重组hβc基因的慢病毒颗粒的包装及其在NB4细胞过表达研究

本研究旨在通过慢病毒介导的基因转移方法,使NB4细胞稳定过表达hβc基因,观察过表达hβc基因的NB4细胞在IL-3或GM-CSF作用下分化行为的改变,探讨hβc基因与NB4细胞分化之间的关系。以本实验室前期构建的携带hβc基因ORF的克隆质粒为模板,用带PmeI和BstBI酶切位点的引物PCR获得目的基因,酶切PCR产物,定向克隆至慢病毒载体pRRLSIN.cPPT.PGK/IRES/GFP.WPRE,构建含hβc基因的慢病毒载体,经酶切及测序鉴定其正确性,将构建好的重组质粒与包装质粒一起共转染293T细胞,收集培养液上清,感染NB4细胞,用Western blot鉴定目的基因在NB4细胞中的表达情况。以转染空载体慢病毒的NB4细胞(简称NB4-blank细胞)为对照,观察过表达hβc基因的NB4细胞(简称NB4-hβc细胞)在IL-3、GM-CSF、全反式维甲酸(ATRA)作用下分化行为的改变。结果表明:含有hβc基因的重组慢病毒载体能高效转染NB4细胞,并使NB4细胞稳定过表达hβc基因。NB4-hβc细胞,在IL-3或GM-CSF作用下CD11b表达水平上调,但上调的幅度均低于ATRA作用下的上调幅度,且未观察到形态学改变。NB4-Blank细胞在IL-3或GM-CSF作用下CD11b表达水平无明显变化。结论 :通过慢病毒介导的基因转移方法,成功地使NB4细胞稳定过表达hβc基因,IL-3或GM-CSF在一定程度上能诱导过表达hβc基因的NB4细胞向中性粒细胞分化,但不能使其完全分化成熟。     

全反式维甲酸诱导NB4细胞分化过程中TGF-β1/Smad信号途径蛋白表达的变化

目的：观察在全反式维甲酸（ATRA）作用下,人急性早幼粒细胞白血病（APL）NB4细胞株转化生长因子β1（TGF-β1）/Smad信号转导途径中蛋白表达的变化,探讨TGF-β1/Smad途径在NB4细胞分化过程中的作用机制。方法：将ATRA作用于NB4细胞株不同时间后,应用蛋白印迹（Western blot）方法检测TGF-β1、Ⅰ型受体（TβRⅠ）、Ⅱ型受体（TβRⅡ）、Smad2、Smad4和Smad7蛋白表达的变化。结果：ATRA作用3h后TβRⅠ、TβRⅡ的表达量开始增加;12h后TGF-β1的表达量开始增加,随着加药时间延长,蛋白表达量逐渐上升,48h表达量至最高,然后下降。而Smad2、4、7蛋白的表达在加药3～6h后开始增加,呈逐渐上升趋势,Smad2表达量于48h达峰值,然后逐渐下降;而Smad4和Smad7的最高值出现较晚,出现在72h,然后下降。结论：TGF-β1信号转导途径与APL细胞的分化密切相关,ATRA在体外能上调TGF-β1/Smad途径的蛋白表达,以发挥抗白血病效应。     

PADI4对NB4细胞分化过程中炎性因子表达水平的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4向粒细胞分化过程中肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)的表达变化及其是否参与炎性因子的表达。方法:建立ATRA诱导的NB4细胞分化模型,采用Wright-Giemsa染色观察细胞形态学变化;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b的表达; RT-PCR方法检测PADI4基因转录水平的表达; Western bolt方法检测PADI4翻译水平的表达; ELISA检测培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β的表达; siRNA技术干扰PADI4表达后ELISA检测TNF-α和IL-1β的表达。结果:ATRA诱导后NB4细胞胞浆增多,核浆比例降低,核有凹陷,杆状和分叶现象增多。流式细胞术检测结果显示细胞表面分子CD11b表达明显升高(P 0.01)。在分化模型中,RT-PCR及Western blot检测结果显示PADI4转录水平和翻译水平表达均明显升高(P 0.05)。ELISA方法检测培养液中TNF-α和IL-1β的表达水平明显升高(P0.05),而siRNA技术干扰PADI4表达后TNF-α和IL-1β的表达水平明显下降(P 0.05)。结论:ATRA诱导NB4细胞向粒细胞分化过程中PADI4的表达升高,同时PADI4参与了NB4细胞分化过程中炎性因子的表达。     

