血管内皮生长因子基因治疗小型猪冠状动脉闭塞的实验研究

目的探讨应用血管内皮生长因子(VEGF)基因治疗动物实验性冠状动脉闭塞的疗效.方法中国实验用小型猪19只,结扎左冠状动脉前降支中远段,心肌内多点注射自行构建的pcD2/hVEGF121真核表达质粒.应用逆转录聚合酶链反应、VEGF免疫组化染色、Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色等方法检测VEGF基因在心肌中的表达及其生物学作用,用常规冠状动脉造影观察VEGF基因治疗对闭塞冠脉侧支循环建立的作用.结果转移VEGF基因后,小型猪心肌内VEGF mRNA高表达,VEGF免疫组化染色提示VEGF蛋白表达水平升高;Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色显示心肌毛细血管增加;冠状动脉造影证明VEGF基因治疗能够促进闭塞冠脉侧支循环的建立.结论心肌内注射pcD2/hVEGF121真核表达质粒能够获得VEGF mRNA和蛋白的有效表达,促进心肌毛细血管增生,促进侧支循环建立.     

血管内皮生长因子与心肌缺血

血管内皮生长因子（VEGF）是内皮细胞特异性的促有丝分裂原,属分泌性的糖蛋白。有促进内皮细胞增生,增强血管通透性;加速新血管形成的作用。VEGF通过与其特异性受体结合发挥生物学作用。VEGF在生理和病理状态下新生血管形成中起重要作用。VEGF及其受体在缺血和／或缺 氧的 心肌细胞中表达升高。VEGF蛋白应用于心肌缺血可以通过促进缺血区新生血管形成,提高侧枝血流量而改善心功能。VEGF基因治疗心肌缺血具有广阔应用前景。     

心肌缺血时血管内皮生长因子的基因表达

目的：研究缺血对心肌血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）基因表达的影响。方法：提取正常兔（ｎ＝２）、假手术兔（ｎ＝２）及冠状动脉左旋支结扎后不同缺血时间的兔（ｎ＝６）心肌总核糖核酸（ＲＮＡ），用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ＶＥＧＦ信使核糖核酸（ＶＥＧＦｍＲＮＡ）的表达。结果：正常及缺血兔心肌中均有３．９ｋｂ的ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达，但缺血心肌中表达明显高于正常心肌，心肌缺血３０分钟ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达即已明显增高，并持续增高达４小时。结论：兔心肌中有ＶＥＧＦ基因的基础表达，缺血可致其表达增加。关键词血管内皮生长因子心肌缺血信使核糖核酸表达     

血管内皮生长因子与血管形成作用研究进展

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）因其特异性的促血管形成作用而成为近年的研究热点。它在缺血性疾病的治疗、肿瘤防治、创伤愈合等方面均参与血管形成，并起关键性作用．被誉为最有希望的候选基因治疗之一。本文对VEGF的血管形成作用研究进展综述如下。     

缺血心肌更新供血的前景—血管内皮生长因子基因治疗

血管内皮生长因子能促进侧枝循环的建立已被大量动物实验所证实。ＶＥＧＦ基因治疗已开始在临床试用，有望取代部分搭桥和冠脉成形术，成为缺血心肌更新供血的新途径。     

骨髓基质细胞结合血管内皮生长因子基因治疗猪慢性心肌缺血的疗效

目的：探讨骨髓基质细胞（BMSCs）结合血管内皮生长因子（VEGF）基因心内膜注射治疗猪慢性心肌缺血模型的疗效。方法：建立猪心肌梗塞模型．胸骨穿刺抽取骨髓,分离培养BMSCs,将VEGF165基因转染到BMSCs中．4周后进行左室心内膜电机械标测并行心内膜注射等操作,按照注射成分不同分为3组．联合组（n=8）注射转染VEGF。基因的BMSCs,细胞组（n=8）注射BMSCs,对照组（n=6）注射生理盐水。于细胞移植后4周分别进行左室心内膜电机械标测、选择性冠脉造影及超声心动图检查。结果：术后4周时联合组较细胞组及对照组的心梗面积明显缩小．侧支循环、心脏泵血功能以及心肌收缩力改善更加明显（P〈0．05～〈0．01）。结论：自体BMSCs结合VEGF165基因治疗心肌梗塞效果显著。     

