问：蛋白质组学的常用技术有哪些？

答：相关技术有：（1）样品的制备技术如激光捕获显微切割（Laser—captured microdissection，LCM）技术；（2）蛋白质的分离技术如双向凝胶电泳、差异凝胶电泳、毛细管电泳、高效液相色谱等；（3）蛋白质的鉴定技术如质谱技术、凝胶图像分析等；（4）用于蛋白质分析的生物信息学。     

问：双向凝胶电泳面临的问题有哪些？

答：双向凝胶电泳在目前的蛋白质分离科学中仍然占据重要的位置，但其也有局限性：（1）2-DE需要较大样品量，而临床样品通常只能获得有限的样品量。（2）低拷贝蛋白通常不被检出，目前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质，而这些人体微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。（3）极酸或极碱的蛋白分离效果有所欠缺。（4）极大（〉200kD）或极小（〈10kD）蛋白的在电泳过程中易丢失，2-DE不能分辨。（5）疏水膜性蛋白不溶于样品缓冲液，     

基于激光解析／离子化-飞行时间质谱技术的中药阿胶蛋白质组分析

目的:应用激光解析/离子化-飞行时间质谱技术对传统中药阿胶蛋白/肽成分进行蛋白质组初步分析,建立阿胶蛋白质质量指纹图。方法:实验于2004-06/2005-03在湖南中医药大学蛋白质组学实验室完成。采用饱和硫酸胺沉淀,透析脱盐冻干法获得阿胶水溶性蛋白/肽,采用Ciphergen BiosystemsInc.ProteinChipRBiology System(美国PBSⅡ )及配套的NP10芯片、激光解析/离子化-飞行时间质谱技术,分析阿胶Mr1500～13000区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量。结果:Mr2000～4000区间显示4个相对分子质量峰,可能是2种肽;Mr4000～5000区间显示8个相对分子质量峰,可能为2种肽;Mr5000～5500区间显示16个相对分子质量峰,约为3种肽;Mr5500￣6200区间无峰;Mr8100～8200区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种肽;Mr11200～11400区间显示5个相对分子质量峰,可能为1种蛋白质。不同质量浓度稳定获得的有意义蛋白/肽共计9个。不同相对分子质量肽之间差分别提示可能为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸残基相对分子质量。结论:通过分析,可以形成阿胶蛋白质/肽成分质量指纹图,可作为阿胶数字化质控标准;并为进一步分离、纯化及验证阿胶功能相关活性蛋白质/肽组分提供可靠信息。     

人羊水特异蛋白质组学的探讨研究

目的寻找人羊水中特异性表达的蛋白质。方法羊膜腔穿刺获取3份正常孕妇的羊水,同时采集其外周肘静脉血,分离血清。提取羊水及血清中的蛋白质,用双向凝胶电泳观察人羊水和血清中蛋白质表达情况,并选取羊水中表达量较血清中高2倍以上的蛋白斑点行基质辅助激光解吸／离子化飞行时间质谱分析。结果在pH4—7、相对分子质量10-55kDa区域里,羊水中约（613±29）个蛋白点,血清中约（785±64）个蛋白点。在羊水中表达但血清中不表达的蛋白点约50个,羊水中表达量较血清高2倍以上的蛋白点约50个。结论羊水中存在特异性表达蛋白质,其在妊娠相关生理、病理学中可能起重要作用。     

结核性胸膜炎患者血清与胸腔积液蛋白质组的初步分析

目的:比较分析结核性胸膜炎患者血清与胸腔积液蛋白质组的异同,为探讨结核性胸膜炎的发生机制和寻找诊断标志物提供实验依据.方法:采用弱阳离子交换蛋白质芯片(WCX2)处理分析样本、应用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术,以蛋白质/多肽质荷比(m/z)区分不同的蛋白质/多肽,对5例结核性胸膜炎患者血清与胸腔积液蛋白质组进行描述性分析.结果:(1)在5例患者血清中检测到134种血清蛋白质/多肽,其中76种在胸腔积液中未出现;在5例患者胸腔积液中检测到269种蛋白质/多肽,其中211种在血液中未出现.(2)在5例患者血液中均检测到m/z分别为2660、3 191、4208、5 903、7 764、9 287等6种蛋白质/多肽;在5例患者胸腔积液中均检测到m/z分剐为2416、2660、2 900、2 940等4种蛋白质/多肽;在5例患者血液和胸腔积液中均检测到m/z为2 660的蛋白质/多肽.结论:结核性胸膜炎患者胸腔积液蛋白质组远比其血清蛋白质组复杂,对其进行深入研究有助于明晰结核性胸膜炎的发生机制和寻找诊断标志物.     

