乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-Ⅰ表达的影响

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)前C区热点变异对宿主细胞HLA-Ⅰ分子表达的影响. 方法构建HBV前C区野毒株及A83、A83/A86变异株真核表达质粒,转染HepG2细胞,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性,流式细胞术检测HLA-Ⅰ分子的表达. 结果 PCR和ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg,转染细胞表达HLA-Ⅰ分子的平均荧光强度不同,野毒株为1.3,前C区变异后平均荧光强度增加,尤以A83变异表达增强显著(17.6),A83/A86为7.3. 结论前C区热点变异后宿主细胞HLA-Ⅰ分子的表达为上调.     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA-I表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）前 C区热点变异对宿主细胞HLA—I分子表达的影响。方法 构建HBV前C区野毒株及A83、A83/A86变异株真核表达质粒,转染HePG2细胞,鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性,流式细胞术检测HLA—I分子的表达。结果 PCR和 ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg,转染细胞表达HLA—I分子的平均荧光强度不同,野毒株为1.3,前C区变异后平均荧光强度增加,尤以A83变异表达增强显著（17.6）,A83/A86为7.3。结论 前C区热点变异后宿主细胞HLA—I分子的表达为上调。     

乙型肝炎病毒前C区变异对HepG2细胞HLA—I表达的影响

目的 研究乙型肝炎病毒（HBV）前C区热点变异对宿主细胞HLA－I分子表达的影响。方法 构建HBV前C区野毒株及A83、A83／A86变异株真核表达质粒，转染HepG2细胞，鉴定目的基因在宿主细胞中的生物活性，流式细胞术检测HLA－I分子的表达。结果 PCR和ELISA法分析能检测到目的DNA片段和HBeAg，转染细胞表达HLA－I分子的平均荧光强度不同，野毒株为1.3，前C区变异后平均荧光强度增加，尤以A83变异表达增强显著（17．6），A83／A86为7．3。结论 前C热点变异后宿主细胞HLA－I分子的表达为上调。     

乙型肝炎病毒上调HepG2细胞端粒酶活性

端粒酶（ｔｅｌｏｍｅｒａｓ）和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）被认为与肝细胞癌发生相关，二者关系如何？拟对此作一探索。材料与方法：将含有ＨＢＶＸ基因的载体（Ｘ-ＰｅｅＰ４）和ＰｅｅＰ４空载体分别转染ＨｅＰＧｅ细胞，获得带Ｘ基因的ＨｅＰＧｅ（Ｘ－ＨｅｐＧｐ）细胞和带ｐｅｅｐ４的细胞（ｐｅｅｐ４一ＨｅｐＧｚ）。培养ＨｅｐＧ２．２．１５、ＨｅｐＧ２、Ｘ－ＨｅｐＧｚ和ｐｅｅｐ４－ＨｅｐＧ２细胞，调节细胞数为５．２ｘ１０６ｍｌ－１左右，离心弃上清液。加人２００μｌ裂解剂后冰浴３０分钟，１６０００×ｇ离心２０分钟。将…     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的 构建1.3倍全基因乙型肝炎病毒(HBV)真核细胞表达载体,观察其在HepG2细胞中的表达。方法 从pGEM—HBV载体上将约4.1kb的1.3倍HBV全基因克隆至真核表达载体pCDNA3.1的Hind Ⅲ位点,将构建的pHBV经Lipofectamine2000导入肝癌细胞系HepG2细胞中。分别在转染后24、48、72h测定HepG2上清液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)的表达,细胞内HBsAg、乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫组织化学染色,Southern、northern杂交鉴定HBV的复制与表达。结果成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体,转染后24、48、72h细胞上清液中HBsAg分别为5.36±0.25,13.42±1.24,7.52±0.43;HBeAg分别为9.16±0.32,22.75±1.49,15.96±1.03。免疫荧光结果显示转染后24 h细胞内HBsAg表达最强,主要呈胞浆内弥漫性分布,HBcAg为核浆型分布,以浆型为主。Southern、northern杂交均证实细胞内存在各种病毒复制中间体和特异的病毒复制转录物。结论 该表达载体可介导高水平病毒复制,其转染细胞可望成为一种新型的HBV 体外感染模型。     

