼠36只为受体鼠,分为6组,每组6只,经尾静脉分别接受分离自供体鼠感染弓形虫后第7(IEL7组)、9(IEL9组)、11(IEL11组)、13(IEL13组)、15d(IEL15组)的致敏IEL或未致敏(IEL0组,即对照组)的IEL3×105/0.2ml·只。各组小鼠过继转移后第4d,用弓形虫速殖子灌胃攻击,攻击后第13d分离纯化脑、肺、脾组织内速殖子并计数,测定小肠Peyer′s Patch(PP)CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果致敏IEL过继免疫可使受体鼠脑、肺、脾组织内速殖子数显著减少,接受致敏后第13d IEL的小鼠组织内速殖子数减少最为显著(Ρ<0.01),与IEL0组相比,脑、肺和脾组织内速殖子数分别减少81.13%、58.43%和70.97%;同时,小肠PP结CD4+T细胞增多,CD4+/CD8+比值增高(Ρ<0.01)。结论过继转移致敏IEL能显著提高受体鼠的抗弓形虫感染能力,且保护作用同致敏时间关系密切,以感染后13d分离的致敏IEL保护性最强。     

老年肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群和自然杀伤细胞的临床及意义

目的探讨老年肺癌患者T淋巴细胞亚群和自然杀伤(NK)细胞水平及临床意义。方法该校附属医院80例老年肺癌患者作为观察组,回顾分析外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞检测结果,与另选的80例健康受检者(对照组)进行对比分析,并于术后20 d复查肺癌患者的外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞,对比缓解者与未缓解者的检查结果。结果外周血T淋巴细胞亚群与NK细胞表达水平检测中,观察组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值与NK细胞水平较对照组明显降低(P0.05),CD8+表达水平明显高于对照组(P0.05)。观察组于术后20 d复查T细胞亚群和NK细胞,根据结果分为两组进行分析,发现缓解组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+和NK表达均较化疗前明显上升,CD8+表达显著降低(P0.05)。而未缓解组各项指标化疗前后无明显变化(P0.05)。结论 NK细胞与外周血T淋巴亚群对诊断、评价肺癌的疗效、判断预后具有重要价值。     

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究

目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFNγ及IL4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况。结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05);pVACGRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫组IFNγA值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高;pVACGRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论用pVACGRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用。     

弓形虫感染大鼠外周血T细胞亚群动态变化

目的观察弓形虫感染大鼠外周血T淋巴细胞亚群的动态变化。方法将58只清洁级SD成年大鼠随机分成9组,其中8组为实验组,1组为对照组,实验组每鼠腹腔注射2×105/LCF-11纤维素纯化的活弓形虫速殖子悬液2ml,对照组腹腔注射2ml生理盐水,并留4只为正常对照鼠。分别于弓形虫感染后1、3、7、14、28、35、42、60d时取大鼠外周全血,用流式细胞术检测外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分比。结果弓形虫感染后3d、7d时,CD3+水平降至最低,但与正常鼠和对照鼠无显著性差异(P>0.05),至感染14d基本恢复至正常水平,此后再无明显变化。CD8+亚群水平在感染后3d、7d、14d时均显著低于正常水平(P<0.05),至感染后28d恢复正常水平。而CD4+亚群水平在整个感染过程中无明显变化(P>0.05)。CD4+/CD8+比例在感染后3d、7d、14d时显著高于正常鼠和对照鼠(P<0.05)。结论弓形虫感染影响大鼠外周血T淋巴细胞亚群比例,但可自行恢复正常。     

流式细胞术测定感染旋毛虫小鼠免疫功能的研究

目的观察感染旋毛虫小鼠免疫功能的动态变化.方法采用流式细胞术分别检测感染旋毛虫后7、14、21、28、35d小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分率.结果实验组较正常组CD4+T细胞减少,CD8+T细胞增多,CD4+/CD8+细胞比值下降(P＜0.05),以感染后第14d最明显,直到感染后35d仍未见恢复.结论感染旋毛虫的小鼠出现免疫抑制现象,感染急性期的免疫抑制程度最高.     

