用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞急性分离的优化

目的：建立一种可快速获取生理状态良好的用于钙信号研究的小鼠心室肌细胞的方法,同时比较两种细胞保存液对心室肌细胞钙信号的影响。方法取成年小鼠心脏,用改进的 Langendorff 心脏灌流系统行主动脉逆行灌流,利用酶联合法消化,取得心室肌细胞置于两种不同的细胞保存液中,在显微镜下观察并检测其状态。采用共聚焦显微镜观测细胞内钙信号,记录钙火花。结果该方法可以在较短的时间内得到65％以上的长杆状心室肌细胞,细胞能够正常存活12～24 h,并且可以立即用于钙火花观测实验研究。比较两种保存液,细胞保存液 A中富含高钾离子,细胞保存液B中含有正常的胞外钙离子浓度,观察到的钙火花细胞保存液B中比A液的频率高、幅度大,在达峰时间上比A液的时间短。结论通过严格控制各项实验条件,能够成功得到存活率高、纯度高、耐钙的可用于钙火花观测的小鼠心室肌细胞。细胞保存液中的钾离子含量少,并有适量的钙离子有助于观测钙火花的发生。     

成年大鼠心室肌细胞的培养

目的：探讨成年大鼠心室肌细胞的分离培养方法,提高细胞存活时间。方法：采用LANGENDORFF灌流法,胶原酶P酶解分离心室肌细胞,并用M199培养基进行培养。显微镜下观察细胞形态结构,并予电刺激观察心室肌细胞的收缩情况。结果：心室肌细胞分离、存活率高,形态结构良好,存活可达7 d。电刺激下心室肌细胞出现同步收缩;若去除细胞外液中的钙离子,则不再收缩。表明心室肌细胞活性完好。结论：改进后的分离和培养方法,能使急性分离的成年大鼠心肌细胞的存活时间明显延长。     

不同用途的心室肌细胞的分离

目的 :建立适合于不同用途的心室肌细胞的酶解分离方法。方法 :恒流 Langendorff灌流 ,I型胶原酶酶解分离 ,应用膜片箝技术记录离子电流、双波长显微荧光光度术检测细胞内游离钙离子浓度及视频跟踪系统测定心肌单细胞收缩。结果 :采用不同分离技术参数获得的心肌细胞能满足上述三种实验条件下的要求。酶解分离的单个心室肌细胞静息电位为 (- 74 .0 6± 4 .5 4 ) m V,记录到心室肌细胞典型的钾、钠、钙离子电流和稳定的心室肌细胞内游离钙比值 ,心室肌单细胞收缩特性稳定。结论 :通过调整分离技术参数获得的心室肌细胞性能稳定 ,具有正常的电 -机械生理特性和耐钙性。     

适合膜片钳实验的心肌细胞分离方法研究

目的：摸索并建立简便可行的适于做膜片钳实验的心肌细胞急性分离方法。方法：采用自行改进的Langendorff心脏灌流装置,用无钙台氏液和酶解液逆行主动脉灌流之后,剪取心肌组织置于KB液中保存以供全细胞膜片钳方式记录电流,结果：分离所得80％～90％的细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰,可记录到典型的快钠电流。结论：控制好分离心肌细胞的实验条件以及熟练掌握实验操作的方法,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度

目的 在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2 电流(Ica)和Ca2 浓度[Ca2 ].的变化.方法 改良Langendroff法,用含胶原酶Ⅰ(1750 U/mL)和蛋白酶XⅣ(0.28 mg/mL)的无Ca2 台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ica,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞[Ca2 ]i的变化.结果 在20 rmin内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞Ica,1μmol/L异丙肾上腺素可显著增加Ica;并观察到心室肌细胞[Caa2 ]i以及电刺激增强[Ca2 ]i的效应.结论 大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验.     

β1肾上腺素能受体抗体对小鼠心室肌细胞钾离子通道的作用

目的 采用β1,肾上腺素能受体抗体(anti-ADRβ1)模拟自身抗体,研究其对小鼠心室肌细胞钾离子通道的作用.方法 酶解法分离小鼠心室肌细胞,以不同稀释比例anti-ADRβ1.灌流心肌细胞,膜片钳电生理技术记录钾离子通道电流的变化.结果 不同稀释比例anti-ADRβ1 1/500、1/100、1/50的细胞外液灌...     

