隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究

目的了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况,并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法. 方法采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板,利用微小隐孢子虫18S rRNA 的基因序列设计特异性引物（446bp）进行多聚酶链反应扩增,扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析. 结果从78 份样品中检出4份特异性条带样品.限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同.重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%. 结论建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法.     

当归补血汤多糖对隐孢子虫感染小鼠肠道局部免疫功能的影响

目的：探讨当归补血汤多糖对免疫低下小鼠感染隐孢子虫后的免疫调节作用。方法：用微小隐孢子虫卵囊（CSO）感染免疫抑制BALB／c小鼠,建立隐孢子虫感染的动物模型,再给该模型小鼠灌服当归补血汤多糖8天后,ELISA法检测小鼠肠道局部IL-2、IL-4及SIgA的水平,HE染色检查肠道病理学改变。同时设模型组和正常组作对照。结果：当归补血汤多糖能促进隐孢子虫感染小鼠肠道IL-2、IL-4、SIgA的分泌;肠道粘膜病理改变明显好转。结论：当归补血汤多糖对小鼠隐孢子虫感染具有免疫增强作用。     

从少量人源粪便中分离隐孢子虫用于全基因组测序的研究

目的 直接从少量人源粪便样本中分离、纯化隐孢子虫卵囊,提取并扩增DNA,使其浓度和纯度符合全基因组测序（WGS）要求。方法 2013年12月-2014年10月收集来自美国佛罗里达州、爱达荷州和缅因州11份少量人源隐孢子虫粪便样本,每份200 mg,使用免疫磁珠分离（IMS）进行纯化卵囊;2014年8-12月收集来自美国农业部52份牛源隐孢子虫粪便样本作为对照,每份2 000 mg,采用饱和蔗糖、氯化铯密度梯度离心法和IMS等方法纯化卵囊。均使用QIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI试剂盒进行全基因组扩增（WGA）;最后通过定量PCR(qPCR)对WGA产物进行评估。结果 11份人源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为68.00～257.80 ng/μL。qPCR对隐孢子虫小亚基rRNA基因（SSU rRNA）扩增显示,11个分离株的循环数阈值（Ct）范围为8.92～19.23, Ct值越小表明隐孢子虫基因组DNA浓度越高;其中有6个分离株Ct <15,54.54%的分离株满足WGS要求。52份牛源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为27.2...     

小鼠隐孢子虫感染动物模型的建立

目的：建立稳定的隐孢子虫（CPS）感染小鼠动物模型,为其防治研究奠定基础。方法：经口灌服醋酸地塞米松（DEX）抑制BALB/C小鼠免疫功能,7d后经口灌服CSO感染小鼠。结果：使用三组不同剂量的DEX免疫抑制小鼠都能感染隐孢子虫,DEX（6mg/kg）免疫抑制组的小鼠死亡率比其它组高,DEX（4mg/kg）免疫抑制组收集的卵囊数比其它组的多。小肠组织学及超微结构变化小肠粘膜有虫体定植,肠绒毛出现病理损伤。结论：采用DEX（4mg/kg）免疫抑制小鼠后接种CSO,可以的建立较稳定CPS感染模型。     

隐孢子虫病实验与临床研究——Ⅱ.不同动物隐孢子虫感染观察

BALb/c小鼠66只、Wistar大鼠38只、豚鼠10只和家兔6只分别给予皮下注射醋酸可的松,每周2只.连续给药3周后开始用金胺—酚染色、改良耐酸染色和沙黄—美蓝染色法检查动物粪便中隐孢子虫卵囊.小鼠隐孢子虫卵囊阳性率为71.21%(47/66);大鼠则为34.21%(13/38).小鼠粪便中卵囊数量明显多于大鼠.小鼠粪便中隐孢子虫卵囊可分为大型囊(7.47μ×5.90μ)和小型囊(4.6μ×4.33μ)两种.豚鼠与家兔均未能检出隐孢子虫卵囊.小鼠口服或皮下注射地塞米松均未能诱发隐孢子虫感染.提示小鼠皮下注射醋酸可的松可能是一种较好的建立隐孢子虫感染动物模型的方法     

微小隐孢子虫子孢子表面糖蛋白gp23基因的克隆和序列分析

目的对微小隐孢子虫子孢子表面蛋白gp23编码区基因进行克隆并对其氨基酸的变异性进行分析。方法提取人源微小隐孢子虫卵囊基因组DNA,采用PCR方法扩增gp23基因,将其克隆到pMD18-T载体,经测序鉴定正确后进行序列分析。结果获得了一个具有完整ORF的表面蛋白gp23基因(HC23),与国内(BC23)及GenBank报道的gp23(序列号为AF306847)比较,氨基酸同源性分别为96.46%和94.69%。结论本研究获得的隐孢子虫gp23基因与国内外报道的序列相对保守。为下一步研究Gp23蛋白功能及其在微小隐孢子虫侵入靶细胞中的作用以及研制疫苗奠定了基础。     

HIV感染者合并隐孢子虫的基因分型调查

目的了解河池市HIV感染者的隐孢子虫感染情况。方法收集258例HIV感染者的粪便样本,采用基于18S rRNA基因的巢式PCR方法进行检测。对巢氏PCR产物进行测序,同源性比对,明确基因型。结果河池市HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为2.33%(6/258),伴有慢性腹泻的HIV感染者合并隐孢子虫的感染率为6.98%(6/86),虫株基因鉴定为安氏隐孢子虫和人隐孢子虫。结论河池市HIV感染者存在隐孢子虫合并感染,需明确其流行特点,有待进一步调查。     

隐孢子虫感染动物排卵囊规律的研究

用牛粪中隐孢子虫卵囊感染小鼠和豚鼠，人粪中虫体卵囊感染犬，３种动物隐孢子虫感染模型均获成功。感染后７－１０ｄ粪便中卵囊增至一高峰值，此后数量逐渐减少；小鼠４周后、犬６周后，豚鼠７周粪便中卵囊全部转阴。临床病例采用检验粪便中卵囊转阴指标来评价某药物疗效，尚须进一步探讨。     

PCR技术检测RH株弓形虫组织内感染的实验研究

目的：建立敏感，特异的聚合酶链反应（PCR），以检测组织内弓形虫感染。方法：优化PCR反应关键步骤的条件。以相同的B1引物扩增相近的病原体判断其特异性，扩增倍比稀释的DNA检测其灵敏度，并以PCR法检测实验鼠肝，血中DNA的动态变化。结果与免疫组化法进行比较。评价其检测生物学样本的可行性。结果：实验建立的PCR技术的灵敏度能达到检测出一个虫体的DNA，且特异性强，不扩增鼠DNA，人DNA，隐孢子虫，卡氏肺孢子虫，鼠疟原虫的DNA，检测实验感染小鼠血，肝脏样本，在感染后2天，3只鼠血样本PCR结果阳性，3只小鼠肝标本2只阳性；感染后3天至濒死前后有小鼠检测结果均阳性；血样本阳性检出率100%（11/11），肝脏组织样本阳性检出率81.8%(9/11)。结论：PCR方法是一种敏感，特异快速的诊断方法，可用于诊断血和肝脏组织内的弓形虫。