电场对人视网膜色素上皮细胞生物学活性的影响

目的:观察电场作用对培养人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelial,hRPE)细胞活力及分裂过程的影响。方法:hRPE细胞置于强度为8V/cm的直流电场中暴露3h,停止电场作用后继续培养12h;未受电场作用的hRPE细胞作为对照组。显微摄像系统记录各时间点细胞图像,观察细胞形态变化;细胞行台盼蓝拒染活细胞计数及核仁嗜银蛋白(AgNORs)染色,图像分析染色结果;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:暴露于电场中的hRPE细胞伸长,垂直于场线方向排列,停止暴露后细胞恢复正常形态及分布;各时间点实验组与对照组细胞的台盼蓝拒染率差异无统计学意义(P>0.05);电场暴露前、暴露3h及停止暴露并继续培养12h后hRPE细胞核内AgNORs颗粒数分别为:6.2,6.5,7.3,与正常对照组细胞比较均无显著差异(P>0.05);流式细胞仪检测结果显示各组均未见明显细胞凋亡。结论:短时间电场作用对hRPE细胞的正常细胞活力及分裂无明显影响,提示该条件下的电场作用可能应用于促进RPE细胞修复的研究。     

机械牵拉对培养人视网膜色素上皮细胞增生和移行的影响

目的视网膜脱离和眼内增生性病变形成时,视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞层可能会受到牵拉力的作用。本实验旨在观察培养人RPE细胞在受机械牵拉力时增生和移行的变化。方法将胶原包被的磁珠悬液加入培养人RPE细胞后孵育,附着磁珠的细胞放置在恒定磁场中,分别于不同时间点用MTT比色实验和3H-TdR掺入试验检测细胞的增生情况,用融合单层培养RPE细胞部分缺失模型观察细胞移行变化。此外,观察去炎松对机械牵拉条件下RPE细胞增生和移行的影响。结果机械牵拉在急性期促进了RPE细胞的增生和移行。去炎松呈剂量依赖性抑制这一作用。在机械牵拉作用下15min和30min时的增生促进率分别为15.72%±0.46%(P=0.037)、24.80%±0.23%(P=0.003)。机械牵拉作用下30min时,移行促进率为23.67%±2.53%(P:0.031)。结论机械牵拉能促进RPE细胞的增生和移行,这一过程可能参与视网膜脱离或眼内增生性疾病的发生。     

端粒酶相关因素对培养的视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的探讨端粒酶相关因素对培养的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞增生的影响。方法用常规培养法培养人RPE细胞后，分别用端粒酶抑制剂二甲基亚砜、热休克蛋白90抑制剂、无血清培养、端粒酶反义寡核苷酸、P16反义寡核苷酸处理，然后提取细胞mRNA，PCR扩增后电泳检测端粒酶mRNA表达。然后用MTT法检测无血清培养组、端粒酶反义寡核苷酸处理组、P16反义寡核苷酸处理组与常规培养组细胞增生状况。结果二甲基亚砜组、热休克蛋白90抑制剂组、无血清培养组、端粒酶反叉寡核苷酸处理组，端粒酶mRNA表达受到抑制，凝胶分析系统软件分析结果电泳H值分别为80、116、90、81，而P16反义寡核苷酸处理组端粒酶mRNA表达增强，电泳H值为255。常规培养组H值为162，阴性对照组为0，阳性对照组（胃癌细胞）为255。MTT法显示：无血清培养组，端粒酶反义寡核苷酸处理组细胞活性下降，细胞生长抑制率上升。而P16反义寡核苷酸处理组细胞活性上升，细胞生长抑制率下降。结论端粒酶抑制剂二甲基亚砜、热休克蛋白90抑制剂、无血清培养、端粒酶反义寡核苷酸可抑制RPE细胞端粒酶mRNA表达，从而抑制RPE细胞增生；P16反义寡核苷酸可促进RPE细胞端粒酶mRNA表达，从而促进RPE细胞增生。     

