Ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞的作用

目的:探讨ghrelin对大鼠心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)增殖、迁移能力和分泌NO的影响。方法:以酶消化法获得SD大鼠的CMECs,采用Dil-ac-LDL吞噬试验鉴定CMECs。将新一代CMECs分5组分别干预24 h:即(A)空白对照组、(B)1×10-9mol/L ghrelin组、(C)1×10-8mol/L ghrelin组、(D)1×10-7mol/L ghrelin组和(E)ghrelin+拮抗剂LY294002组(1×10-7mol/L ghrelin和20μmol/L LY294002)。用MTT比色法检测ghrelin对CMECs增殖的影响;以transwell法检测ghrelin对CMECs迁移的影响。用硝酸还原法检测CMECs分泌NO的量。结果:Dil-ac-LDL吞噬试验表明,90%以上的CMECs表达Dil-ac-LDL。与对照组相比,10-8~10-7mol/L的ghrelin可明显促进CMECs增殖和迁移,以及NO分泌(P0.05);LY294002则能够明显抑制ghrelin对CMECs的促增殖和迁移作用,以及抑制ghrelin刺激CMECs分泌NO的作用(P0.05)。结论:一定浓度条件下,ghrelin能够促进心肌微血管内皮细胞(CMEC)的增殖、迁移和NO分泌,这可能与激活AKT/PI3K信号转导通路有关。     

Ghrelin对同型半胱氨酸诱导大鼠心肌微血管内皮细胞损伤和炎性反应的保护作用

目的探讨Ghrelin对同型半胱氨酸(Hcy)诱导大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)损伤和炎性反应的保护作用及作用机制。方法取雄性SD大鼠心肌细胞培养鉴定后,分别以不同浓度的Hcy、不同浓度Ghrelin孵育24 h,采用MTT法检测细胞活力。另选细胞随机分为对照组、Hcy组(0.25 mmol/L)、Ghrelin组(100 ng/L)和混合组,Hoechst染色计算细胞凋亡率,NO试剂盒检测NO的分泌活性,ELISA检测白细胞介素6(IL-6)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)的分泌,免疫印迹法检测NF-κB蛋白的表达。结果不同浓度Hcy细胞活性较不同浓度Ghrelin明显降低(P0.05,P0.01)。与对照组比较,Hcy组NO的分泌活性显著降低,细胞凋亡率显著上升,IL-6和ICAM-1的分泌显著增加,NF-κB的表达显著增加,差异有统计学意义(P0.05,P0.01)。与Hcy组比较,混合组可以明显抑制上述指标(P0.05)。结论 Hcy可诱发大鼠CMECs的损伤和炎性反应,而Ghrelin预处理对Hcy诱导的损伤及炎性反应有明显的抑制作用,其保护作用机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

不同剂量阿司匹林对大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响

目的探讨不同剂量阿司匹林对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)血管新生功能的影响。方法 4周龄雄性SPF级SD大鼠,处死后分离右心室,提取原代心肌微血管内皮细胞进行培养,依据阿司匹林浓度不同分为对照组、实验组(1、10、100、1 000、5 000μmol/L),分别检测其对CMECs的增殖能力、细胞迁移能力和纤维连接蛋白(FN)水平的影响。结果培养48 h后,阿司匹林1、10、100μmol/L组与对照组比较细胞量和凋亡指数(AI)值均无统计学意义(P0.05),仅浓度为1 000和5 000μmol/L组与对照组比较细胞量和AI值差异显著(P0.05);划痕实验显示1、10、100μmol/L阿司匹林组的划痕间距均显著小于对照组,10、100μmol/L阿司匹林组的Transwell迁移数显著高于对照组,10、100μmol/L阿司匹林组的成管个数显著高于对照组,5 000μmol/L阿司匹林组的成管个数显著低于对照组(P0.05),其余组的相应指标与对照组无统计学意义(P0.05);FN的分析结果显示除1μmol/L阿司匹林组外其余浓度组均显著高于对照组(P0.05)。结论阿司匹林对CMECs作用低浓度时表现为促进细胞增殖和迁移作用,并能显著诱导FN分泌;高浓度时表现为抑制增殖和迁移作用,但是对FN的分泌具有促进作用。     