重组腺相关病毒2型载体-血管内皮生长因子165改善小型猪慢性心肌缺血的研究

目的应用重组腺相关病毒2型载体(recombinant adenovirus-associated virus2,rAAV2)介导血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor,VEGF165)基因转染,观察其促进小型猪慢性缺血心肌血管生成并改善心肌血流灌注和心功能的有效性。方法小型猪左冠状动脉回旋支(LCX)放置血管缩窄环,建立慢性心肌缺血模型。5周后行心电图、冠状动脉造影和心脏核磁共振成像检查确认LCX闭塞或相应心肌的缺血。动物随机分为实验组和对照组,每组8只,分别在心肌内直接注射rAAV2-VEGF165(1×1012virus genome)或磷酸盐缓冲液。治疗后3个月和6个月,观察心肌VEGF mRNA和蛋白的表达;6个月后,观察心肌毛细血管和小动脉密度,行冠状动脉造影进行LCX血流分级,应用心脏核磁共振成像观察心肌灌注及左心室功能。结果放置血管缩窄环后5周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞或LCX支配区域的心肌缺血。基因治疗后3个月,实验组心肌VEGF mRNA和蛋白表达显著高于对照组;6个月时,实验组VEGF表达水平较3个月时下降。基因治疗后6个月,VEGF组心肌毛细血管密度和小动脉密度[分别为(1404.06±250.48)/mm2和(167.81±36.29)/mm2]均高于对照组[分别为(976.88±344.79)/mm2和(116.56±34.48)/mm2](P<0.05);潘生丁负荷后心肌灌注成像显示VEGF组心肌灌注明显优于对照组(P<0.05),且较治疗前有改善(P<0.05);两组左心室功能在治疗前后均无明显变化。结论在小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2-VEGF165后外源VEGF基因的表达至少可持续3个月;rAAV2-VEGF165能够促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成并改善心肌灌注。     

心肌内注射腺病毒介导血管内皮生长因子基因的血管生成实验研究

目的探讨血管内皮生长因子165(VEGF165)基因的血管生成作用. 方法在猪冠状动脉回旋支起始处放置Ameroid闭合器,制备慢性心肌缺血模型,28 d时行选择性冠状动脉造影,观察回旋支狭窄程度.开胸,治疗组(6只)在缺血区心肌内多点注射含人VEGF165基因的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165);对照组(6只)在缺血区心肌内多点注射含细菌半乳糖苷酶基因的重组腺病毒载体(Ad-β-gal).转染重组腺病毒载体28 d时重复行冠状动脉造影后,处死猪,取缺血区心肌,做组织学检查;应用酶标法检测血浆中VEGF浓度,采用Rentrop分级、缺血区心肌侧支血管积分和心肌碱性磷酸酶染色法评价血管生成作用. 结果与对照组比较,基因转染3 d时治疗组血浆VEGF增高[(114.6±5.4)pg/ml对(60.3±1.8)pg/ml,P<0.001],7 d时血浆VEGF为(128.4±3.0)pg/ml对(70.9±5.3)pg/ml,P<0.001,14 d后恢复到基线水平.与对照组比较,基因转染28 d时治疗组Rentrop分级增高(2.8±0.4对1.3±0.8,P<0.001),侧支血管积分增高(4.8±0.8对1.7±0.8,P<0.001),缺血区毛细血管密度增高(210±19对62±6,P<0.001). 结论心肌转染Ad-VEGF165后,缺血心肌表达VEGF,产生了血管生成作用.     

人血管内皮生长因子裸质粒DNA心肌注射促进缺血心肌侧支循环形成的研究

目的 :观察人血管内皮生长因子 (h VEGF)裸质粒 DNA直接心肌注射对大鼠急性心肌缺血后侧支循环形成的影响。方法 :建立大鼠左冠状动脉结扎的急性心肌缺血模型 ,取缺血边缘区以先期构建的真核表达质粒 pc DNA3/ h VEGF1 6 5和真核载体 pc DNA3的 DNA分别多点心肌注射。给药后 4周先行大鼠冠状动脉造影 ,再取材分别行苏木精 -伊红染色、平滑肌肌动蛋白 (SMA)染色和 Northern Blot分析。结果 :给药后 4周冠状动脉造影示治疗组左室造影剂聚集较对照组明显增加 ;SMA染色示治疗组新生血管数目明显多于对照组 ;Northern Blot分析显示治疗组 VEGF m RNA表达较对照组明显增强。结论 :pc DNA3/ h V EGF1 6 5裸质粒 DNA心肌注射能转染心肌细胞并持续表达至少 4周 ,促进了缺血心肌血管新生和侧支循环形成     

