IL-10、IL-17及IL-18在肝细胞肝癌中的表达特点及其临床意义

目的 检测IL-10、IL-17及IL-18在肝细胞肝癌中的表达特点,为肝细胞肝癌的诊断与治疗提供实验依据.方法 采用RT-PCR方法检测肝癌以及癌旁组织中IL-10、IL-17及IL-18mRNA水平的表达,采用Western Blot、免疫组化方法检测肝癌以及癌旁组织中IL-10、IL-17及IL-18蛋白水平的表达;采用ELISA检测肝癌细胞株BEL-7402、HepG2中IL-10、IL-17及IL-18的释放水平.结果 IL-10、IL-17在肝癌组织及细胞株中高表达,与血清AFP检测结果呈正相关;IL-18在肝癌组织及细胞株中不表达或者少量表达,与血清AFP检测结果呈负相关.结论 IL-10、IL-17的过表达和IL-18的沉默与肝细胞肝癌的发生密切相关,IL-10、IL-17的过表达可作为肝细胞肝癌诊断的重要标志.     

血清AFP阴性与阳性肝细胞癌免疫组化的比较性研究

甲胎蛋白（alpha—fetoprotein，AFP）是目前临床诊断原发性肝细胞性肝癌的重要指标，通过检验血清AFP的肝癌诊断率约为70％，但30％的肝癌AFP阴性。Kawai等利用cDNA芯片技术对产生AFP肝癌细胞株的基因表达谱进行研究，结果表明产生AFP的肝癌细胞株具有许多种类的特异基因表达谱。为了解AFP阴性肝细胞癌的蛋白表达特征，本实验应用免疫组化和细胞图像分析技术检测血清AFP阴性与阳性肝细胞癌组织中AFP和Tn蛋白表达情况，探讨AFP和Tn蛋白在肝癌组织中是否具有差异性分布及其意义。     

细胞外基质蛋白1在肝癌中的表达及意义

目的：探讨细胞外基质蛋白1（extracellular matrix protein1,ECMl）在肝癌中的表达及意义。方法：应用免疫组织化学EnVision法,检测肝脏细胞株（正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株HepG2）和肝脏组织（正常肝组织和肝癌组织）中ECM1的表达,并比较正常肝组织和肝癌组织之间的ECM1表达差异。结果：ECM1的表达如下：正常肝细胞株LO2（-）,肝癌细胞株HepG2（＋）;正常肝组织阳性率20％（4／20）,肝癌组织阳性率85．4％（70／82）。统计分析表明,对ECM1的表达,肝癌组织明显高于正常组织（P〈0．01）。结论：ECM1在肝癌组织中过表达。     

Fbxw7在肝癌中的表达及与肝癌细胞增殖相关性研究

目的:探讨Fbxw7在肝癌中的表达及其与肝癌细胞增殖能力的相关性.方法:收集40例肝细胞癌组织及对应的癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测Fbxw7在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况;real time RT-PCR技术检测正常肝细胞株LO2、肝癌细胞株Hep3B和SMMC-7721中Fbxw7mRNA的表达水平;平板克隆形成实验与裸鼠皮下成瘤实验检测不同Fbxw7 mRNA表达水平的细胞株体内外增殖能力.结果:Fbxw7 mRNA及蛋白在肝癌组织中表达水平显著低于对应癌旁组织(P＜0.05);Fbxw7蛋白低表达与高Edmonson分级和高TNM分期具有显著的相关性(P＜0.05);正常肝细胞株LO2中Fbxw7 mRNA的表达水平显著高于肝癌细胞株Hep3B和SMMC-7721 (P＜0.05);Fbxw7表达较低的细胞株形成的克隆数较多,且裸鼠皮下成瘤体积较大,结果均具有统计学差异(P＜0.05).结论:Fbxw7低表达与肝癌的恶性临床病理特征相关,并与肝癌细胞增殖能力相关.     

抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌(HCC)的单克隆抗体(MAb),为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经"尾静脉.脾脏联合方法"免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术(LSCM)进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 (1)获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%(67/68);(2)注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.     

抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备高特异性和高亲和力的抗人肝细胞肝癌（HCC）的单克隆抗体（MAb）,为肝癌的靶向诊断及治疗提供依据.方法 用人肝细胞肝癌细胞株HepG-2经＂尾静脉.脾脏联合方法＂免疫BALB/c小鼠.取其脾脏细胞与同源小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14融合,经ABC免疫组化初筛抗体、有限稀释法亚克隆化、染色体分析、免疫组化鉴定抗体特异性、共聚焦显微镜扫描技术（LSCM）进行组织定位、ELISA分析鉴定抗体的亚型及荷人肝癌裸鼠牛物分布等进一步鉴定其生物学特性.结果 （1）获得一株分泌抗人肝细胞肝癌单克隆抗体的杂交瘤;该抗体与肝癌组织结合的特异性高达98.5%（67/68）;（2）注射131I-MAb后瘤部位放射性分布有逐渐增加的趋势,血液、肝脏、肾脏和肺脏放射性有逐渐减低的趋势,72 h肿瘤/血液和肿瘤,肝脏比值分别为15.76±3.28和7.23±1.70.结论 成功制备抗人肝细胞肝癌的单克隆抗体,具有较好的肝癌特异性、靶向性,对原发性肝癌有潜在的诊断及治疗作用.     

长链非编码RNA LINP1对肝癌细胞增殖、侵袭转移的影响

目的探究长链非编码RNA LINP1在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的影响。方法使用qRT-PCR方法检测60例肝癌组织以及癌旁组织、肝癌细胞株及正常肝细胞中LINP1的表达情况。si-LINP1转染肝癌细胞敲低LINP1表达;CCK-8实验检测si-LINP1对肝癌细胞增殖影响;Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin和cyclinD1表达。结果 LINP1在肝癌组织中的表达水平高于癌旁组织,肝癌细胞高于正常肝细胞系Lo2(P0.05);敲低LINP1抑制肝癌细胞增殖及侵袭转移,抑制Wnt/β-catenin信号通路蛋白β-catenin和cyclinD1表达(P0.05)。结论敲低LINP1抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和转移与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。     

肝细胞癌中microRNA-375调控的基因网络分析

 目的: 探讨肝细胞癌中miR-375的表达及其调控的相关靶基因和信号通路。方法: 采用原位杂交检测miR-375在人肝癌组织芯片的表达情况;人全基因组表达谱芯片检测4株肝癌细胞株;MAS生物信息学软件筛选miR-375调控靶基因及相关信号通路。结果: 原位杂交结果显示miR-375在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P < 0.05);人全基因组表达谱芯片结果分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞的共上调基因有20个,共下调基因有17个;MAS生物信息学软件分析显示4株转染miR-375的肝癌细胞共有的上调信号通路有54条,下调信号通路有48条。结论: miR-375与肝细胞癌有密切的关系。对miR-375调控的肝细胞癌相关靶基因与信号通路进行多元化筛选,为后续全面深入的研究肝细胞癌发生发展的机制提供了便利。     

GRAMD4在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的 检测GRAMD4在肝细胞癌中的表达情况,分析其与肝癌临床病理特征之间的相关性.方法 收集40例肝细胞癌及对应癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测GRAMD4在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况,统计学分析GRAMD4mRNA表达与肝癌临床病理特征之间的相关性;应用RT-PCR技术检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞Hep3B、HepG2、SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达.结果 GRAND4 mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达显著高于对应的癌旁组织(P＜0.05);GRAMD4 mRNA的高表达与肿瘤体积增大、高Edmonson分级和高TNM分期呈明显正相关(P＜0.05);肝癌细胞株Hep3B、HepG2和SMMC-7721中GRAMD4 mRNA的表达较正常肝细胞LO2显著增加(P＜0.05).结论 肝癌细胞系及肝癌组织中GRAMD4表达上调,且GRAMD4的表达上调与肝癌的恶性病理特征相关.     

NK细胞对不同人肝癌细胞株的杀伤作用

目的: 观察自然杀伤(NK)细胞对不同肝癌细胞株的体内外抑瘤作用,并检测肝癌细胞MHC-I类链相关蛋白(MIC蛋白)的表达。方法: 抽取志愿者外周血50 mL,分离单个核细胞,置入NK细胞试剂盒行孵化及逐级扩增。计算NK细胞对人白血病细胞株K562及人肝癌细胞株BEL7402、HepG2、SMMC7721的杀伤率。接种建立人肝癌细胞株裸鼠移植瘤,进行NK细胞瘤内及瘤周注射;计算各组裸鼠移植瘤的体积,绘制各组肿瘤生长曲线;处死裸鼠,称瘤重,计算NK细胞对各组肿瘤抑制率。检测人肝癌细胞表面 MIC蛋白表达。结果: NK细胞对K562细胞杀伤最强,BEL-7402次之,SMMC-7721细胞株杀伤敏感性最低。裸鼠抑瘤实验结果显示NK细胞对于BEL-7402细胞株的抑瘤效果最好,而对于SMMC-7721细胞株的抑瘤效果较差。BEL-7402及HepG2细胞株表面表达MIC,而SMMC-7721则很少表达。结论: NK细胞对于不同人肝癌细胞株体内外抑瘤作用不同,其差异可能和不同肝癌细胞株MIC的表达有关。     