阿托伐他汀对同型半胱氨酸所诱导内皮祖细胞功能损伤的保护作用

目的:探讨同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导小鼠骨髓内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)功能损伤的氧化应激机制及阿托伐他汀的拮抗作用。方法:密度梯度离心法获取小鼠骨髓单个核细胞,培养7 d后收集贴壁细胞,FITC-UEA-1荧光染色鉴定EPCs。EPCs与不同浓度Hcy(0μmol/L,50μmol/L,500μmol/L)共孵育24 h或分别经不同浓度的阿托伐他汀(0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)预孵育0.5 h后,再加入500μmol/LHcy共孵育24 h。用MTT比色法,改良Boyden小室、黏附能力测定和体外血管生成试剂盒,分别观察EPCs的增殖能力、迁移能力、黏附能力和体外血管生成能力。荧光探针H2DCF-DA法检测细胞内活性氧水平,光泽精化学发光法检测NADPH氧化酶活性,硝酸还原酶法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)含量,RT-PCR法测定eNOS基因表达。结果:Hcy诱导EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成功能下降,活性氧的产生及NADPH氧化酶的活性增加,eNOS基因表达及细胞培养液中NO含量减少,与无Hcy处理组相比有明显差异(P0.05或P0.01)。与500μmol/L Hcy组相比,阿托伐他汀预处理可呈剂量依赖性地拮抗Hcy诱导的上述改变(P0.05或P0.01)。结论:Hcy可能通过激活NADPH氧化酶,诱导EPCs活性氧的产生及降低eNOS基因表达和NO水平,导致EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成功能下降。阿托伐他汀部分拮抗Hcy的作用。     

基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的研究

目的基于细胞自噬机制探讨祛风生脉颗粒保护血管内皮的干预效应。方法将缺血心肌微血管内皮细胞(CMECs)分为4组:缺血(QX)组、缺血+雷帕霉素(QX+RAPA)组、缺血+3-甲基腺嘌呤(QX+3-MA)组、缺血+祛风生脉颗粒含药血清(QX+QF)组;另设正常CMECs,作为正常(ZC)组。其中ZC组和QX组给予常规培养基培养,QX+RAPA组和QX+3-MA组在常规培养基基础上分别加入雷帕霉素和3-甲基腺嘌呤,QX+QF组给予祛风生脉颗粒大鼠含药血清与缺血CMECs共孵育。电镜观察各组细胞自噬小体及超微结构变化,Western-blot分析微管相关蛋白Ⅰ轻链3(LC3)-Ⅱ/Ⅰ比值;Annexin V-FITC和PI双标记法测定细胞凋亡,酶联免疫吸附法测定细胞培养液中一氧化氮(NO)与内皮素-1(ET-1)含量。结果 QX组在电镜下观察到有自噬小体形成,与ZC组相比,QX组LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率增加(P0.05),NO水平升高,ET-1水平升高(P0.01);与QX组相比,QX+RAPA组自噬小体数目有所增多,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值升高,细胞总凋亡率减少,NO水平下降(P0.05),ET-1水平有所降低,差异无统计学意义(P0.05);与QX组相比,QX+3-MA组自噬小体数目减少,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值降低,细胞总凋亡率增加,NO水平升高,ET-1水平升高(P0.05);与QX组相比,QX+QF组电镜下观察到自噬小体数目明显增多,同时观察到较多的自噬溶酶体,LC3–Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,细胞总凋亡率明显减少,NO水平明显降低,ET-1水平降低(P0.01)。结论缺血能够诱导CMECs发生自噬,细胞凋亡增加,血管内皮功能受到损伤,祛风生脉颗粒干预后能够明显减少凋亡,改善CMECs功能,其机制可能与促进缺血CMECs自噬有关。     