血浆置换对慢性重型乙型肝炎患者血浆蛋白质组影响的初步研究

目的探讨慢性重型乙型肝炎血浆置换（P E）治疗前后的血浆蛋白质组变化,为研究PE治疗重型肝炎的作用机制及寻找治疗靶标提供新的线索。方法收集慢性重型乙型肝炎患者PE前后血浆各15份,去除血浆中高丰度蛋白质。应用双向凝胶电泳（2-DE）技术构建两组研究对象血浆蛋白2-DE图谱,经Image Master差异分析软件进行分析,寻找差异蛋白质点。用电喷雾离子串联质谱（ESI-MS/MS）对重要的差异蛋白质点进行鉴定。结果经过样品预处理后,血浆中白蛋白和免疫球蛋白IgG等高丰度蛋白质含量明显减少,低丰度蛋白得到较好的富集。PE前组蛋白质点297个,PE后组蛋白质点305个,筛选出3倍以上的差异蛋白质点15个,鉴定了5个差异蛋白质,其中在PE后血浆中上调的蛋白质有补体因子B（Complement factor B precursor,CFB,点1）、CD5antigen-like蛋白（CD5antigen-like precursor,点2）、纤维蛋白原B链（Fibrinogen beta chain precursor,FGB,点3）、触珠蛋白（Haptoglobin precursor,点4）,下调的蛋白质有载脂蛋白E（Apo-E,点5）。结论鉴定了5个PE治疗前后差异表达的蛋白质,这些蛋白表达的改变提示PE可以干预机体脂蛋白代谢、蛋白质分解合成代谢,并能调节机体免疫功能,补体旁路活化途径等。深入研究这些蛋白质结构和功能对于进一步揭示PE的治疗作用机制具有重要的临床意义。     

基于质谱技术对森林脑炎患者血清代谢组学的研究

目的 利用代谢组学技术对森林脑炎致病机制进行可视化分析,寻找与疾病发生发展相关的生物标志物.方法 利用高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF-MS)技术,对59例森林脑炎患者与39例健康人群进行对比分析,结合多元统计分析方法 进行标志物筛选.结果 共筛选得到144种差异代谢物,通过代谢通路富集分析发现,差...     

稳定性心绞痛患者血清差异蛋白质的初步分析

摘要：目的：初步分析稳定性心绞痛（SAP）患者血清中差异蛋白质的表达。 方法：收集年龄与性别相匹配的50例SAP初诊患者与50例体检健康者的血清,分别混合血清后去除IgG 和清蛋白,进行PAGE并观察去除效率;进行固相pH梯度SDS-PAGE二维凝胶电泳,对凝胶进行银染后用Image Master 5.00软件分析;对差异点用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术进行测定。 结果：去除IgG和清蛋白前后的SDS-PAGE电泳图效果良好,IgG 和清蛋白去除率均＞80%;分析获得的2个差异点经质谱分析,间-α-胰蛋白酶抑制剂家族重链相关蛋白（inter-α-trypsin inhibitor family heavy-chain related protein,IHRP）、锌指蛋白A20（zinc finger protein A20,A20）在SAP患者血清中表达而在健康人血清中无表达。 结论：IHRP和A20可能在SAP发病机制中起一定作用。     

毛细管区带电泳用于血浆蛋白质混合物的分析

目的探索建立采用毛细管区带电泳(CZE)法分析血浆相关蛋白质的条件和方法。方法 1)以血浆COHN法组分Ⅳ(CFⅣ)抽提液为样品,代表蛋白质混合物,分别从波长、基本缓冲液、添加剂、PH、温度等方面,摸索CEZ分析蛋白质混合物的较优条件和方法;2)将摸索得到的较优条件下的CZE分析CFⅣ抽提液的结果,并与通过高效液相色谱(HPLC)法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及双向电泳(2-DE)法分析CFⅣ抽提液的结果比较;3)采用较优条件下的CZE法分析标准血浆、标准血浆经离子交换层析(IEC)的FⅧ粗提液等,考察该条件是否适用于血浆中的其他组分。结果 1)CZE法分析CFⅣ抽提液的较优条件为:20℃以214 nm紫外吸收波长,0.5 psi压力进样10 s,10 kV恒压分析50 min,缓冲体系为pH 9.0的0.04 mol/L硼酸硼砂、0.05%SDS、0.007 5%腐胺;2)采用此条件的CZE法分析CFⅣ得到14个蛋白峰、分析时间50 min,HPLC法分析得到10个蛋白峰、分析时间60 min,SDS-PAGE法分析得到11条蛋白条带、分析时间120 min,2-DE法分析得到14个蛋白点数(与CZE分析的蛋白峰数数量相同)、分析时间3 d;3)CZE法用于标准血浆、标准血浆经离子交换层析的FⅧ粗提液的分析可分别分辩出22和11个蛋白峰。结论以CZE法分析血浆相关蛋白混合物与现有分析方法比较,能达到较好的分析效果,经摸索确定的较优分析条件具有一定的通用性。     