体外培养的不同亚型肝癌细胞差异蛋白的初步筛查

目的分析体外培养的不同亚型肝癌细胞株蛋白质表达差异，筛选肝癌的标志蛋白。方法采用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片技术检测了两种肝癌细胞株(肝细胞癌，SMMC-7721和肝内胆管细胞癌，IHCCC-9810)以及正常肝细胞(L102)的蛋白质谱。选用阴离子交换柱处理上述细胞总蛋白，用6种不同pH的洗脱液洗脱柱床，通过改变洗脱液的pH值将总蛋白分成不同pI范围的6组。每个组分用WCX2和IMAC3两种芯片检测。采用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据，获得的数据采用Ciphergen公司的Proteinchip Software3．0．2软件分析。结果与L02细胞相比，有12个蛋白质在两种肝癌细胞株中均出现明显的变化，其中4个差异蛋白在肝癌细胞中高表达，8个差异蛋白在肝癌细胞中低表达。在对两种肝癌细胞株的蛋白质谱比较时发现，不同亚型的肝癌细胞有其各自的标志蛋白，其中11个蛋白分子在SMMC-7721细胞中高表达；在IHCCC-9810细胞中7个蛋白分子高表达，10个蛋白分子低表达。结论不同亚型肝癌细胞与正常肝细胞蛋白质谱比较时有共同的差异蛋白，同时不同亚型肝癌细胞之间的蛋白质谱表达也有差别。     

肝细胞提取物生物学活性研究

为深入研究肝细胞提取物的生物学活性,以正常人肝细胞株、肝癌细胞株、肝星状细胞株及原代培养的肝星状细胞为研究靶细胞,观察在不同浓度肝细胞提取物作用下,上述细胞的增殖活性(MTT法)、细胞凋亡活性、细胞外基质成分透明质酸(HA)产生水平及I型胶原基因启动子活性的影响,同时利用流式细胞术比较正常成人外周血单个核细胞(PBMC)在肝细胞提取物作用下,活性T淋巴细胞(CD4+/CD69+)的变化。结果发现肝细胞提取物对正常人肝细胞系(张氏肝细胞)具有明确刺激增殖作用,而对原代培养的肝星状细胞具有抑制增殖作用;肝星状细胞株HSC-T6的研究中,肝细胞提取物具有抑制其细胞外基质成分HA产生、抑制α1(I)型胶原基因启动转录的活性。60μg/ml的肝细胞提取物对肝癌细胞株Hep G2具有明确的诱导凋亡作用。正常成人PBMC经肝细胞提取物作用后活性T淋巴细胞(CD4+/CD69+)数量显著上升。研究表明,肝细胞提取物具有促进肝细胞再生、抑制肝纤维化发生和抗肿瘤作用,并首次发现具有免疫调节作用。     

用单克抗隆体检测肝癌的肿瘤相关抗原

目前用细胞融合技术已经制备出抗各种癌细胞的,肿瘤相关抗原的单克隆抗体。这些抗体主要用于:①血清免疫学诊断。②免疫组织学的细胞鉴定。③活体内的肿瘤影象显示。④癌症的免疫治疗等。本文介绍用单克隆抗体检测肝癌的肿瘤相关抗原的最新进展。 Carlson等(1985)用产生HBsAg的人类肝细胞癌株PLC/PRF/5作免疫原,制备了对人和鼠肝癌细胞株有反应的三种鼠型单克隆抗体。这些抗体与结肠癌细胞株有交叉反应,对人正常肝、胰、心、肾、骨骼肌、消化管,肺、脑、白细胞、红细胞和血小板无反应。其中,P215457与PM4E9917的对应抗原是人肝癌细胞株PLC/PRF/5和Mahlavu细胞膜并     