姜黄素联合全反式维甲酸诱导耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

本研究旨在探讨姜黄素联合全反式维甲酸(ATRA)对耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的影响及其分子机制。以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,对细胞进行计数和细胞形态学观察,应用流式细胞术(FCM)检测姜黄素单用或联合ATRA对NB4-R1细胞增殖、分化的影响;用Western blot检测AKT磷酸化在细胞分化中的变化。结果显示,全反式维甲酸对NB4-R1细胞增殖无影响,但可增强姜黄素对NB4-R1生长的抑制作用。单用姜黄素或全反式维甲酸对细胞分化无影响,姜黄素联合全反式维甲酸可明显诱导细胞CD11b表达,细胞在形态上呈明显分化特征。全反式维甲酸可在短时间内促进NB4细胞AKT第473苏氨酸磷酸化,而对NB4-R1细胞中的AKT磷酸化影响不大。姜黄素可以促进NB4-R1细胞AKT磷酸化,而联合全反式维甲酸可进一步增强AKT磷酸化。结论:PI3K/AKT通路失活可能是导致APL细胞耐药的因素之一,而姜黄素通过活化PI3K/AKT信号通路逆转APL耐药,促进NB4-R1细胞分化。     

维甲类受体亚型化合物对NB4细胞增殖分化作用及分子机制研究

目的 探讨RARβ特异性激动剂／RARα特异性拮抗剂（RARβ /RARα-）BMS453与RXR特异性激动剂（RXR＋）BMS649对NB4细胞增殖、分化作用及分子机制。方法 应用细胞计数法、细胞形态学观察、硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验、间接免疫荧光、流式细胞仪、RT－PCR等方法对药物处理不同时间的NB4细胞进行研究。结果 BMS453＋BMS649对NB4细胞的生长具有剂量依赖性抑制作用;明显诱导NB4细胞向粒系成熟方向分化;药物作用NB4细胞0,1,3,12,24,48h,RARα基因表达在1h开始上调,RARβ基因表达在3h开始上调,RXRα基因表达在3h开始上调;与全反式维甲酸（ATRA）相比差异无显著性。BMS453和BMS649单用对NB4细胞系无此作用。结论 RARβ /RARα-这一维甲类受体亚型化合物与RXR激动剂联合应用抑制NB4细胞生长并诱导NB4细胞分化成熟,二者具有协同作用,其作用机制可能通过RXRα的AF－2活性调节NB4细胞的生长和分化过程。     

维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中端粒酶活性与 hTERT,c-myc和bcl-2表达的研究

为了探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导HL—60细胞分化过程中端粒酶活性与hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达的变化规律及其意义，复制HL—60细胞的诱导分化模型，在分化前和分化过程中通过端粒重复序列扩增PCR—ELISA方法测定端粒酶活性，采用RT—PCR方法检测hTERT，c—myc和bcl—2　mRNA表达水平。结果显示，在ATRA诱导HL－60细胞分化过程中，端粒酶活性水平逐渐下降，hTERT　mRNA表达下调的同时c—myc和bcl—2　mRNA表达亦下调，且hTERT　mRNA下调早于端粒酶活性水平下降。结论：全反式维甲酸诱导的HL—60细胞分化过程与端粒酶活性降低和hTERT，c—myc及bcl—2　mRNA表达下降有关。     

XIAP表达在ATRA诱导APL细胞分化中的意义

目的 探讨X染色体相关凋亡抑制蛋白在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化过程中的表达意义.方法 以急性早幼粒白血病细胞NB4为细胞模型,利用细胞计数、瑞氏染色、蛋白质免疫印记等方法.观察细胞经ATRA处理不同时间后细胞分化情况以及XIAP蛋白表达情况.结果 1μmol/L的ATRA可抑制NB4细胞的生长,在用药处理72h后细胞出现明显的分化,XIAP蛋白含量明显下降.结论 在ATRA诱导APL细胞分化过程中,凋亡抑制蛋白XIAP表达明显下调.     

