蟾蜍灵对K562细胞凋亡诱导作用及bcl-2基因表达的影响

目的探讨中药蟾酥有效成分蟾蜍灵（bufalin）对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡及bcl-2基因表达的影响。方法MTT实验测定K562细胞对蟾蜍灵的敏感性;原位缺口末端标记法（TUNEL）观察细胞凋亡率;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;半定量RT—PCR技术检测bcl-2mRNA表达。结果蟾蜍灵对K562细胞生长具有明显的抑制作用,MTT实验显示,蟾蜍灵对K562细胞的IC50值为0．013μmol·L^-1,统计学分析表明差异具有显著性（P〈0．01）;蟾蜍灵可明显诱导K562细胞调亡（P〈0．01）,药物作用6h、12h和24hK562细胞的凋亡率分别为20．36％、34．35％和48．16％;经琼脂糖电泳,蟾蜍灵作用细胞可见到DNA梯形条带;bcl-2mRNA表达3h开始下降,6～12h持续下调,与对照组相比具有显著差异（P〈0．01）。结论蟾蜍灵对K562的增殖抑制作用可能是因为它的凋亡诱导作用,而K562细胞凋亡可能是由于bcl-2基因表达改变。     

细胞外信号调解激酶对蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡影响的研究

目的:探讨细胞外信号调解激酶(ERK)对蟾蜍灵诱导白血病细胞凋亡的影响.方法:形态学观察和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果:0.5μmol/L蟾蜍灵作用K562细胞24h诱导典型的细胞凋亡,预先用ERK抑制剂PD98059处理细胞1 h,明显增加蟾蜍灵诱导的细胞凋亡率(P＜0.05);而用佛波酯预先处理后,明显拮抗蟾蜍灵的作用(P＜0.05).结论:ERK负向调节蟾蜍灵诱导的K562细胞凋亡过程.     

孤儿受体ROR2诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562凋亡的研究

目的 研究ROR2抑制慢性髓细胞白血病细胞株K562增殖并诱导其凋亡的作用,初步探讨可能的机制.方法 采用重组ROR2腺病毒(AdROR2)感染K562细胞为实验组,重组RFP腺病毒(AdRFP)感染K562细胞为对照组.采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡.Western blot检测实验组和对照组促凋亡基因caspase3和抗凋亡基因survivin的表达.结果 与对照组比较,实验组ROR2感染K562细胞48 h后,细胞增殖明显受抑(P＜0.05),细胞周期主要阻滞在G2/M期(P＜0.05),细胞凋亡增多,48 h凋亡显著(P＜0.05),同时促凋亡蛋白caspase3表达升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白survivin表达下降(P＜0.05).结论 过表达ROR2能够抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与上调了促凋亡蛋白caspase3和下调了抗凋亡蛋白survivin表达有关.     

南瓜蛋白与STI571体外联合抗K562细胞的作用

目的 探讨南瓜蛋白与ST1571对K562细胞增殖的抑制作用及其机制. 方法 用MTT检测南瓜蛋白与ST1571单用或联合作用对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞的凋亡率;Western blot检测药物对p210Bcr-Abl 蛋白的影响. 结果 南瓜蛋白与STI571联合作用协同抑制K562细胞增殖(q>1.15);协同诱导K562细胞凋亡;协同抑制p210Bcr-Abl蛋白表达. 结论 南瓜蛋白与STI571联合作用体外协同抗K562细胞的增殖.     

蟾蜍灵对白血病K562细胞生长抑制机制

目的探讨中药蟾酥有效成分蟾蜍灵对人白血病细胞系K562细胞增殖和凋亡的影响。方法倒置光显微镜、荧光显微镜、透射电镜观察细胞形态结构改变;MTT实验测定K562细胞对蟾蜍灵的敏感性;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;流式细胞术分析蟾蜍灵对细胞周期的影响。结果在光镜、荧光显微镜和电子显微镜下,蟾蜍灵作用K562细胞的形态和结构发生明显改变;蟾蜍灵对K562细胞的生长具有明显的抑制作用,与对照组细胞进行比较,差异具有显著性(P<0.05);MTT实验显示,蟾蜍灵对K562细胞的IC50值为0.013μmol/L,统计学分析证明,差异具有显著性(P<0.01);蟾蜍灵可明显诱导K562细胞调亡;经琼脂糖电泳,蟾蜍灵作用细胞可见到DNA梯形条带;蟾蜍灵可阻滞K562细胞于G2/M期。结论①蟾蜍灵对K562细胞的增殖抑制作用可能是因为它的凋亡诱导作用;②蟾蜍灵诱导K562细胞凋亡可能归功于G2/M期阻滞。     