温化胶囊对人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的作用

目的研究温化胶囊对Bel-7402人肝癌细胞株凋亡的影响。方法对人肝癌细胞株Bel-7402进行体外细胞培养,分设阴性对照组、低剂量温化胶囊组(150μg/m L)及高剂量温化胶囊组(750μg/m L),每组设置5个平行实验。使用流式细胞仪分析温化胶囊对人肝癌细胞株Bel-7402凋亡的影响。结果与阴性对照组相比较,高剂量温化胶囊组能够提高Bel-7402细胞的凋亡率[(9.620±0.593)%vs(5.520±1.270)%],差异有统计学意义(P<0.05)。同时,高剂量温化胶囊组与阴性对照组相比,S期细胞比例[(31.92±2.19)%vs(24.90±1.16)%]增加(P<0.05)。结论温化胶囊具有诱导Bel-7402人肝癌细胞株凋亡的作用并引起细胞周期的改变。     

二乙基亚硝胺对大白鼠肝脏的影响——肝癌模型的建立及癌变过程

本实验采用口喂二乙基亚硝胺(DEN)诱发大白鼠肝癌,在肝癌模型建立过程中观察其癌变过程和肝癌组织的结构特点。1.口喂 DEN 诱发肝癌,在总剂量达96.1±1.61毫克至185±0毫克;致癌日期90±1.73天至195±0天时可使体重146±25.8克雄性大白鼠全部获得肝细胞肝癌。2.口喂 DEN 总剂量达96.1±1.61毫克,致癌日期90±1.73天可获得 A 型(嗜酸性)肝癌组织;总剂量达123±2.35毫克,致癌日数123±3.81天起可获得 B 型(嗜硷性)、A 型和 M 型(混合型)三型肝癌组织与肝癌的转移材料。3.采用 PAS 反应法,在显微镜下很易鉴别增生结节和肝癌结节,因前者呈强阳性而后者呈阴性。在某些增生结节与肝癌结节中均存在一些 PAS 反应呈弱阳性的肝细胞(或肝癌细胞)。4.肝细胞癌变过程中的特点是糖原下降最后消失,嗜硷性物质(核糖核酸)和去氧核糖核酸增加。     

抗经干扰素处理的SMMC7721肝癌细胞系单克隆抗体HAb23的制备

作者将经人α-干扰素处理的SMMC7721肝癌细胞系作为抗原免疫小鼠,通过细胞融合,筛选得到一株具有分泌一定特异性的抗肝癌单克隆抗休HAb23细胞株,经亚类鉴定HAb23为IgG1。HAb23细胞株性质稳定。在体外连续培养3个月均有抗体分泌。将冻存的HAb23细胞复苏,其克隆的阳性率保持100％。对30例肝细胞性肝癌及其它组织进行免疫组化染色,其中25例肝癌呈阳性,阳性率达83.3％,正常肝组织、肝炎、肝硬化组织均为阴性。     

肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的制备本课题组报告的肝癌相关抗原Kinectin的多克隆抗体,并鉴定其免疫学特性。方法以本课题组前期构建的人MBP-Kinectin融合片段重组质粒为基础,原核表达和亲和层析大量纯化MBP-Kinectin融合蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;用间接ELISA法测定抗体效价,用Western blot鉴定抗体的特异性。同时用Kinectin多克隆抗体检测Kinectin在正常成人肝细胞HL-7702和人肝癌细胞株SMMC-7721内的表达。结果通过免疫新西兰兔获得抗Kinectin抗体,ELISA测定纯化的Kinectin抗体效价最高为1∶12 800,Western blot结果显示Kinectin抗体具有较好的特异性。免疫细胞化学和western blot检测发现Kinectin蛋白在肝癌细胞株内的表达显著高于正常成人肝细胞株。结论制备的抗Kinectin抗体具有较高的效价和特异性,能满足Western blot和免疫细胞化学检测Kinectin蛋白的要求,为进一步深入研究Kinectin在肝癌发生发展中的作用奠定基础。     