羊膜对人视网膜色素上皮细胞增生和分化的影响

背景人视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗视网膜变性性疾病是目前的研究热点之一,许多生物载体可制备RPE细胞单层,但多存在着细胞毒性、稳定性差及免疫反应等问题。目的检测羊膜对人RPE细胞增生和分化的影响,探讨其作为人RPE细胞层载体进行移植的可能性。方法将RPE细胞系ARPE-19细胞株用含质量分数10％胎牛血清的DMEM／F12培养基进行培养和传代,8～12代细胞用于实验。将传代细胞分为2个组,一组细胞接种于去上皮羊膜作为实验组,另一组细胞直接在培养孔内进行培养作为对照组。分别于接种后24、48、72、96h行MTT实验,测定RPE细胞的吸光度（A492）值以评估两组细胞在增生能力方面的不同;培养3周后的细胞层行苏木精-伊红染色,检测细胞在不同培养载体上是否存在形态学方面的区别;分别收集同一孔中生长于羊膜和培养板表面的细胞,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测色素上皮衍生因子（PEDF）、钙黏蛋白（N—cadherin）、β-连环蛋白（β—catenin）以及细胞连接相关蛋白的表达情况;同时收集培养3周时的细胞行透射电子显微镜和扫描电子显微镜检查,比较不同载体培养的ARPE-19细胞在超微结构方面的区别。结果与对照组相比,实验组细胞增生的速度明显变缓,两组细胞增生情况比较差异有统计学意义（F=41．760,P=0．000）。苏木精-伊红染色结果显示,同一培养孔内实验组的细胞密度明显低于对照组,说明羊膜对ARPE-19细胞增生的影响不是通过细胞分泌的可溶性因子的作用。RT—PCR结果显示,实验组细胞连接相关蛋白claudin 1、N—cadherin和PEDF mRNA在培养细胞上的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义（t=15．828,P=0．000;t=6．839,P=0．002;t=14．667,P=0．000）;Connexin 43的表达低于对照组,差异有统计学意义（t=3．358,P=0．024）。超微结构分析发现羊膜载体上的细胞呈典型的多边形RPE细胞表型,分化现象明显,而普通培养板培养的RPE细胞形态主要呈梭形,细胞层厚薄不均。结论去上皮羊膜为载体培养的RPE细胞增生速度变慢,但培养的细胞分化程度较高,提示羊膜可作为RPE细胞体外培养的良好载体,用于制备移植所需功能成熟的RPE细胞片层。     

西洋参茎叶总皂甙对培养人胚视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的 研究西洋参茎叶总皂甙(PQS)对人视网膜色素上皮细胞(RPE)增生的抑制作用。方法 通过活细胞计数法与MTT比色法分别检测不同质量浓度(10μg／ml～500μg／ml)PQS和PQS(200μg／ml)在不同作用时间(6～120h)对RPE增生及代谢的影响。结果 PQS组细胞增殖受抑制，细胞生存率下降，400μg／ml抑制作用最强；其抑制效应在6h出现，72h达高峰。结论 PQS可能通过阻滞钙通道、干扰RPE代谢对RPE增殖具有剂量和时间依赖方式的抑制作用。     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞增生和VEGF表达的影响

目的　观察缺氧对培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelial,RPE)细胞增生和血管内皮生长因子 (vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表达的影响。 方法将培养的人RPE细胞接种于 2 4孔板 ,分别放入正常和缺氧环境中培养 ,于 1、2、3、4、5d后用四甲基偶氮唑蓝 [3 ( 4 ,5 dimethylthiazole 2yl) 2 ,5 diphenyltetrazoliumbromide ,MTT]比色法检测RPE细胞的增生 ,于 6、12、2 4h后用免疫组织化学法检测RPE细胞对VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析。结果　缺氧组的MTT实验吸光度 (A值 )均高于正常组 (P <0 .0 1) ;抗VEGF抗体染色 ,缺氧组明显强于正常组 (P <0 .0 5 )。结论缺氧可促进RPE细胞的增生及其对VEGF的表达 ,控制RPE细胞的活动是抑制脉络膜新生血管生成的关键     