阿司匹林对心肌微血管内皮细胞血管新生功能的影响

目的:探讨不同剂量阿司匹林对大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）血管新生功能的影响和可能的机制。方法:消化法分离大鼠CMECs，用不同浓度（1、10、100、1 000和5 000 μmol/L）的阿司匹林处理体外培养的大鼠CMECs后，分别用CCK-8比色法检测细胞增殖、TUNEL法检测细胞凋亡、划痕试验及Transwell小室评价细胞迁移能力、成管实验评价血管新生能力、Western blot法检测蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平，ELISA法测定纤维连接蛋白（FN）表达。结果: ①1、10和100 μmol/L的阿司匹林对，CMECs的增殖、凋亡和AKT磷酸化水平无明显影响，1000、5000μmol/L的阿司匹林对组显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、诱导细胞凋亡；②10、100 μmol/L的阿司匹林促进CMECs迁移、成管；③FN表达随阿司匹林浓度升高而升高。结论:①低浓度阿司匹林（1~100μmol/L）对CMECs的存活无明显影响，而高浓度的阿司匹林（1 000、5 000 μmol/L）显著抑制CMECs增殖、下调AKT磷酸化水平、细胞凋亡增多。②低浓度阿司匹林（1~100 μmol/L）作用下，阿司匹林促进CMECs迁移、成管能力，可能与阿司匹林作为环氧化酶（COX）抑制剂，减少前列环素（PGI2）生成引起FN表达上调有关。     

AGEs对心肌微血管内皮细胞血管新生和管腔形成的影响

目的: 观察糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）对心肌微血管内皮细胞(cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)增殖能力、迁移能力,以及血管新生和管腔形成的作用和影响。方法: 以不同浓度（100、200和400 mg/L）的AGEs作用于CMECs 48 h,分别采用MTT比色法检测细胞的增殖能力;用Transwell法检测细胞的迁移能力;用毛细血管管腔结构形成试验检测AGEs对血管新生的影响。结果: CMECs在以不同浓度（100、200及400 mg/L）的AGEs作用48 h后,MTT比色法检测显示,吸光值（分别为0.1195±0.0049、0.1422±0.0058及0.1783±0.0220）明显高于对照组（0.0955±0.0161,P<0.05,P<0.01）;Transwell法检测细胞数［分别为(24.89±6.234)、(32.89±6.990)及(55.56±10.27)个］均高于对照组［（13.89±4.622）个,P<0.05,P<0.01］;管样结构的长度［分别为(3.261±0.7016)、(4.737±1.129)及(6.687±1.308)mm/mm2］均高于对照组［(2.089±0.6723)mm/mm2,P<0.05,P<0.01］。结论: AGEs可以促进CMECs血管新生和管腔结构的形成,且与其浓度呈正相关。     

高尿酸对血管内皮细胞eNOS基因表达的调节作用及其对血管新生的影响

目的探讨高尿酸对血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节作用及其对血管新生的影响。方法人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)在600μmol/L尿酸溶液中培养,应用RT-PCR和Western印迹分别检测各组细胞eNOS mRNA和蛋白表达,应用硝酸还原法检测各组细胞上清液中一氧化氮(NO)含量,应用人工基底膜检测细胞的管腔形成能力,应用鸡胚尿囊膜试验检测细胞的血管新生能力,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组HUVECs的增殖,应用划痕试验检测各组HUVECs的迁移能力。结果与对照组比较,600μmol/L的高尿酸培养HUVECs 48 h后,细胞eNOS mRNA转录水平、蛋白表达量、NO浓度显著下降(P0.01);HUVECs有聚集倾向,但未能形成管腔样网络结构;CAM的血管新生面积比率降低49.78%(P0.01);同时,细胞的增殖能力降低63.68%(P0.05),细胞的迁移能力下降38.70%(P0.01)。结论高尿酸抑制血管内皮细胞eNOS基因表达和NO含量;高尿酸抑制细胞的血管新生能力,同时抑制细胞增殖与迁移,其抑制的可能机制与高尿酸下调eNOS的表达有关。     