老年SD大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的变化

目的探讨SD老年大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群的变化。方法流式细胞仪检测老年大鼠(10只)和青年鼠(5只)脾脏和血液T淋巴细胞亚群的变化。结果 SD老年大鼠脾脏和外周血T淋巴细胞亚群阳性率的变化相一致,CD3+、CD4+、CD8+细胞阳性率均低于青年组水平,且CD4细胞阳性率均明显低于青年组(P<0.05);CD4+/CD8+比值均低于青年组,在脾脏CD4+/CD8+比值与青年组相比具有显著性差异(P<0.05)。结论 SD老年大鼠脾脏和外周血T胞亚群阳性率均减少,且CD4+/CD8+比值明显降低,提示SD老年大鼠免疫功能的衰退和紊乱与T细胞密切相关。     

PD-1/PD-L1在弓形虫感染小鼠妊娠中晚期的表达及与IFN-γ的相互调节作用

目的　探讨程序性死亡蛋白（programmed death protein?1, PD?1）及其配体PD?L1在小鼠妊娠早期弓形虫感染后母胎界面的动态表达,及其与γ干扰素（interferon?γ,IFN?γ）的相互调节作用。方法　将20只孕0 d母鼠随机平均分为4组,即孕12 d对照组（12 dpn组）、孕12 d感染组（12 dpi组）和孕18 d对照组（18 dpn组）、感染组（18 dpi组）。在妊娠第6天时对12 dpi组、18 dpi组孕鼠给予150个弓形虫PRU株速殖子腹腔注射,12 dpn组、18 dpn组孕鼠则注射等量PBS。于小鼠妊娠第12天和第18天分别处死4组小鼠,计数胎盘、胎儿数量并称重。取各组孕鼠胎盘和子宫组织观察其组织病理变化,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测胎盘、子宫组织中PD?1与PD?L1、弓形虫表面抗原SAG?1及细胞因子IFN?γ mRNA表达水平,并分析PD?1与IFN?γ表达的相关性。设置12 dpn、12 dpi、18 dpn、18 dpi组以及12 dpi PBS阴性对照组、18 dpi PBS阴性对照组,采用免疫组织化学染色检测孕鼠子宫、胎盘组织中PD?1表达水平。结果　 12 dpi组和18 dpi组孕鼠均出现胎盘和胎儿发育不良等不良妊娠结局,且胎盘重量和胎儿体质量均低于12 dpn组、18 dpn组 (t = 5.52、11.44、12.63、11.67,P 均< 0.01)。组织病理观察结果显示,12 dpi组和18 dpi组孕鼠胎盘组织蜕膜及连接区连接疏松,胎盘及子宫组织中均见大量炎性细胞浸润和淤血。经qPCR检测发现,12 dpn、12 dpi、18 dpn组和18 dpi组小鼠胎盘和子宫组织中PD?1、PD?L1、IFN?γ和SAG?1表达均存在差异（F = 22.48、51.23、9.61、47.49、16.08、21.52、28.66、238.90,P 均< 0.05）,其中12 dpi组小鼠胎盘（P均 < 0.05）及子宫组织中（P均 < 0.05）中PD?1、PD?L1、IFN?γ和SAG?1表达水平均较12 dpn组升高。与18 dpn组相比,18 dpi组小鼠胎盘组织中PD?1和PD?L1表达水平均下降（P 均< 0.05）,胎盘和子宫组织中IFN?γ和SAG?1表达水平均升高（P均< 0.05）。与12 dpi组相比,18 dpi组孕鼠胎盘和子宫中PD?1和PD?L1表达水平均下降（P均< 0.05）。免疫组化染色结果显示,PD?1在12 dpi组孕鼠胎盘组织中浸润的炎性细胞上有表达,在18 dpi组中表达不明显;PD?1在12dpi组孕鼠子宫上皮呈强阳性表达,而在18 dpi组呈弱阳性表达。相关分析结果显示,12 dpi组孕鼠胎盘（rs = 0.99,P ＜0.01）、子宫（rs = 0.97,P ＜0.01）,18 dpi组孕鼠胎盘（rs = 0.82,P ＜ 0.05）、子宫（rs = 0.81,P ＜0.05）中 IFN?γ与PD?1 mRNA表达水平均呈正相关。结论　小鼠妊娠早期感染弓形虫后,胎盘和子宫中PD?1/PD?L1表达呈孕中期显著上升、孕晚期下降的动态变化,且与同期 IFN?γ表达趋势一致,其中PD?1与IFN?γ表达呈正相关;故推测在孕鼠妊娠中、晚期,母胎界面PD?1/PD?L1通路与弓形虫感染所诱导的IFN?γ有相互调节关系。     