结核杆菌临床分离菌早期培养滤液蛋白质组的比较

目的:初步了解结核杆菌体外液培养条件下的早期蛋白质代谢和分泌活动状况。方法:将2株对抗结核一线药物敏感的结核杆菌临床分离菌接种Middlebrook 7H9液体培养基进行培养,并于培养第7天用0.22μm滤纸过滤培养液制备早期培养滤液,应用与弱阳离子交换蛋白质芯片(WCX2)捕获滤液蛋白行表面增强激光解吸-电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测,描述性分析比较其蛋白质组。结果:在2株结核杆菌7 d培养滤液中分别检测到相对分子质量为982~9 329与941~9 331、丰度为7~210与11~368(通过质谱峰面积计算相对强度值表示)的164与194种蛋白质;与Middlebrook 7H9液体培养基本身蛋白质组比较,在2株结核杆菌7 d培养滤液中分别有153和183种蛋白质新产生(其中10种在2份滤液中均有存在)、92和90种蛋白质消失、10和13种蛋白质丰度变小。结论:在体外液体培养条件下,结核杆菌蛋白质代谢和分泌活动活跃,且不同菌株间有较大差异。     

递增负荷运动对大鼠心房肌蛋白质组研究的影响

目的：通过探讨递增负荷运动对大鼠心房肌蛋白质组的影响，以筛选出心房肌组织中对运动应激具有重要意义的差异性表达的目标蛋白质，在蛋白质组学水平上研究运动对心脏功能与结构影响的规律。方法：10只雄性SD大鼠，分为运动组（n=5）和对照组（n=5）。递增负荷运动训练7周，力竭运动后6h，运动组和对照组同时麻醉处死。提取心房肌组织的全蛋白，依次对样品蛋白进行pH梯度-SDS双向凝胶电泳分离蛋白、改良考马斯亮蓝方法染色、基质辅助激光解吸离子化飞行时间串联质谱分析。结果：运动组和对照组蛋白质斑点数目分别是354±40个和382±24个；共获得具有两倍以上差异性表达的蛋白质点104个；运动后上调两倍以上的蛋白质点66个，运动后下调两倍以上的蛋白质点38个。选择差异性表达5倍以上的蛋白质点为目标蛋白进行质谱分析，共鉴定出5个蛋白质点。结论：在运动应激状态下，大鼠心房肌蛋白质发生了明显的差异性表达，这些差异性表达的蛋白质点为进一步深入运动对心脏结构与功能影响的新的目标蛋白提供了实验依据。     

以蛋白质芯片为中药蛋白质/肽相互作用载体分析中药地龙生干品和炮制品的生物学特征

背景:激光解析、离子化一飞行时间质谱技术为以蛋白质/肽为主要成分的中药蛋白质组学研究提供了重要的技术平台.目的:对传统中药地龙蛋白,肽成分进行蛋白质组分析.设计、时间及地点:对比实验,于2004-12/2005-10在中南大学生物科学与技术学院分子生物学实验中心完成.材料:生干地龙和炮制品(沙烫)地龙,均购于湖南长沙九芝集团芝林大药房,源产地湖南.方法:以蛋白质芯片为载体,激光解析、离子化-飞行时间质谱法获取两者所含蛋白质,肽成分信息.主要观察指标:两种地龙Mr 1500～13 000区间蛋白质、肽分布及其相对分子质量.结果:共获得29个蛋白质,肽相对分子质量峰,其中生干品地龙17个有意义峰,炮制品地龙获取12个峰;多个相邻蛋白质峰之间质量相差一个氨基酸残基.并且生地龙与炮地龙有多组相对分子质量分别极为相近,推测可能为相同的肽段.结论:应用激光解析、离子化一飞行时间质谱技术可以形成生品地龙及炮地龙蛋白质,肽成分质量指纹图,可作为地龙数字化质控标准,并为进一步分离、纯化及验证中药地龙功能相关活性蛋白质/肽成分打下基础.