17β-雌二醇对大鼠心肌的促血管新生作用:促进微血管内皮细胞分泌VEGF

目的: 研究17β-雌二醇（17β-E2）对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)的促血管新生作用。方法: 以体外培养的CMECs为模型，用免疫荧光染色法检测雌激素受体(ER)的表达。用MTT比色法检测不同剂量的17β-E2对细胞增殖的影响。用细胞划痕法检测加入17β-E2后细胞的迁移能力。用Millicell小室测定法检测17β-E2对细胞侵入能力的影响。用管样结构形成实验观察加入17β-E2后细胞分化的情况。用ELISA法检测17β-E2对细胞分泌血管内皮生长因子（VEGF）的影响。结果: 免疫荧光染色法检测显示，心肌微血管内皮细胞内存在ER。MTT比色法检测表明，17β-E2可明显促进CMECs的增殖，在其浓度为0.01 μmol/L时，可产生最大的增殖效应；而雌激素的拮抗剂三苯氧胺（TMF）则可阻断此效应。同时发现，17β-E2处理组CMECs的迁移能力和管样结构形成的能力，均明显强于对照组及17β-E2+TMF处理组。与对照组及17β-E2+TMF处理组相比，17β-E2处理组可明显促进大鼠CMESs分泌VEGF（P<0.01）。结论: 在体外环境中，17β-E2可刺激CMECs自分泌VEGF，提高CMECs血管新生的活性。     

红景天苷抑制缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡

目的探讨红景天苷对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺血/再灌注损伤的影响及其可能的机制。方法分离培养大鼠CMECs,建立模拟缺血/再灌注模型,分为对照组、模拟缺血/再灌注(SI/R)组、SI/R+红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L)组。待红景天苷最适浓度确认为5μmol/L后,增加SI/R+红景天苷+LY[磷酯酰肌醇3激酶(PI3k)特异性抑制剂LY294002]组。MTT法检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,TUNEL法检测细胞凋亡,采用Western blot检测Akt磷酸化水平,以及凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2的表达。结果与对照组相比较,SI/R组CMECs增殖能力明显降低(0.410±0.011比0.200±0.014,P=0.041),凋亡率显著上升(4.15%±0.12%比26.05%±0.97%,P=0.018),而与SI/R组相比,SI/R+红景天苷组(1.0、2.5、5.0、10.0μmol/L)细胞增殖能力明显升高并呈剂量依赖性,细胞迁移率,而凋亡率则明显下降(均为P<0.05),LY294002组凋亡指数与SI/R+红景天苷组相比显著提高(22.03%±0.98%比16.28%±1.40%,P=0.029)。与SI/R组相比较,红景天苷可显著上调Akt的磷酸化,以及上调抗凋亡蛋白生存素和Bcl-2的表达(均为P<0.05),而此作用可被LY294002显著抑制(均为P<0.05)。结论红景天苷可显著抑制缺血/再灌注损伤诱导的CMECs凋亡,促进细胞存活,改善细胞功能,其作用机制可能与激活PI3K/Akt,以及上调凋亡抑制蛋白生存素和Bcl-2表达相关。     

Toll样受体4信号通路在心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤中的变化

目的:探讨Toll样受体4(TLR-4)信号通路在心肌微血管内皮细胞(CMECs)缺氧-复氧(H-R)损伤过程中表达的变化。方法:采用体外培养的CMECs,分为正常组、H-R组,其中H-R组根据复氧时间又分为复氧2 h、12 h及24 h组,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测内皮细胞增殖的能力。取细胞上清液用ELISA法检测白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;用Western blot法检测各组细胞中TLR-4及核因子-κB(NF-κB)表达的水平。结果:与正常对照组相比,缺氧6 h复氧2 h、12 h、24 h后CMECs增殖分别降低48.6%(P0.01)、49.1%(P0.01)、63.2%(P0.01);TLR-4蛋白水平在复氧2 h以及12 h后明显升高(P0.05),24 h基本恢复正常;NF-κB表达水平在复氧2 h、24 h显著高于对照组(P0.05);而CMECs复氧2 h、12 h、24 h后分泌的IL-6、TNF-α水平均高于对照组(P0.05)。结论:在CMECs H-R损伤中,TLR-4及下游NF-κB的表达增加,炎性因子IL-6和TNF-α的分泌增加,说明H-R损伤可激活CMECs表面的TLR-4信号通路,这一过程可能参与了H-R诱导的CMECs损伤。     