SN-38对K562细胞的增殖抑制、凋亡诱导及其与塞来昔布联合化疗的协同作用

目的观察SN-38对慢性粒细胞白血病(CML)急变细胞株K562增殖抑制及凋亡诱导作用,并探讨其作用机制及与塞来昔布联合化疗的协同作用。方法采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪以AnnexinⅤ/PI双标记法检测细胞凋亡,PI单染法检测细胞周期;特异性荧光底物检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性;Western blot法检测凋亡相关蛋白表达变化。以CalcuSyn药效学软件计算联合指数(CI),评价SN-38与塞来昔布对K562细胞的联合效应。结果 SN-38对K562细胞具有时间和浓度依赖性的增殖抑制作用,SN-38可以诱导K562细胞凋亡,伴随G2/M期细胞比例持续下降,Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9活性以时间依赖方式升高,并显著下调K562细胞的Survivin蛋白表达。SN-38与塞来昔布联合化疗后,K562细胞增殖抑制率较两单药组明显增强;两药在低浓度时具有剂量依赖的协同效应(Fa<0.87)。结论 SN-38体外抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡,其机制可能通过下调Survivin表达,并激活Caspase有关。SN-38与塞来昔布联合应用对K562细胞具有剂量依赖的协同细胞毒效应。     

蟾蜍毒素诱导结肠腺癌细胞HT-29凋亡中对相关蛋白的影响

目的 探讨蟾蜍毒素诱导结肠癌细胞株HT-29凋亡及其机制.方法 MTI检测蟾蜍毒素对结肠腺癌细胞HT-29增殖抑制;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞术分析细胞凋亡;Western-Blot检测livin、Bcl-2、Bax及Capase-3蛋白的表达.结果 蟾蜍毒素抑制HT-29细胞增殖,呈时间、剂量依赖关系;蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡,形态学观察到典型的凋亡小体;流式细胞仪检测到明显亚二倍体凋亡峰;蟾蜍毒素诱导细胞凋亡过程中下调livin、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,并活化Caspase-3蛋白.结论 蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡可能与下调livin、Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白表达并活化Caspase-3有关.     

辛伐他汀通过氧化应激诱导K562细胞凋亡

目的:观察辛伐他汀对K562细胞凋亡的影响,探讨辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的分子机制.方法:不同浓度辛伐他汀处理K562细胞,Annexin V-FITC/PI双染法检测辛伐他汀对K562细胞凋亡的影响.辛伐他汀处理K562细胞48 h,流式细胞仪检测活性氧(Reactive oxygen species,ROS)浓度,免疫组织化学法测定突变P53蛋白表达.RT-PCR测定c-junmRNA表达.结果:Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示,5、10、20μmol/L辛伐他汀作用K562细胞48-72h能诱导其凋亡.辛伐他汀作用K562细胞后,与对照组比较,处理组细胞内ROS明显升高.辛伐他汀处理K562细胞后突变P53蛋白表达明显下调,c-jun mRNA 表达上调.结论:辛伐他汀改变K562细胞内氧化还原状态,细胞氧化应激,下调突变P53蛋白表达,上调c-jun 表达诱导K562细胞凋亡.     

NS398对白血病细胞K562凋亡的时间和剂量效应机制

目的 探讨非甾体药物选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS398对白血病细胞株K562细胞增殖及凋亡的效应关系和机制.方法 采用噻唑蓝还原法(MTT法)检测NS398对K562细胞增殖抑制作用,流式细胞仪(FCM)和单细胞凝胶电泳技术(comet assay)测定K562细胞的凋亡,免疫印迹实验检测相关蛋白的表达.结果 NS398抑制K562细胞增殖存在时间和剂量效应关系,各浓度间差异有显著性(P<0.05).NS398激活caspase-3和caspase-9,促进P53蛋白的积聚、Bax蛋白表达的上调和Bcl-xL蛋白表达的下调,进而导致细胞色素C的释放,致使K562细胞凋亡.结论 NS398可抑制K562细胞增殖,其诱导细胞凋亡的途径可能经过P53介导Bax的Caspase-3、Caspase-9的激活,揭示COX-2抑制剂可能存在着一个影响细胞翻译的新机制.     