心肌注射血管内皮生长因子基因治疗冠心病的方法学

采用心肌注射血管内皮生成因子(VEGF)$因治疗晚期冠心病的Ⅰ期临床试验结果表明，大多数患者心绞痛明显缓解，冠状动脉造影有新的侧枝血管形成。本文介绍心肌注射VEGF基因治疗冠心病的方法学。     

直接心肌植入VEGF_(165)基因的实验研究

目的 :评估VEGF1 6 5基因直接心肌内注射促进心肌血运重建的疗效。方法 :中国实验小型猪 11只 ,体重 (2 9 3± 4 3)kg。在左冠状动脉回旋支 (LCX)近心端放置Ameroid收缩环。术后 6周行冠脉造影示LCX狭窄 >95 %为慢性心肌缺血模型形成。将选用模型随机分为治疗组 (n =6 )和对照组 (n =5 )。治疗组将VEGF1 6 5质粒注射到左室侧壁 10处有标记的心肌中层。对照组只注射空白质粒。治疗前和治疗 6周后 ,采用体表超声心动图观察静息与小剂量多巴酚丁胺负荷 (LDDSE)状态下左心室壁运动及功能 (LVEF、RT、MVCF、WMSI) ,通过2 0 1 TI SPECT观察心肌灌注改变。处死动物后进行心肌血管密度和VEGF基因mRNA表达测定。结果 :治疗 6周后 ,在静息与LDDSE(10 μg min kg)状态下 ,A组RT和WMSI较治疗前显著改善 ,侧壁灌注缺损明显缩小 ,B组改善不明显。A组每个视野的血管面积、血管周长及血管数目均较B组多。A组 2 3例局部心肌VEGF基因mRNA的表达明显 ,B组 3 3例均无表达。结论 :直接心肌内注射VEGF1 6 5基因可促进慢性缺血心肌的血管再生 ,改善局部心肌灌注和室壁运动。     

Lower-extremity edema associated with gene transfer of naked DNA encoding vascular endothelial growth factor

BACKGROUND: Vascular endothelial growth factor (VEGF) promotes angiogenesis and vascular permeability. The extent to which VEGF may cause tissue edema in humans has not been established. OBJECTIVE: To evaluate patients undergoing VEGF gene transfer for evidence of lower-extremity edema. DESIGN: Prospective consecutive case series. SETTING: Hospital outpatient clinic. PATIENTS: 62 patients with critical limb ischemia and 28 patients with claudication. INTERVENTION: Gene transfer of VEGF DNA. MEASUREMENTS: Semiquantitative analysis of lower-extremity edema. RESULTS: Lower-extremity edema was observed in 31 of 90 (34%) patients. Edema was less common in patients with claudication than in those with pain at rest (P = 0.016) or ischemic ulcers (P < 0.001), and it was less common in patients with pain at rest than in those with ischemic ulcers (P= 0.017). Treatment was typically limited to a brief course of oral diuretics. CONCLUSIONS: Vascular endothelial growth factor may enhance vascular permeability in humans. At the doses of plasmid DNA used in this study, lower-extremity edema responded to oral diuretic therapy and did not seem to be associated with serious sequelae.     

Electromagnetic guidance for catheter-based transendocardial injection: a platform for intramyocardial angiogenesis therapy. Results in normal and ischemic porcine models