乌苯美司增强全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化的体外研究

目的探讨氨肽酶N抑制剂乌苯美司（ubenimex）对全反式维甲酸（ATRA）诱导人急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞分化的影响及可能机制。方法采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b，四氮唑蓝（NBT）还原实验检测细胞分化；Western blot法检测细胞c—Myc、ERK1／2及P—ERK1/2 、p38MAPK及p—p38MAPK蛋白表达。结果ubenimex单独应用对NB4细胞的NBT还原能力及CD11b表达无明显影响，但ubenimex能增强ATRA诱导NB4细胞的NBT还原能力及CD11b的表达。100μg／mlubenimex能增强10nmol／LATRA诱导原代APL细胞的NBT还原能力。100μg／mlubenimex增强10nmol／LATRA下调NB4细胞c—Myc蛋白的表达；抑制10nmol／LATRA引起的NB4细胞的p38MAPK磷酸化。结论ubenimex能够增强ATRA对APL细胞的诱导分化作用，可能与抑制p38MAPK的磷酸化及对原癌基因c—Myc表达的调控有关。     

NB4细胞株分化中NDRG1表达的研究

目的:应用多种分化诱导剂处理急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系NB4细胞株,探讨NDRG1表达在白血病细胞诱导分化中的作用.方法:采用1×10-7mol/L全反式维甲酸(ATRA)、1%二甲基亚砜(DMSO)和20nmol/L佛波酯(TPA)分别处理NB4细胞48h,并通过细胞染色、流式细胞检测、蛋白印迹(Western blot)和实时PCR分别检测分化细胞的核型、CDllb、CDllc、CDl4表达,观察ndrgl mRNA与蛋白的变化.结果:3种分化诱导剂分别处理细胞株后,细胞核缩小且呈分叶状改变,细胞内NDRG1蛋白表达均呈时间依赖性上调;经ATRA和DMSO处理的细胞,其ndrgl mRNA发生上调,而经TPA处理的细胞却未发生ndrgl mRNA表达上调.结论:细胞信号调控分子NDRG1与细胞分化密切相关.     

免疫荧光动态监测急性早幼粒细胞白血病患者PML-RARα融合蛋白变化

背景：实时定量RT-PCR只能间接地反映融合基因表达量的变化,并不能在细胞原位直观反映急性早幼粒细胞白血病患者细胞内PML-RARα融合蛋白在全反式维甲酸治疗前后的相对表达量。目的：探讨免疫荧光技术检测融合蛋白PML-RARα表达的动态变化在判断急性早幼粒细胞白血病的全反式维甲酸早期治疗的效果。方法：应用免疫荧光技术检测全反式维甲酸干预的急性早幼粒细胞白血病经典细胞株NB4细胞或来源于急性早幼粒细胞白血病患者的NB4细胞PML-RARα蛋白的表达,以实时定量RT-PCR检测细胞PML-RARα mRNA的表达作为对照,以评价免疫荧光技术的可靠性。结果与结论：免疫荧光染色显示,无论是体外培养的NB4细胞,还是患者骨髓内的NB4细胞,在全反式维甲酸干预前细胞内均可见大量红色的融合蛋白PML-RARα,大小不均一、形状不规则,全反式维甲酸干预后,NB4细胞内红色的融合蛋白PML-RARα形状逐渐规则,弥散状态变为散在分布,且随着全反式维甲酸干预时间的延长,原有的弥散状态逐渐消失。实时定量RT-PCR测得的PML-RARα mRNA的变化趋势与免疫荧光相一致。说明免疫荧光技术检测PML-RARα能够更为直观地判断全反式维甲酸的治疗效果。     

Staurosporine诱导维A酸耐药早幼粒细胞白血病细胞株分化的研究

目的:研究蛋白激酶C抑制剂staurosporine对全反式维A酸(ATRA)耐药的急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株的诱导分化作用及其可能的机制。方法:以ATRA耐药的APL细胞株NB4-R1为模型,通过检测细胞表面分化抗原CD11b,并进行四唑氮蓝(NBT)还原实验和形态学观察,分析Staurosporine对NB4-R1细胞分化的影响;应用蛋白印迹法检测staurosporine对C/EBPβ、C/EBPε和PML-RARα蛋白表达水平的影响。结果:与对照组相比,staurosporine处理72 h后,细胞CD11b阳性率从(5.84±1.89)%上升到(65.90±2.00)%,差异有统计学意义(P     