正常骨髓基质细胞对K562细胞凋亡敏感性的影响

目的观察正常人骨髓基质细胞对白血病敏感细胞株K562细胞凋亡易感性的影响,并研究其作用机制。方法建立正常人骨髓基质细胞的体外培养体系及其与K562细胞共培养的体系;流式细胞仪检测Annexin V阳性的早期凋亡细胞;电镜下观察凋亡形态学改变;流式细胞仪检测bcl-2,活化的胱冬氨酸蛋白酶（caspaae）-3的表达变化。结果与单独K562细胞培养相比,与正常人骨髓基质细胞共培养的K562细胞,分别经阿糖胞苷作用后,共培养体系下其凋亡率下降,电镜下细胞凋亡的形态改变减少或消失,而且bcl-2蛋白表达上调,活化的caspase-3表达减弱。结论正常人骨髓基质细胞可促进白血病细胞株K562细胞的增殖,降低K562细胞对阿糖胞苷的凋亡易感性,其作用机制中包括影响凋亡相关蛋白bcl-2和caspase-3的表达。     

榄香烯和PD98059诱导人胃癌SCG-7901细胞株凋亡及其机制的探讨

目的：探讨榄香烯及PD98059对人胃癌SCG-7901细胞株凋亡的影响,及其与ERK1／2、P38MAPK信号通路的关系。方法：用不同浓度的榄香烯和PD98059处理人胃癌SCG-7901细胞,体外细胞增殖抑制实验（MTT）法检测细胞增殖情况;Western—blot法检测ERKl／2、磷酸化ERKl／2（p-ERK1／2）和磷酸化P38（p-P38）的表达;RT-PCR检测bcl-2mRNA及baxmRNA的表达;TUNEL法检测胃癌细胞凋亡并计算凋亡指数。结果：榄香烯和PD98059单独作用都有抑制胃癌细胞增殖的作用,前者呈浓度和时间依赖性,后者则呈时间依赖性但无浓度依赖性,两药联合作用时对胃癌细胞增殖的抑制作用显著大于单一用药时（P〈0．05）;随榄香烯的浓度增加p-ERK1／2蛋白的表达量增加（P〈0．05）,总FRK1／2无明显变化;榄香烯（0．08mg／mL）、PD98059（50μmol／L）及榄香烯＋PD98059组作用胃癌细胞24h,p-P38的表达均高于对照组（P〈0．05）,且榄香烯＋PD98059组较榄香烯组或PD98059组更高（P〈0．05）;随榄香烯浓度的增加,baxmRNA的表达增加,bcl-2mRNA的表达降低,且榄香烯＋PD98059组表现最显著;实验组细胞凋亡率均高于对照组（P〈0．05）,具有浓度依赖性（P〈0．05）,且榄香烯＋PD98059组的凋亡率明显高于单一作用组（P〈0．05）。结论：榄香烯及PD98059可以抑制胃癌细胞增殖,前者具有时间和浓度依赖性;榄香烯及PD98059还可以促进胃癌细胞凋亡。榄香烯抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的机制包括促进ERKl／2磷酸化和上调P-P38MAPK信号通路的表达;PD98059抑制ERKl／2的磷酸化,但通过上调p-P38MAPK信号通路的表达而发挥其细胞调节作用。     

Reversal effect of bufalin on multidrug resistance in K562/VCR vincristine-resistant leukemia cell line

