荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

TaqMan-MGB荧光定量逆转录聚合酶链反应快速检测甲型流感病毒

目的:建立一种特异、灵敏、快速检测甲型流感病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法。方法:根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物软件在甲型流感病毒膜蛋白(MP)基因的保守区设计与筛选引物和MGB探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性和敏感性。并通过对疑似流感临床样本的检测,以评价该方法的实际应用价值。结果:该方法对甲型流感病毒的检测有高度的特异性、通用性,对乙型流感、麻疹、风疹、腮腺炎、RSV和腺病毒等其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右,且操作简便,重复性好。结论:本研究建立的MGB荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于甲型流感疫情的应急快速检测。     

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法、RT-PCR法及细胞培养法检测甲3型流行性感冒(流感)病毒的灵敏度与特异性.方法采用建立的实时荧光定量RT-PCR、RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离等3种方法,同时对流感监测点送检的60份疑似流感标本检测甲3型流感病毒.结果细胞病毒分离的阳性数为10份,RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR的阳性数分别为12份和15份.实时荧光定量RT-PCR的灵敏度达0.01TCID50且对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征冠状病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右.结论实时荧光定量RT-PCR由于检测在密封环境中进行,避免了产物与环境间的交叉污染,且是3种方法中最为快速敏感的方法,适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断.     

甲3型流行性感冒病毒环介导逆转录等温扩增检测方法的建立与应用

目的 建立适用甲3型流行性感冒(流感)病毒核酸检测的环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)方法,为基层实验室流感快速诊断服务.方法 对甲3型流感病毒设计两对环介导特异性引物与一个环引物,采用环介导RT-LAMP技术对甲3型流感病毒核酸进行等温扩增,并对反应体系进行优化.结果 采用RT-LAMP技术检测甲3型流感病毒核酸,敏感度可达0.01TCID50/反应,与荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的敏感度相一致,且对H1和H5亚型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、流行性腮腺炎病毒、副流感病毒与腺病毒无交叉反应,具有良好的特异性.采用该方法检测58份临床样本,病毒分离的阳性率为37.9%,而荧光定量RT-PCR与RT-LAMP的阳性率分别为53.45%和51.72%,敏感度明显高于通常的细胞病毒分离.结论 甲3型流感病毒环介导RT-LAMP检测方法,不仅快速特异、敏感性强,而且简便价廉,适于基层实验室使用.     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR快速检测副流感3型病毒

目的:建立特异、快速、灵敏的荧光定量RT-PCR方法用于副流感3型病毒核酸检测。方法:对副流感3型病毒的N基因应用C lustalW软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqM an-MGB探针,并对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,敏感性和稳定性,同时应用于疑似患者临床标本检测。结果:该方法对副流感3型病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、4型,甲型、乙型流感病毒,麻疹病毒,风疹病毒,腮腺炎病毒,呼吸道合胞病毒和腺病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1TC ID50,可从疑似患者含漱液标本中直接检出,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论:本研究建立的TaqM an荧光定量RT-PCR是一种快速检测副流感3型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

应用实时荧光定量PCR技术快速检测甲型H1N1流感病毒

目的:对疑似甲型H1N1流感患者标本进行病毒核酸检测确诊,探讨实时荧光定量PCR检测方法在流行性感冒检测诊断中的意义。方法:采用WHO标准实时荧光定量PCR方法对2009年6月～12月萧山地区采集的436份疑似甲型H1N1流感患者咽拭子标本进行病毒核酸检测,并对甲型H1N1流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒和乙型流感病毒进行快速分型。结果:436份咽拭子标本中有144份呈甲型H1N1流感病毒核酸阳性,阳性率33.03%,另检出甲1型流感病毒15份,甲3型流感病毒30份,没有检出乙型流感病毒。结论:实时荧光定量PCR方法操作方便、耗时短、特异性强、灵敏度高,可作为甲型H1N1流感疫情可靠的快速诊断方法。     

多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

甲型H1N1流感病毒real-time RT-PCR检测方法的研究与应用

[目的]建立一种特异、灵敏、快速的Real-Time RT-PCR方法用于检测甲型H1N1流感病毒核酸.[方法]采用WHO所推荐的引物与探针序列,对Real-Time RT-PCR反应体系和反应条件进行调整优化,检测该方法的特异性和灵敏度.并对疑似甲型H1N1流感病例咽拭子标本进行检测.[结果]该方法对甲型H1N1流感病毒的检测的灵敏度达10-7(HA滴度为1:128),可从疑似甲流感患者咽拭子中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需2.5 h左右.[结论]建立的TagMan探针法Real-Time RT-PCR是一种检测甲型H1N1流感病毒的快速、特异、敏感的新方法,适合于基层疾控机构及医院开展甲型H1N1流感的应急检测.     