全反式维A酸诱导的部分分化的白血病细胞具有去分化能力

目的:观察人急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞系NB4细胞株经全反式维A酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)诱导分化作用后,部分分化的白血病细胞的去分化能力。方法 :采用1μmol/L的ATRA处理NB4细胞48 h、72 h、96 h、120 h、168 h、216 h、288 h、336 h后,并通过瑞氏染色观察细胞形态学,流式细胞术检测CD11b的表达,用单克隆形成实验分别检测分化细胞的核型及撤药后各时间点单个CD11b+细胞的克隆形成能力,用蛋白印迹法观察细胞PML/RARα、RARα及PU.1等蛋白的表达变化。结果:NB4细胞CD11b的表达水平在ATRA处理48 h后达到高峰,之后稳定表达;ATRA处理后,NB4细胞中成熟中性粒细胞的比例也随处理时间的延长而增加,ATRA处理120 h比处理96 h,成熟中性粒细胞的比例有明显的增加(P<0.01)。结论:人类APL系NB4细胞经ATRA诱导后发生不同程度的分化,在撤去ATRA后,处于部分分化阶段的白血病细胞仍能通过"去分化"而重新获得无限增殖的特性。     

丹参酮ⅡA对NB4所诱导的ECV304细胞促凝活性影响的机制探讨

目的：研究丹参酮ⅡA（TanⅡA）对急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞诱导的血管内皮细胞株（ECV304）促凝活性（PCA）的影响,并对其机制作初步探讨。方法：（1）分别用1．0μg／mL TanⅡA、0．3μg／mLATRA、0．01%DMSO、PRMI1640处理NB4细胞24、48和72h,取其上清液作为条件培养基（hNB4-CM）。将这些CM分别与ECV304细胞在37℃共同孵育0、4、8和12h,用反复冻融法制备ECV304细胞裂解液,采用一期凝血法测定其PCA;采用ELISA法测定条件培养基中的TNF-α。（2）ECV304细胞与1．0μg／mL TanⅡA及TanⅡA72h-NB4-CM在37℃共同分别孵育6、12、24和48h,并以ATRA和DMSO分别作为阳性和阴性对照,用上述相同方法测定ECV304细胞裂解液的PCA。结果：（1）1．0μg／mL TanⅡA可以诱导NB4细胞分化,其作用NB4细胞的培养基有一定的升高ECV304细胞PCA的作用,该作用在孵育4h时达高峰,之后ECV304细胞PCA逐渐下降。与0．3μg／mLATRA的作用无统计学差异（P〉0．05）。（2）1．0μg／mL的TanⅡA对TanⅡA-72h-NB4-CM促ECV304细胞PCA有抑制作用,其强度随作用时间增加而增加,与1．0μmol／L ATRA比较,P〉0．05。（3）TanⅡA作用NB4细胞的培养基中TNF-α浓度,在作用前7h内随作用时间增加而增加,与0．3μg／mL ATRA比较无差异（P〉0．05）。结论：TanⅡA能诱导NB4细胞分化,后者在分化过程中释放的TNF-α可能与ECV304细胞PCA活性升高有关;TanⅡA又能抑制TanⅡA-NB4-CM增强ECV304细胞PCA的作用。     

APN/CD13对乌苯美司增强全反式维甲酸诱导急性早幼粒白血病细胞株NB4细胞分化的影响

本研究探讨细胞表面APN/CD13在乌苯美司(bestatin)增强全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的作用.采用四氮唑蓝还原实验检测细胞分化;Western blot检测细胞P38MAPK及p-P38MAPK蛋白表达.结果显示:APN/CD13中和抗体WM-15能够完全阻断乌苯美司对ATRA诱导分化作用的增强效应.WM-15能够部分阻断乌苯美司抑制NB4细胞P38 MAPK磷酸化的作用.100μg/ml乌苯美司呈时间依赖性抑制APL细胞株NB4细胞及MR2细胞的P38MAPK磷酸化水平,l00 μg/ml乌苯美司对CD13表达低下的K562细胞的P38 MAPK磷酸化水平无明显影响.100μg/ml乌苯美司不能恢复MR2细胞及难治复发患者原代APL细胞对ATRA的敏感性.结论:氨肽酶N/CD13抑制剂乌苯美司可能通过细胞表面APN/CD13分子的介导抑制NB4细胞P38 MAPK的磷酸化,从而增强ATRA诱导NB4细胞分化的作用.     