OBJECTIVES: To test the feasibility of myocardial angiogenic gene expression using a novel catheter-based transendocardial injection system. BACKGROUND: Angiogenesis has been induced by direct injection of growth factors into ischemic myocardium during open-heart surgery. Catheter-based transendocardial injection of angiogenic factors may provide equivalent benefit without need of surgery. METHODS: A new guidance system for intramyocardial therapy utilizes magnetic fields and catheter-tip sensors to locate a position in space and reconstruct three-dimensional left ventricular (LV) electromechanical maps without using fluoroscopy. A retractable 27G needle was coupled with the guidance system for LV transendocardial injection. In 12 pigs, the catheter was used to inject 0.1 ml of methylene-blue (MB) dye and 8 pigs had myocardial injections of adenoviral vector (1 x 10(10) particles per site) containing the LacZ transgene. Ten pigs underwent catheter-based transendocardial injection and six pigs were injected using transepicardial approach with the gene encoding adenovirus vascular endothelial growth factor-121 (Ad.VEGF121; 1 x 10(10) viral particles x 6 sites) and sacrificed at 24 h. Injection sites were identified with ultraviolet light by coinjection of fluorescent beads. RESULTS: Overall, 138 of 152 attempted injection MB tracks (91%) were found after sacrifice. Tissue staining was 7.1+/-2.1 mm in depth and 2.3+/-1.8 mm in width. No animal had pericardial effusion or tamponade. In Ad.LacZ injected animals, gross pathology showed positive staining in injected zones, and histology confirmed positive myocyte staining. Adenovirus vascular endothelial growth factor-121 injected sites showed high levels of VEGF121 production that was of similar magnitude whether injected using the transendocardial (880.4+/-412.2 pg VEGF121/mg protein) or transepicardial (838.3+/-270 pg VEGF121/mg protein) delivery approach (p = 0.62). CONCLUSIONS: Using this magnetic guidance catheter-based navigational system, transgenes can effectively be transfected into designated myocardial sites. Thus, if it is determined that direct intramyocardial injection of angiogenic factors enhances collateral function in patients, this less invasive catheter-based system offers a similar gene delivery efficiency and, thus, may have clear advantages compared with the surgically-based transepicardial injection approach.     

犬心肌中血管内皮细胞生长因子的表达

目的　观察血管内皮细胞生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因和蛋白质在犬心肌中的表达。方法　在犬冠状动脉左前降支放置Ameriod缩窄环制作慢性缺血心肌模型 ,缺血 3周后运用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)技术检测各部位心肌VEGF信使核糖核酸变异体 (VEGFmRNAisoform) ,并行计算机吸光度扫描计算其构成比 ;采用免疫组织化学ABC法观察心肌中VEGF蛋白质的定位。结果　在犬心肌正常供血区、缺血边缘区及缺血区均有 3种VEGFmRNA变异体的表达 ,其构成比分别是VEGF1 88为 5 3% ,VEGF1 64 为 44 %和VEGF1 2 0 为 3% ;心肌VEGF蛋白质主要定位于血管平滑肌细胞。结论　犬心肌中有 3种VEGFmRNA变异体的基础表达 ,缺血并不能改变VEGF基因的剪接转录方式 ;VEGF以旁分泌的方式调节血管内皮细胞的功能状态。     

VEGF基因表达载体的构建及其表达

为构建血管内皮生长因子(VEGF)基因的表达载体,以人胎肝cDNA库为模板,应用多聚酶链反应(PCR)技术,扩增全长的VEGF165cDNA序列,定向连接进质粒pcDNA3.1/Zeo( )的多克隆位点中,以重组质粒转染体外培养的293细胞,收集不同时相细胞裂解液进行蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳,以抗人VEGF165单克隆抗体行Westen blotting检测,观察VEGF基因的表达情况。结果显示选择合适的退火温度和引物,可以自人胎肝cDNA库中特异性地扩增VEGF165的cDNA序列。所构建的pcDNA3.1/Zeo( )-VEGF165真核表达载体系统能较好地转染体外培养的293细胞,Westen blotting检测到特异性表达条带。提示重组的VEGF165基因表达载体能够成功转染哺乳动物细胞,并表达目的基因,为解决组织移植中血运重建问题提供了一条基因治疗途径。     

血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植促进缺血心肌血管生成的研究

目的研究血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)移植对缺血心肌的血管生成作用。方法于2004年5月至2005年8月取第四军医大学西京医院分离、培养Wistar大鼠的MSCs,用真核表达载体pcDNA3.1(-)/hVEGF165转染MSCs。45只近交系Wistar大鼠随机均分为转染组(MSCs/VEGF组)、对照组(MSCs组)、无血清培养基组(DMEM组),结扎前降支建立急性心肌梗死模型后在梗死区边缘区行5×106细胞移植,DMEM组行等量培养基注射。细胞移植前行CM-DiI标记。移植1个月后行心脏B超测量射血分数值,组织化学染色评价新生血管密度。结果培养的MSCs呈典型贴壁生长成纤维样外观,pcDNA3.1(-)/hVEGF165能有效转染大鼠MSCs,移植1个月后MSCs/VEGF组较其余各组左室射血分数(LVEF),再生血管密度明显增加,差异均有显著性(P<0.01)。结论VEGF基因转染MSCs移植能显著促进缺血心肌血管再生,进而改善心脏功能。