血管内皮生长因子对内皮生长晕细胞冻存后复苏率及增殖、迁移能力的影响

目的研究血管内皮生长因子对冻存后内皮生长晕细胞复苏率及其增殖、迁移能力的影响。方法密度梯度离心法分离脐带血中单个核细胞,体外扩增培养内皮生长晕细胞,免疫组织化学法、荧光染色法鉴定内皮细胞特性。分别采用不含血管内皮生长因子和含50μg/L血管内皮生长因子的冻存液对内皮生长晕细胞进行冻存,分为正常组、对照组、50μg/L血管内皮生长因子组,24 h后复苏并观察细胞的复苏率及其增殖、迁移能力。结果50μg/L血管内皮生长因子组可提高冻存复苏后内皮生长晕细胞的复苏率。24 h内两组细胞增殖、迁移能力均较正常组减弱(P<0.01),但50μg/L血管内皮生长因子组显示对内皮生长晕细胞增殖、迁移能力的保护作用。48 h后50μg/L血管内皮生长因子组细胞迁移能力较正常组增强(P<0.01),增殖能力接近正常组(P>0.05),但对照组在观察期间内细胞增殖和迁移能力均较正常组与50μg/L血管内皮生长因子组减弱(P<0.01)。结论血管内皮生长因子可以提高冻存后内皮生长晕细胞的复苏率以及复苏后细胞的增殖、迁移能力。     

雷帕霉素诱导大鼠肝星状细胞凋亡的研究

目的观察雷帕霉素(RAPA)对大鼠肝星状细胞系rHSCs-99增殖、凋亡的影响。方法将rHSCs-99分成4组:对照组(A组),RAPA 50 nmol/L组(B组),RAPA 100 nmol/L组(C组),RAPA 150 nmol/L组(D组)。RAPA作用72 h后,分别用MTT法检测rHSCs-99增殖,ELISA法检测I型胶原表达,流式细胞仪Annexin-V FICT/PI法检测细胞凋亡情况,Wright-Giemsa染色法观察细胞形态学改变,细胞免疫组化法检测Fas、P53与Bcl-2的表达变化。结果 RAPA作用后,rHSCs-99增殖受到抑制,I型胶原含量降低,凋亡率增高,Fas、P53表达增多,Bcl-2表达减少。结论 RAPA能抑制rHSCs-99的增殖及I型胶原合成。促进rHSCs-99凋亡,其机制可能是通过开启Fas/FasL凋亡途径及上调凋亡相关基因P53、下调Bcl-2的表达来实现。     

肿瘤坏死因子α对新生大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制

目的: 探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激对新生大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖的影响及其机制。方法: 采用消化法培养新生SD大鼠的CFs。实验分为4组,即5、10和20 μg/L TNF-α处理组及空白对照组。将CFs培养36 h后,用四氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞的增殖;分别用半定量RT-PCR和Western blot技术检测在5 μg/L和10 μg/L TNF-α刺激下细胞周期蛋白D1（CyclinD1 mRNA及其蛋白）表达的变化。结果: 随着TNF-α浓度的增高,MTT比色法检测的A490值呈明显递增趋势,其中5、10及 20 μg/L组的A490值,分别为0.417±0.011、0.622±0.015和0.602±0.013,与对照组（0.235±0.013）相比,有显著差异（P<0.05）。RT-PCR和免疫印迹检测表明,以5 μg/L和10 μg/L TNF-α刺激36 h后,CyclinD1 mRNA(0.706±0.113,1.698±0.135)和其蛋白(1.270±0.168,2.749±0.170)的水平均明显高于对照组CyclinD1mRNA(0.192±0.039)和蛋白（0.658±0.101）的表达水平（均P<0.01）。结论: TNF-α可通过上调CyclinD1的表达促进心肌成纤维细胞增殖,这可能为应用TNF-α信号通路抑制剂进行抗心肌纤维化治疗提供实验依据。