成年小鼠心室肌细胞分离及L型钙电流记录

目的:寻找一种成年小鼠心肌细胞分离的简便、可行且稳定的方法,以获得耐钙心肌细胞并记录心室肌细胞L型钙电流(IL-Ca)。方法:采用Langerdorff逆行主动脉灌流、无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法分离成年小鼠单个心室肌细胞;利用含钙细胞外液复钙法筛选耐钙心肌细胞;并采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L型钙电流。结果:利用该方法分离心肌细胞可获得90%活细胞;复钙后细胞存活率60%-70%;并可记录到典型L型钙电流。结论:无钙台氏液+胶原酶Ⅱ消化法简单可行且稳定,可分离大量活性较佳且耐钙心肌细胞,可用于心肌细胞离子通道电流记录,从而为心脏电生理研究提供有力的技术支持。     

豚鼠心室肌细胞的分离及其基本电生理特性的观察

目的 分离豚鼠单个心室肌细胞,并观察其基本电生理特性.方法 Langendorff灌流,胶原酶法分离心室肌细胞;应用膜片钳全细胞模式记录心室肌细胞的动作电位和L型钙通道电流.结果 酶法分离得到存活杆状细胞达50%以上.全细胞电流钳模式下记录,细胞静息电位为(-69.9±3.4)mV,复位到95%时的动作电位时程(APD95)为(313.1±38.9)ms.全细胞电压钳模式下记录到典型L型钙通道电流.结论 该方法能够简单有效地获得性能稳定的心室肌细胞,尤其适用于膜片钳心电生理学的研究.     

豚鼠心肌细胞分离方法及电生理特性的观察

目的：建立膜片钳实验室单个心肌细胞的分离方法和膜片钳技术平台.方法：采用酶解法分离豚鼠心室肌细胞;在膜片钳全细胞模式下记录不同基础刺激周长时的动作电位以及L-型钙电流、延迟性整流钾电流.结果：酶解法分离豚鼠心室肌可以得到90%的存活细胞;豚鼠的单个心室肌细胞静息电位为（-74.0±2.2）mV,基础刺激周长1 000 ms时复极90%的动作电位时程（APD90）为（313.2±20.72） ms;APD90和复极50%的动作电位时程（APD50）均随着基础刺激周长的延长而延长.L-型钙电流峰值电流密度为（-7.36±1.10）pA/pF,0.1 mmol/L verapamil灌流后为（-1.22±0.49 ）pA/pF,100 μmol/L CdCl2灌流后内向电流消失;延迟性整流钾电流密度为（4.88±0.96）pA/pF,2 μmol/L Dofetilide灌流后降低为（3.48±0.37）pA/pF.结论：酶解法分离的豚鼠心室肌细胞可以满足膜片钳实验的要求,此膜片钳技术可作为更深入电生理研究的平台.     

卡维地洛对大鼠心室肌细胞Ito电流影响的实验研究

目的探讨卡维地洛对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)的作用.方法采用胶原酶酶解法分离得到大鼠单心室肌细胞;采用膜片钳全细胞技术记录灌流卡维地洛前后Ito电流的变化.结果灌流0.1 mM及1.0 mM卡维地洛后,Ito电流密度分别为(pA/pF)(5.06±1.98),(3.91±0.66),P＜0.05;不同去极化电压水平Ito电流值也有明显减小,Ⅰ-Ⅴ曲线向下方移位.结论卡维地洛对大鼠心室肌细胞Ito电流具有抑制作用,此抑制作用呈浓度依赖趋势.     

单个人心房肌细胞急性分离技术及其细胞膜瞬时外向钾电流的记录

目的建立单个人心房肌细胞的急性分离技术,以满足检测人心肌细胞离子通道的需要。方法两步酶解法消化分离人心房肌细胞,采用膜片钳全细胞技术记录瞬时外向钾电流（I_to）。结果根据患者的性别、年龄及组织块的大小,选择适当的消化时间,分离得到结构清晰,横纹清楚,边缘整齐,少颗粒,舒展伸直,呈长杆状的单个心肌细胞：采用全细胞膜片钳技术能记录到瞬时外向钾电流。结论该方法能分离到形态和状态均良好的细胞,有利于进行单个人心房肌细胞膜片钳实验的研究。     

膜片钳研究中的钙耐受大鼠心肌细胞分离方法

目的：探讨膜片钳实验中大鼠心肌细胞分离过程中影响细胞活性和钙耐受性的各种影响因素。方法：采用Langendorff灌流，先用台氏液灌流30s，再用无钙台氏液灌流5-7min，其后换含胶原酶Ⅰ0.1-0.2g/L的低钙本科液消化约8-30min，最后用无钙台氏液冲洗心脏2min，剪下心肌组织，KB液中37℃剪碎吹打温育5min后，用200μm筛网过滤，室温静置换液后进行膜片钳实验。结果：注意控制水，酶，温度等各种因素后，可得到杆状、横纹清晰、膜良好的耐钙心肌细胞。结论：大鼠心肌细胞分离过程中各种因素控制好后可以保证一定的细胞成活率及其质量，有利于膜片钳实验的顺利进行。     