表皮生长因子对人视网膜色素上皮细胞增生及移行的影响

目的　观察表皮生长因子 (epidermalgrowthfactor,EGF)及血清对体外培养的人视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞增生及移行的影响。 方法　对培养的人 3～ 6代RPE细胞采用MTT比色法观察不同浓度的EGF(0 .1、1、10、5 0、10 0 μg·L-1)及血清对人RPE细胞增生的影响 ;应用RPE细胞损伤模型 ,计数进入缺损区的细胞 ,定量观察EGF及血清对RPE细胞移行的影响。结果　在细胞增生的实验中 :无血清组 ,10～ 10 0 μg·L-1EGF达到最佳刺激浓度 ,其增生率为 81.8% ;5 0mL·L-1血清组 ,1～10 μg·L-1EGF的刺激作用最强达到 12 2 .7% ;无血清组与 5 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,且 5 0mL·L-1血清可明显促进人RPE细胞的增生 (P <0 .0 0 1)。在细胞的移行实验中 :无血清组 ,1～ 10 0 μg·L-1EGF可促进RPE细胞移行 ,但作用较弱 ;10 0mL·L-1血清组中 1～ 10 μg·L-1EGF促移行作用最强达 4 38.9% ;1～ 10 0 μg·L-1EGF的促进基础RPE细胞移行能力 (最强为 36 % )低于 10 0mL·L-1血清诱导的RPE细胞的移行能力 (强度为 14 7% ) ;无血清组与 10 0mL·L-1血清组间有显著性差异 (P <0 .0 0 1)。结论　EGF对体外培养的人RPE细胞具有浓度依赖性促增生和移行的作用 ;血清自身也具有此作用     

巴曲酶对视网膜色素上皮细胞增生活性的影响

目的探讨巴曲酶对视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)增生活性的影响。方法利用体外培养的RPE细胞系,应用噻唑兰比色法观察不同浓度的巴曲酶对RPE增生活性的影响。结果当巴曲酶浓度不大于1/10KU.mL-1时各浓度巴曲酶组(1/100KU.mL-1、1/32KU.mL-1、1/16KU.mL-1、1/10KU.mL-1)与对照组吸光度(optical density,OD)值差异无统计学意义(P=0.068、0.455、0.675、0.159);巴曲酶浓度为1/8KU.mL-1时OD值明显降低(P=0.000)。OD值与培养液渗透压呈明确的负相关(r=-0.951,P=0.000);巴曲酶组和等渗对照组OD值的差异没有统计学意义(P=0.749)。结论渗透压符合RPE生长要求的前提下,巴曲酶对体外培养的RPE增生无明显影响,其应用于玻璃体手术中控制眼内出血的可行性值得进一步研究。     

人视网膜色素上皮细胞在电场中定向移行的实验研究

目的:观察外源性电场对培养人视网膜色素上皮humanretinalpigmentepithelial,hRPE)细胞移行方向及细胞内肌动蛋白表达的影响。方法:培养于DMEM+100g/LFBS的hRPE细胞暴露于强度为6V/cm的电场中,未暴露于电场的细胞作为对照。观察并记录2h中每隔15min细胞移行的变化图像,测量细胞移行距离、细胞移行方向及其与场线间夹角。2h后采用间接免疫荧光法检测实验组与对照组细胞内肌动蛋白表达情况。SPSS10.0及Image-ProPlus5.0软件处理结果。结果:未暴露于电场中的hRPE细胞在观察期间呈无序移行,2h后细胞分布未见特殊变化,细胞内肌动蛋白有弱阳性表达。细胞暴露于电场30min后开始出现阴极方向的移行趋势,大部分细胞长轴趋向垂直于场线方向排列。细胞的移行表现为移行速度和移行方向的一致性均随时间延长而增加(P<0.05)。暴露于电场2h后,大部分细胞内肌动蛋白表达阳性,且多集中分布于细胞质内朝向电场阴极一侧。结论:外加电场可诱导hRPE细胞向电场阴极方向定向移行,同时伴有细胞内肌动蛋白阳性表达及定向分布。电场对细胞的作用与暴露时间成正相关。视网膜脱离后的内源性电场的存在可能参与并诱导了RPE细胞的定向移行。     