一步法流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量反转录聚合酶链反应方法的建立及应用

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测流行性乙型脑炎(乙脑)病毒的荧光定鼍RT-PCR方法.方法 根据GenBank登录的乙脑病毒毒株序列,应用生物软件在乙脑病毒基因的保守区设计与筛选引物和探针,对荧光定量RT-PCR反应体系与条件进行优化,验证方法的特异性、敏感性和重复性.并通过对蚊虫样本的检测,以评价该方法的实际应用价值.结果 优化结果表明荧光定量RT-PCR的最佳反应体系为0.1 μmol/L探针浓度,0.2μmol/L引物浓度,5 mmol/L Mg2+浓度.结果 表明该方法对乙脑病毒的检测有高度的特异性、通用性,对1～4型登革热病毒、狂犬病毒、汉坦病毒(SEO型与HTN型)均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1 TCID50,重复性分析表明同一样品Gt值的重复检测4次,其标准差均在合理范围内,分别为0.033、0.079、0.149和0.411.对110批蚊虫标本进行荧光定量RT-PCR检测和病毒分离榆测,结果荧光定量RT-PCR检测出7份阳性,而病毒分离则只检测出3份阳性,表明建立的荧光定量RT-PCR方法更敏感,可直接从蚊虫样本中检测乙脑病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右,且操作简便、敏感性高.结论 研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR的方法具有特异、敏感、快速的特点,适用于乙脑病原学的快速检测.     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应快速检测麻疹病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.方法检测麻疹病毒的核酸,对设计的引物与探针进行筛选与条件优化.结果 Tag Man荧光定量RT-PCR方法具有对麻疹病毒核酸检测的高度特异性与准确性,检测的敏感度可达0.1TCID50,从病毒核酸提取至检测完成仅需3个多小时,操作简便,而且大大减少了常规PCR扩增产物的污染机会.结论采用Tag Man荧光定量RT-PCR方法对麻疹病毒与相关的临床样本进行了检测,均获得了满意的结果,为麻疹病毒的分子生物学检测,提供了一种新方法.     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.     

荧光定量PCR方法快速检测人博卡病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的、用于人博卡病毒核酸检测的荧光定量PCR方法。方法对博卡病毒的ns1基因应用Clustal W软件进行序列同源性比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针,并对荧光PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性,并将该方法与国际上通用的针对人博卡病毒ns1基因和np基因的普通PCR方法进行灵敏度比对;同时将该方法应用于疑似患者临床标本检测。结果该方法针对ns1基因进行扩增,对人博卡病毒核酸检测有高度特异性,与副流感1、2、3型,甲型、乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,腺病毒,冠状病毒229E、OC43,偏肺病毒以及鼻病毒等均无交叉反应。检测的灵敏度均比国际上通用的扩增ns1基因及np基因的PCR方法高10倍。用该方法从144份急性上呼吸道感染患者咽拭标本中检出了2份博卡病毒阳性,从病毒核酸提取至检测完成仅需3 h左右;用普通PCR仅能检出1份阳性标本,且耗时需5 h左右。结论该研究建立的TaqMan荧光定量PCR是一种快速检测人博卡病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。     

多重荧光逆转录PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型

目的建立多重荧光逆转录PCR（RT-PCR）同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法。方法在肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型VP1基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针,建立优化多重荧光RT-PCR反应体系,评价所建多重荧光RT-PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性,并应用于临床样品检测。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测具有高度特异性,检出限分别为0.1 TCID50和1 TCID50,具有较好的稳定性,可直接应用于临床样品的检测。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR可以同时准确检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型,灵敏度高,稳定性好,是一种快速检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的新方法。