适于膜片钳实验的心肌细胞分离方法及维拉帕米对钙电流的作用

目的：建立适应于膜片钳实验的大鼠单个心室肌细胞的分离方法,探讨L-型钙通道在大鼠心肌电活动中的作用.方法：采用改进Langendorff装置,酶解法分离单个心室肌细胞,应用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞L-型钙电流及维拉帕米的作用.结果：该法分离到的心肌细胞存活率达80％～90％,高倍镜下细胞呈杆状,边缘清楚,表面光滑,纹理清晰;成功记录到典型L-型钙电流（Ica-L）,给予维拉帕米（0.3、3、30 μmol/L）后呈浓度依赖性抑制钙电流,其抑制率分别为（44.35±5.52）％,（61.06±2.99）％,（71.88±4.45）％.结论：改进心肌细胞的分离方法可获得大量耐钙心室肌细胞,这些细胞具有正常的电生理特性.     

多用途成年大鼠心室肌细胞分离方法

目的 建立稳定的可同时用于细胞培养和膜片钳实验的成年大鼠心室肌细胞的分离方法 .方法 应用Langendorff灌流.生物酶消化法分离耐钙心肌细胞.分别用左右心室肌做细胞培养和全细胞膜片钳研究.结果 左室心肌细胞数(3.7±0.6)× 10~6,杆状细胞得率(84.85±2.7)%.右室心肌细胞横纹清晰,折光率好,膜片钳实验时容易封接破膜,记录到典型的I_(Ca).L、I_(K1)、I_(to)、I_(Na)电流.结论 该方法 简单、节约、重复性好,改善了杆状细胞得率、细胞质量,左右心室肌细胞分别能很好地用于细胞培养和膜片钳实验.     

心室肌M细胞瞬时外向钾电流特性研究

目的研究表明犬心室壁中层心肌细胞(M细胞)具有独特的电生理特征,如动作电位时程有较强的频率依赖性。本文观察M细胞瞬时外向钾电流传性,并讨论其与动作电位特征的关系。方法酶解犬左心室心肌M细胞及心内、外膜层肌细胞,应用膜片钳全细胞记录技术观察并比较其单个心肌细胞的瞬时外向钾流传性。结果(1)M细胞和心外膜层肌细胞的瞬时外向钾流较心内膜层肌细胞明显地大。(2)M细胞瞬时外向钾流具有显著频率依赖性,即基础刺激周长长时其强度明显增加。结论 M细胞具有较大的瞬时外向钾电流是其显著“峰和园顶”形态和动作电位时程较强的频率依赖性的离子基础之一。     

溶血磷脂酸对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用

目的：观察溶血磷脂酸(LPA)对豚鼠心肌细胞电压依赖性钾离子通道电流的作用。方法：用膜片钳实验技术记录胶原酶急性分离的豚鼠心室肌细胞钾通道电流。结果：共记录了33个心室肌细胞的电压依赖性外向K+通道电流发现1.0 μmol•L^-1和10.0 μmol•L^-1 LPA可明显降低K+通道电流的幅值。 结论：LPA可能参与心肌梗塞时心律失常的发生。     

M 3受体激动剂对急性缺血性心肌的保护作用

目的：研究 M 3受体激动剂胆碱对大鼠急性缺血性心肌的保护作用其可能的机制。方法用低 pH 值（pH 6．8）乏氧液来模拟缺血环境,全细胞膜片钳技术记录 L-型钙电流（ICa-L ）变化;激光扫描共聚焦技术观测细胞内钙变化,探讨胆碱对细胞内钙及钙库的影响。结果在膜片钳实验结果显示,与正常组比较,缺血组 ICa-L 电流密度明显增高,应用胆碱后 ICa-L 下降,差异有统计学意义（P＜0．01）;共聚焦实验结果显示,与正常组比较,缺血组细胞内钙升高明显（P＜0．01）,胆碱组细胞内钙升高幅度不明显;预先给予4-DAMP 可部分逆转胆碱抑制细胞 ICa-L 及细胞内钙升高的作用。结论 M3受体参与保护缺血心肌的可能机制为通过抑制缺血心肌细胞 ICa-L ,从而抑制细胞内钙超载。     

新生大鼠心肌细胞培养及电生理特性观察

目的应用原代细胞培养技术,以获取大量具有正常电生理特性的心肌细胞。方法用胶原酶溶液处理1 d龄SD大鼠的心脏,差速贴壁法纯化获得的单个心肌细胞,CO2培养箱中培养8 d后,以膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位和各跨膜离子流。结果细胞培养中,改进了酶溶液的成分、浓度和经典的差速贴壁法作用时间,获得了大量的高纯度单个心肌细胞。在此细胞上,采用电流钳技术,可引导出心室肌动作电位。运用心肌细胞离子通道的电压依赖性和特异阻断剂,在不同的钳制电位和指令电位下,可记录到INa,ICa,Ito,IK等多种离子流。结论改进的细胞培养技术可获得大量的具有正常电生理特性的心肌细胞。