姜黄素对人视网膜色素上皮细胞增生的抑制作用

背景姜黄素是从姜的根茎中提取的物质,可抑制多种内皮细胞和上皮细胞的增生,但其抑制视网膜色素上皮（RPE）细胞增生的作用及机制鲜见报道。目的研究姜黄素对体外培养的人RPE细胞增生的抑制作用及机制。方法第5代人RPE细胞株接种于96孔板,分别加入5、10、15、20mg／L姜黄素分别作用24、48和72h,未加入姜黄素的作为对照,采用水溶性四氮唑-1（WST-1）检测各组人RPE细胞的增生情况和细胞活性（A值）;采用流式细胞术检测姜黄素作用后RPE细胞的凋亡率、坏死率和不同细胞周期的细胞比例;透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构的变化;采用Westernblot法检测RPE细胞中促凋亡因子p53、p21WAF1/CIPI和增生细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。结果WST-1检测显示,随着姜黄素质量浓度的增加,人RPE细胞的』4值逐渐降低,差异有统计学意义（Fm质量浓度=96．55,P=0．00）;随着姜黄素作用时间的延长A值逐渐增加,差异有统计学意义（FH目=4634．28,P=0．00）。流式细胞术检测表明,15mg／L姜黄素作用48h早期凋亡细胞率为（13．37±1．26）％,明显高于对照组的（7．03±0．37）％,差异有统计学意义（t=8．33,P=0．00）,姜黄素作用72h,早期凋亡细胞率及中晚期凋亡细胞率分别为（15．97-＋0．16）％和（0．26-＋0．03）％,明显高于对照组的（7．29±0．37）％和（O．14±0．02）％,差异均有统计学意义（t=37．80、7．44,均P=0．00）。15mg／L姜黄素作用48h后人RPE细胞处于G。／G,期细胞比例为（57．17±1．17）％,明显低于对照组的（67．73±1．10）％,差异有统计学意义（t=11．40,JP=0．00）。姜黄素作用后人RPE细胞可见线粒体肿胀和空泡样变性。Westernblot检测显示,15mg／L姜黄素作用24、48、72h后p53和p21WAF1/CIPI蛋白相对表达值均明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）,而15mg／L姜黄素作用24、48、72hPCNA蛋白的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论姜黄素可有效抑制体外培养的人RPE细胞增生,其抑制作用呈剂量和时间依赖性,其作用机制可能与p53信号通路有关。     

葛根素对人视网膜色素上皮细胞增殖及DNA合成的影响

目的:葛根素对人视网膜色素上皮细胞增殖及DNA合成的影响.方法:酶消化法分离人RPE细胞,进行形态学观察并用免疫组织化学法做抗人角蛋白抗体鉴定,取3～8代细胞用于实验.细胞计数法检测不同浓度(0,0.01,0.1,1 g/L)葛根素作用24 h和0.1 g/L葛根素在不同时间(24,36,48,72 h)对人RPE细胞增殖活性的影响,并计算出相应的细胞增殖抑制率.四唑盐(MTT)比色法检测葛根素作用24 h对人RPE细胞增殖活性的影响.用3H胸腺嘧啶核苷(3H thymidine,3H-TdR)掺入法检测葛根素作用24 h对人RPE细胞DNA合成的影响.结果:葛根素以剂量和时间依赖方式抑制人RPE细胞增殖,经统计学分析,0.01 g/L以上浓度葛根素均能显著抑制人RPE细胞增殖(P＜0.01)及DNA合成(P＜0.01).结论:葛根素显著抑制人RPE细胞增殖及DNA合成.     

整合素连接激酶对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的研究整合素连接激酶(integrin linked kinase,ILK)小分子干扰RNA(siRNA)对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞增殖的影响。方法培养hRPE细胞,角蛋白鉴定。以ILK为靶基因设计合成特异性的siRNA干扰片段转染hRPE细胞。荧光显微镜下观察转染效率,选择转染效率最高的干扰片段进行细胞转染。RT-PCR检测siRNA对ILK基因表达的抑制作用,MTT法检测转染前后hRPE细胞增殖活性。结果 ILK-siRNA可以成功转染至hRPE细胞,转染24h后hRPE细胞中ILK mRNA的相对表达水平在正常对照组、单纯脂质体组、阴性对照组及转染组中分别为0.44±0.48、0.43±0.38、0.42±0.47、0.32±0.71,正常对照组、单纯脂质体组和阴性对照组中ILKmRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),转染组ILKmRNA的表达较正常对照组明显降低,差异有显著统计学意义(F=21.78,P<0.01)。不同浓度ILK-siRNA转染组在不同时间点细胞增殖较正常培养组明显降低(P<0.01),50nmol·L-1浓度转染组对hRPE细胞的生长抑制最明显。结论 hRPE细胞表达ILK,siRNA抑制ILKmRNA的表达,在一定范围呈时间浓度依赖性抑制hRPE细胞增殖。     