ObjectiveTo probe insights into the reversal effect of bufalin on vincristine-acquired multidrug resistance (MDR) in human leukemia cell line K562/VCR.MethodsProliferative inhibition rate and the reversal index (RI) of bufalin were determined by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The uptake of Adriamycin (ADM) in K562/VCR cells, cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry (FCM). Cell morphologic changes were observed with Wright-Giemsa staining. The expression of P-glycoprotein (P-gp), multidrug-associated protein-1 (MRP1), Bcl-xL and Bax protein were measured by immunocytochemistry.ResultsThe human leukemia multidrug resistant K562/VCR cells showed no cross-resistance to bufalin. The RIs of bufalin at concentrations of 0.0002, 0.001 and 0.005 μmol/L were 4.85, 6.94 and 14.77, respectively. Preincubation of 0.001 μmol/L bufalin for 2 h could increase intracellular ADM fluorescence intensity to 28.07% (P<0.05) and down-regulate MRP1 expression simultaneously, but no remarkable effect was found on P-gp protein. Cell cycle analysis indicated increased apoptosis rate and apparent decreased G2/M phase proportion after treatment with bufalin. When exposed to 0.01 μmol/L bufalin, typical morphological changes of apoptosis could be observed. Down-regulation of Bcl-xL and up-regulation of Bax expression in K562/VCR cells could be detected by immunocytochemistry.ConclusionBufalin could partly reverse the MDR of K562/VCR cells, with a possible mechanism of down-regulating MRP1 expression and activating apoptosis pathway by altering Bcl-xL/Bax ratio.     

MAPK信号转导通路在托瑞米芬非雌激素抗肿瘤中的作用

目的探讨托瑞米芬(TOR)对乳腺癌细胞株MCF7的非雌激素抗肿瘤作用及促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在其中所发挥的作用。方法采用SRB法测量TOR单独或联合MEK抑制剂PD98059对乳腺癌细胞株MCF7活性的抑制;Western blotting检测不同浓度TOR对MCF7细胞株磷酸化ERK的影响。结果TOR抑制乳腺癌细胞株MCF7的活性,抑制强度呈浓度依赖性。PD98059与TOR联用,可显著增强TOR对MCF7细胞株的细胞毒作用,对细胞株抑制率大于两药单独应用之和。5、10、20μmol/L的TOR对MCF7细胞株中磷酸化ERK有明显的浓度依赖性抑制作用。结论MAPK信号转导通路在TOR非雌激素抗肿瘤中发挥重要作用,MAPK通路抑制剂与TOR联合应用可发挥协同作用,增强其抗肿瘤效用。     

海生素对K562/ADM抑制作用及其机理的初步研究

目的探讨海生素对K562/ADM细胞的抑制作用及其对凋亡相关蛋白bcl-2、bax表达的影响。方法采用MTT法测定海生素对K562/ADM细胞的体外抑制作用,免疫细胞化学法检测bcl-2、bax蛋白的表达。结果海生素对K562/ADM细胞有抑制作用,可下调bcl-2蛋白表达,上调bax蛋白表达。结论海生素在体外能明显抑制K562/ADM细胞生长,并影响bcl-2、bax蛋白的表达。     

二烯丙基二硫通过细胞外信号调节激酶途径调节HepG2细胞Survivin表达

目的探讨二烯丙基二硫（DADS）对HepG2细胞增殖的影响及其机制。方法W estern b lot法检测survivin、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和p-ERK1/2的表达;AO/EB染色观察细胞形态学变化。结果ERK1/2抑制剂PD98059抑制DADS诱导survivin表达的作用。PD98059与DADS联合应用可以促进HepG2细胞凋亡。结论DADS诱导HepG2细胞survivin的表达与ERK1/2信号通路有关。     

整合素β1信号通路参与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药

目的 探讨整合素β1及其下游信号转导通路在非小细胞肺癌表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)吉非替尼获得性耐药中的作用。方法 以人肺腺癌细胞株PC-9和吉非替尼耐药株PC-9/G作为研究对象,用MTT法检测吉非替尼和/或磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002、细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂PD98059对细胞增殖抑制率的影响;用Annexin Ⅴ/PI试剂盒和TUNEL试剂盒检测细胞凋亡。免疫印迹分析检测整合素β1、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达。结果 吉非替尼耐药株PC-9/G高表达整合素β1,RNAi抑制整合素β1表达能够抑制PC-9/G细胞的生长、促进调亡。ERK抑制剂PD98059不能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性。PC-9/G细胞中吉非替尼对Akt的磷酸化的抑制作用弱于PC-9细胞。PI3K抑制剂LY294002能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性,RNAi抑制整合素表达后Akt的磷酸化水平降低。结论 表达升高的整合素β1通过PI3K途径激活下游信号分子可能是一种重要的EGFR-TKI耐药机制。     