CD47及其配体在孕期弓形虫感染小鼠中的表达

目的　观察孕早期弓形虫感染小鼠中分化簇CD47及其配体信号调节蛋白α（SIRPα）和血小板反应蛋白1（TSP⁃1）在孕中、晚期的动态表达。方法　以C57BL/6J小鼠（6～8周龄）构建孕早期弓形虫感染小鼠模型,将孕鼠随机分成正常对照组和感染组,每组10只。感染组孕鼠于孕6.5 d（Gd6.5）时腹腔注射150个弓形虫速殖子,正常对照组孕鼠同一时间腹腔注射等体积生理盐水。于Gd12.5、Gd18.5时,收集各组孕鼠子宫和胎盘组织,并记录妊娠状态结局。通过苏木精⁃伊红（HE）染色观察两组孕鼠子宫、胎盘组织Gd12.5和Gd18.5时病理损伤,采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测各组孕鼠子宫、胎盘组织中CD47、SIRPα、TSP⁃1、主要表面抗原1（SAG1）及γ干扰素（IFN⁃γ）、白细胞介素2（IL⁃2）、IL⁃4和IL⁃13 mRNA表达水平,采用免疫组织化学技术检测CD47、SIRPα和TSP⁃1在孕鼠子宫、胎盘组织中的表达水平。结果 　与正常对照组相比,感染组孕鼠孕期出现弓背、耸毛、颤栗和精神萎靡状态,个别出现阴道流血和流产等现象。HE染色结果显示,感染组孕鼠子宫、胎盘组织均出现不同程度炎症细胞浸润、淤血和坏死等病理损伤。Gd12.5和Gd18.5时,感染组孕鼠流产率均较对照组升高（[χ2] = 20.405、28.644,P 均< 0.001）。qPCR检测结果显示,Gd12.5和Gd18.5时正常对照组和感染组孕鼠胎盘组织中 CD47、SIRPα、TSP⁃1、SAG1、INF⁃γ、IL⁃2、IL⁃4和IL⁃13表达水平差异均有统计学意义[F′（F）= 37.511、29.337、97.343、53.755、67.188、21.145、8.658、13.930,P均< 0.001];与对照组相比,Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1表达水平升高（P 均< 0.01）,而Gd18.5时表达降低（P 均< 0.001）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠胎盘组织中均有SAG1 表达（P 均< 0.01）;此外,Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠胎盘组织中INF⁃γ和IL⁃2表达水平均升高（P 均< 0.001）,IL⁃4和IL⁃13表达下降（P 均< 0.001）。Gd12.5和Gd18.5时正常对照组和感染组孕鼠子宫组织中 CD47、TSP⁃1、SAG1、INF⁃γ、IL⁃2、IL⁃4和IL⁃13表达水平差异均有统计学意义[H （F′、F）= 14.951、25.977、18.711、48.595、39.318、14.248、15.468,P 均< 0.01];与正常对照组相比,Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中CD47和TSP⁃1表达水平均升高（P 均< 0.01）,但SIRPα表达无变化（P > 0.05）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中均有SAG1 表达（P 均< 0.01）;Gd12.5和Gd18.5时感染组孕鼠子宫组织中INF⁃γ和IL⁃2表达水平均升高（P 均< 0.001）,IL⁃4和IL⁃13 表达水平下降（P 均< 0.001）。相关性分析显示,Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47表达水平与IFN⁃γ（rs = 0.735）、IL⁃2（rs = 0.655）表达水平呈正相关（P 均< 0.05）,与IL⁃4（rs = -0.689）、IL⁃13达水平（rs = -0.795）表呈负相关（P 均< 0.05）;Gd18.5时胎盘组织中CD47表达水平与IFN⁃γ表达水平（rs = -0.745）、IL⁃2（rs = -0.816）呈负相关（P 均< 0.05）,与IL⁃4（rs = 0.704）、IL⁃13表达水平（rs = 0.802）呈正相关（P均< 0.05）。免疫组织化学染色结果显示,Gd12.5和Gd18.5时正常对照组孕鼠子宫、胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1均呈弱表达;Gd12.5时感染组孕鼠胎盘组织中CD47、SIRPα和TSP⁃1呈强表达,子宫组织中CD47和TSP⁃1呈强表达。结论　孕早期弓形虫感染可致小鼠孕中、晚期母胎界面出现CD47及其配体SIRPα和TSP⁃1异常表达,可能与虫体在母胎界面免疫逃逸有关。