肝癌相关的单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

目的:制备肝癌相关的单克隆抗体(mAb)用于肝癌的诊断。方法:用高转移肝癌细胞系HCCLM-6细胞免疫BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与Sp2/0融合建立杂交瘤细胞系。通过ELISA法筛选HCCLM-6细胞蛋白的特异性mAb,用免疫组化染色法筛查对肝癌组织阳性率高的mAb,并用免疫荧光方法鉴定其在不同肿瘤细胞系中的表达,最后通过筛选Uni-ZAP XR人肝细胞cDNA表达文库初步鉴定mAb识别的抗原及其表位。结果:建立了28株杂交瘤细胞株,用ELISA法和免疫组化染色法筛选出肝癌阳性率较高的mAbQGA062。通过人肝细胞cDNA表达文库筛选初步鉴定表明mAb QGA062识别的抗原是纤维连接蛋白(FN),经分析其抗原表位位于肽段YTVSLVAIKGNQESPK。结论:获得与肝癌相关的mAb QGA062,并鉴定了其识别的抗原和表位,为肝癌的诊断和FN参与肝癌转移的机制研究提供了重要的制剂。     

miR-483-5p通过上调IGF2基因转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭

目的:探讨miR-483-5p对人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因P3启动子驱动的m RNA(P3 m RNA)表达的影响及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:(1)采用real-time PCR检测人肝癌细胞株Huh7、Hep3B、Bel-7402、Hep G2和SMMC-7721,人正常肝细胞株HL-7702,83例人肝细胞癌组织和配对的癌旁组织,22例正常肝组织中miR-483-5p和P3 m RNA的表达水平,并应用Pearson相关分析评估P3 m RNA与miR-483-5p表达水平之间的关系。(2)将IGF2基因P3 m RNA的5’端非翻译区(5’UTR)克隆入p GL3启动子载体,构建P3 m RNA 5’UTR野生型(p GL3-P3-5’UTR-WT)及P3 m RNA 5’UTR突变型(p GL3-P3-5’UTR-MUT)重组萤光素酶报告质粒,将其分别与miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control共转染He La、293T及Huh7细胞,采用双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性。(3)分别将miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control转染Huh7及Hep3B肝癌细胞,应用real-time PCR检测这2种肝癌细胞P3 m RNA表达水平的变化。(4)应用real-time PCR检测肝癌细胞Huh7及Hep3B的细胞核和细胞质中miR-483-5p的表达水平;应用核连缀实验(nuclear run-on assay)分析miR-483-5p对P3 m RNA转录的影响;应用RNA稳定性实验分析miR-483-5p对P3 m RNA稳定性影响。(5)应用体外细胞功能实验研究miR-483-5p对Huh7肝癌细胞生长、凋亡、迁移与侵袭能力的影响。结果:(1)5种肝癌细胞株miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于正常肝细胞株HL-7702(P0.01),肝细胞癌组织中miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于配对的癌旁组织及正常肝组织(P0.01);线性相关分析显示,在5种肝癌细胞株及肝细胞癌组织中,P3 m RNA表达水平均与miR-483-5p水平呈正相关。(2)萤光素酶实验显示,miR-483-5p与P3m RNA 5’UTR的同源位点互补结合可促进P3 m RNA的表达。(3)瞬时转染实验显示,过表达miR-483-5p呈剂量依赖性促进Hep3B和Huh7肝癌细胞P3 m RNA表达水平的增高。(4)miR-483-5p表达实验显示,成熟miR-483-5p存在于肝癌细胞Hep3B和Huh7的细胞质和细胞核中;核连缀实验显示,miR-483-5p诱导Huh7肝癌细胞核中新生P3 m RNA转录;RNA稳定性实验表明,miR-483-5p不改变Huh7肝癌细胞P3 m RNA稳定性。(5)体外细胞功能实验显示,miR-483-5p促进Huh7肝癌细胞增殖,抑制其凋亡,并增强迁移与侵袭能力。结论:miR-483-5p高表达可部分通过上调IGF2基因P3 m RNA转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭,进而参与肝细胞癌发生。     

人肝肿瘤细胞选择性白细胞介素-7剪接变异体cDNA的克隆和序列测定

目的:寻找人肝肿瘤细胞选择性的白细胞介素-7(IL-7)剪接变异体。方法:运用自行设计的IL-7引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,分离正常肝组织、原发肝癌组织、培养肝癌细胞株IL-7mRNA,再对电泳所获条带进行克隆、测序。结果:正常肝组织、原发肝癌组织、培养肝癌细胞株(BEL-7402和SMMC-7721)都能检测到IL-7mRNA,而且从肝癌组织、培养肝癌细胞株分离出1条新带,经亚克隆及测序,证实该条带系人IL-7基因cDNA第4外显子缺乏所致。结论:肝癌组织及培养的肝癌细胞株存在选择性IL-7剪接变异体。该变异体的发现,为肝癌病人的免疫调节紊乱以及肝癌病人的临床免疫治疗提供了新的研究方向。