褪黑素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的观察褪黑素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞生长、增殖的影响,寻找药物以防治增殖性玻璃体视网膜病变。方法分别将不同浓度的褪黑素(0,125ng·L-1,250ng·L-1,500ng·L-1)加入体外培养的视网膜色素上皮细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法在自动酶标测定仪测540nm处的吸光值A,并计算出不同浓度条件下的细胞增殖抑制率。结果褪黑素在不同浓度下抑制视网膜色素上皮细胞增殖,并存在剂量-效应关系,实验组125ng·L-1和500ng·L-1组与对照组比较有显著性差异(P<0.001),但实验组250ng·L-1组与对照组之间的差异无显著性。结论褪黑素能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜疾病的侯选药物作进一步研究。     

生长因子与视网膜色素上皮细胞

目前 研究认为视网膜色素上皮(RPE)细胞是构成增生性视网膜疾病中增生膜的主要细胞成分。RPE细胞的增生和移行，使得增生组织长人玻璃体内，最终导致牵拉性视网膜脱离和失明。新近研究的某些生长因子在RPE细胞的增生和移行中发挥了重要作用。介绍几种主要的生长因子对RPE细胞的作用，为RPE细胞的实验研究和临床研究提供理论基础。     

二甲基亚砜对培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的　探讨细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用。方法　本研究分实验组和对照组 ,对照组弃原培养液 ,加无血清培养液继续培养 ,实验组用不同浓度的DMSO 5、10、2 0、4 0mL·L-1分别作用于人RPE细胞 2 4、4 8、72、96h ,用MTT法检测DMSO对hRPE细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测DMSO对hRPE细胞周期的影响。结果　 10mL·L-1DMSO处理的hRPE细胞从作用 4 8h开始 ,OD值 ( 0 .5 37± 0 .0 10 )小于对照组 ( 0 .6 4 7± 0 .0 2 2 ) ,有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,细胞生长受到抑制 ,且随浓度增加及作用时间延长 ,抑制越显著。流式细胞仪检测 2 0mL·L-1DMSO作用 72h细胞周期发生明显变化 ,G1期细胞由4 1 31%增加至 5 9.6 5 % ,S期由 32 .0 9%减至 2 1.2 1% ,G2 期由 2 6 .6 5 %减至 19 14 % ,细胞生长被阻滞在G1期 ,生长受到抑制。结论　DMSO能阻滞hRPE细胞于G1期 ,抑制hRPE细胞增殖且呈剂量依赖性。     

苏拉明对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 观察苏拉明(suramin)对体外培养的人视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelial cells)生长、增殖的影响。方法 以300mg·L~(-1)苏拉明作用于培养的视网膜色素上皮细胞,于不同的时间点行细胞计数,绘制生长曲线,台盼蓝染色判定细胞的活性;将不同浓度的苏拉明(0、100、200、300、400mg·L~(-1))加入RPE细胞培养液,72h后用四甲基唑盐(MTT)比色法测吸光值A,并计算不同浓度条件下的细胞增殖抑制率;流式细胞技术检测细胞周期变化。结果 苏拉明在所设浓度内均抑制RPE细胞增殖,并存在时间-效应及剂量-效应关系,最大增殖抑制率约78％,72h时IC_(50)为272mg·L~(-1)。FCM示suramin使G_2/M期细胞增加了14.2％。结论 苏拉明能抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖,可作为防治增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)的候选药物作进一步研究。     

贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞增殖及纤维化的影响

目的：观察贝伐单抗对体外培养的人视网膜色素上皮细胞ARPE－19增殖及钙黏连蛋白（ E－cadherin ）和纤维连接蛋白（ fibronectin ）表达变化的作用,探讨贝伐单抗对ARPE－19增殖及纤维化的影响。方法：用不同浓度（0、0．625、1．25、2．5、5．0mg／mL）的贝伐单抗干预体外培养人视网膜色素上皮细胞ARPE－19,采用CCK－8法分别于24、48、72 h检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;应用免疫蛋白印迹法（ Western blotting）及逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测ARPE－19中E－cadherin和fibronectin的蛋白及mRNA的表达变化。结果：浓度为2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能有效抑制ARPE－19细胞的增殖及细胞周期,差异有统计学意义（ P＜0.05）。2．5、5．0 mg／mL贝伐单抗能抑制E－cadherin 基因,促进fibronectin基因的转录及表达,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：高浓度的贝伐单抗能够抑制ARPE－19细胞的增殖,下调纤维化相关因子E－cadherin ,同时上调fibronectin的表达,提示高浓度的贝伐单抗可以引起ARPE－19细胞纤维化。