雷替曲塞及其联合PD98059对HT-29细胞的影响

目的 研究雷替曲塞及其联合PD98059对结肠癌细胞HT-29增殖及凋亡的影响,并探讨其分子机制.方法 ① 在倒置显微镜下观察处理24 h后各组细胞的形态及数量变化;② 使用细胞计数法检测不同处理条件下的细胞数;③ 使用流式细胞术检测各处理组细胞的凋亡率;④ 使用RT-PCR法检测各组K-RAS、ERK1、ERK2 mRNA的相对表达量.结果 ① 倒置显微镜下观察可见与对照组相比,除PD98059组外,其他各组细胞数量均减少,形态均发生凋亡变化,且随雷替曲塞浓度增高,变化程度增加;联合组细胞形态及数量变化较对应雷替曲塞组程度更深.② 细胞计数法显示各组细胞数均明显低于对照组的细胞数,且随着雷替曲塞浓度的增加,细胞数呈递减趋势;联合组与其他各组间均存在明显差异;③ 流式细胞仪检测显示和对照组相比,各组凋亡率均明显上升,在雷替曲塞组中存在浓度依赖性;联合组与其他各组的细胞凋亡率均存在差异;④ RT-PCR结果显示:与对照组相比,PD98059组、雷替曲塞组及联合组在K-RAS、ERK1、ERK2 mRNA的表达上均未表现出明显的差异.结论 ① 雷替曲塞对结肠癌细胞HT-29增殖及凋亡的影响呈浓度依赖性;② 雷替曲塞联合ERK抑制剂对HT-29细胞具有协同作用;③ ERK抑制剂不是在基因表达水平影响细胞的增殖及凋亡.     

MEK／ERK信号通路活性表达与乳腺癌干细胞增殖和凋亡的关系

目的探讨MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中的作用。方法体外培养乳腺癌干细胞,采用MEK抑制剂PD98059抑制MEK／ERK信号通路表达,Western blot检测PD98059对p—ERK1／2表达的影响,进一步应用MTT法测定PD98059对乳腺癌干细胞增殖的抑制作用,流式细胞术检测细胞周期变化;同时,TUNEL荧光染色分析、Histone／DNAELISA和流式细胞术检测评价细胞凋亡。结果PD98059可有效下调p—ERK1／2表达,抑制乳腺癌干细胞生长,诱导G0／G1期抑制;TUNEL荧光染色,Histone／DNAELISA检测和流式细胞术检测分析显示PD98059可有效诱导乳腺癌干细胞凋亡。结论MEK／ERK信号通路在乳腺癌干细胞增殖和凋亡中发挥重要作用。     

PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路对胰腺癌PANC-1细胞VEGF表达的影响

目的:探讨PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2信号通路对人胰腺癌PANC-1血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:抑制剂LY294002和PD98095分别处理人胰腺癌PANC-1细胞,Western blotting检测细胞VEGF蛋白表达。结果:分析表明LY294002和PD98095处理后的PANC-1细胞的磷酸化AKT、磷酸化ERK1/2及VEGF蛋白表达水平均明显低于对照组VEGF(P<0.05)。结论:抑制PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2细胞信号通路能够下调VEGF蛋白表达,进而抑制肿瘤新生血管的生成及浸润转移能力。     

细胞外信号激酶在泰素引起的卵巢癌细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号激酶(ERK)在紫杉醇引起的卵巢癌细胞调亡中的作用.方法用紫杉醇处理人卵巢上皮性腺癌细胞株Caov-3 and Skov-3,应用二氨基联苯染色,在显微镜下观察其凋亡.应用蛋白印迹法技术,用特异性识别双磷酸化ERK1/2的抗体,检测卵巢癌细胞经泰素作用后ERK1/2的活化情况.用MTT法检测PD98059对泰素引导的卵巢癌细胞毒性的影响.结果在80 nM泰素导致Caov-3和Skov3细胞凋亡和ERK1/2激活,泰素作用9h后,出现ERK的激活,15h后活性最大.用100μM的PD 98059作用于不同药物浓度(60nM和80nM)的泰素作用的细胞,细胞存活率显著降低(P＜0.05).结论泰素能激活卵巢癌Caov-3和Skov3细胞ERK.抑制ERK的活性能提高Caov-3和Skov3细胞对泰素的敏感性.阻断MEK1/ERK信号转导通路,可以增加泰素对卵巢癌的细胞毒作用.