miR-142-3p在感染后肠易激综合征中的表达及意义

目的 探讨微RNA（miR）-142-3p在感染后肠易激综合征（PI-IBS）中的表达及意义,进一步阐明miR-142-3p调控PI-IBS发生发展的分子机制。方法 使用脂多糖（LPS）刺激后,在大鼠肠上皮细胞上考察miR-142-3p对高迁移率族蛋白B1（HMGB1）-Toll样受体4（TLR4）靶基因的作用;通过TargetScan预测软件分析发现HMGB1是miR-142-3p的靶基因,之后采用旋毛虫感染建立PI-IBS模型,原代肠上皮细胞进行小干扰RNA（siRNA）转染实验,提取肠上皮细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测,检测细胞中 miR-142-3p、HMGB1和TLR4的mRNA表达水平,考察miR-142-3p对HMGB1-TLR4靶基因的作用,并进一步验证HMGB1在miR-142-3p抗炎中的介导作用。结果 炎症基因NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α均为HMGB1-TLR4的靶基因。使用LPS刺激后,施加miR-142-3p大大抑制了HMGB1-TLR4靶基因（NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α）的表达（P均< 0.01）。使用siRNA对肠上皮细胞中的HMGB1靶向敲低后,细胞中的HMGB1表达降低超过80%,HMGB1-TLR4靶基因（NLRP3、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α）的表达均无明显变化（P均> 0.05）。结论 miR-142-3p在肠上皮细胞中具有抗炎作用,其抗炎作用依赖于HMGB1。     

As2O3和／或TGF-β1诱导NB4细胞凋亡中P27^Kip1、cyclin E、内源性TGF-β1的变化及其意义

本研究探讨三氧化二砷（As2O3）和／或转化生长因子-β1（TGF-β1）作用于NB4细胞后的细胞凋亡情况、P27^Kip1、cyclin E及内源性TGF—β1 mRNA水平的变化及其意义。用MTT法检测As2O3对NB4细胞的细胞毒性及IC50用瑞氏-姬姆萨染色观察凋亡细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,半定量RT—PCR检测P27^Kip1、cyclin E以及内源性TGF-β1的mRNA水平。结果表明：As2O3、TGF-β1均能明显抑制NB4细胞的生长,促进NB4细胞的凋亡;As2O3对NB4细胞的抑制及促凋亡作用均呈剂量-时间依赖关系,24小时的IC50约为12μmol／L,48小时的IC50约为5μmol／L,72小时的IC50约为3μmol／L。As2O3和／或TGF—β1均可使NB4细胞出现细胞周期阻滞,5μmol／L As2O3使NB4细胞阻滞在G2／M期,5ng／ml TGF-β1使NB4细胞阻滞在G1期,两者联合处理组主要使S期阻滞。As2O3、TGF-β1分别作用于NB4细胞时均可见P27^Kip1及内源性TGF-β1的mRNA表达上调,而cyclin E的mRNA表达下调;联合处理组结果显示TGF—β1可增强As2O3上述作用。结论：As2O3及TGF-β1均可诱导NB4细胞凋亡,引起细胞周期分布异常;As2O3及外源性TGF—β1可能通过上调内源性TGF-β1使P27^Kip1高表达以诱导细胞凋亡;TGF-β1可能直接抑制了cyclin E的表达,或者通过上调P27^Kip1的表达而反馈抑制cyclin E的活性,从而导致NB4细胞周期阻滞。     

基因ifi56在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中的表达及其真核表达质粒的构建

本研究探讨ifi56基因在全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的表达,构建人ifi56真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位情况。用RT-PCR技术检测APL细胞NB4经维甲酸处理不同时间后ifi56的表达,并从白血病细胞NB4中扩增ifi56全长编码序列,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,转染到293T细胞中,提取细胞蛋白,用Western blot方法检测蛋白表达情况,荧光显微镜检测IFI56的定位。结果表明,ifi56在未经处理的NB4细胞中几乎检测不到,当用维甲酸处理72小时后明显升高,并成功将ifi56插入到质粒pEGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为83 kD。IFI56重组蛋白在293T细胞内主要定位于细胞胞浆中。结论:ifi56表达随着APL细胞分化明显升高,成功构建ifi56基因真核表达载体,IFI56蛋白主要定位于细胞浆。