乙型肝炎病毒/P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒核心蛋白在HepG2.2.15细胞中的亚细胞定位及转移

目的观察HepG2．2．15细胞内HBV核心蛋白的亚细胞定位及转移，了解核心蛋白的入核机制。方法2％二甲亚砜或（和）1μmol／LBay414109处理HepG2．2．15细胞4d；荧光共聚焦显微镜观察HBsAg和HBcAg在细胞内的定位；Westernblot检测胞质和胞核中的HBcAg水平；选择性PCR检测胞核内HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）水平。结果二甲亚砜处理提高了胞质和胞核内的HBcAg表达及核内的cccDNA水平；Bay414109处理后胞质中HBcAg水平下降但胞核中HBcAg水平上升，cccDNA水平下降；联合应用二甲亚砜和Bay41—4109处理后HBsAg在胞质内呈条索状分布，胞质中HBcAg水平下降，但胞核内HBcAg明显上升，cccDNA水平下降。结论HepG2．2．15细胞中存在HBV核心颗粒入核障碍，游离核心蛋白易于通过核孔，二甲亚砜可促进核心蛋白进入细胞核，并有助于cccDNA的形成。     

乙型肝炎病毒L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响

目的研究L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达的影响。方法构建EGFP-野毒株核壳蛋白、L60V、I97L变异核壳蛋白表达载体,酶切和测序鉴定,克隆扩增后转染HepG2细胞,筛选阳性细胞株;荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,Western blotting检测核壳蛋白的表达;RT-PCR检测HLA-A mRNA的表达,流式细胞术观察HLA-A蛋白的表达。结果成功建立了融合表达蛋白表达载体;荧光显微镜显示细胞内融合蛋白表达,Western blotting检测各细胞系蛋白表达的量基本相同;RT-PCR和流式细胞术结果表明,与野毒株相比I97L变异核壳蛋白表达细胞株HLA-A mRNA和蛋白表达均上调(P<0.05),而L60V变异核壳蛋白表达细胞株则均明显下调(P<0.05)。结论L60V、I97L变异核壳蛋白对HepG2细胞HLA-A表达与野毒株核壳蛋白的影响不尽相同,其在功能上与野毒株核壳蛋白存在差异。     

外周血单个核细胞在乙型肝炎病毒再感染和选择乙型肝炎病毒变异株中的…

目的：探讨ＰＢＭＣ在ＨＢＶ再感染和选择ＨＢＶ变异株中的作用。方法：两名肝移植受者移植前后的血清，ＰＢＭＣ和肝脏中的ＨＢＶ的Ｐｒｅｃ／ｃ和Ｐｒｅｓ／ｓ基因的ＰＣＲ产物，经克隆后测序，与ａｙｗ亚型作比较。结果：１每个标本平均测序了７个克隆，共测序了１４６个克隆，２．同一个体内，感染肝外部位的ＨＢＶ基因序列不同于感染肝细胞的ＨＢＶ基在序列，３．血清中ＨＢＶ基因序列或发现于肝细胞的ＨＢＶ克隆中，或见于ＰＢ     

TNF-α介导HBV G87变异在宿主细胞HLA-Ⅰ表达

目的探讨HBV C基因变异G87宿主细胞内TNF-α对HLA-Ⅰ表达的介导作用.方法用定点突变和亚克隆技术构建HBV基因组G87变异株和野生株表达载体EBO-G87和EBO-WT,经脂质体介导转染HepG2细胞.流式细胞术检测转染细胞HLA-Ⅰ表达的强度,受抗TNF-α单克隆抗体阻断的EBO-G87和EBO-WT转染细胞与未经处理的对应株转染细胞作比较.结果对照EBO-plpp空载体转染细胞表面HLA-Ⅰ荧光强度仅为1.33,未经处理的EBO-G87和EBO-WT转染细胞荧光强度增强为8.02和13.94,受抗TNF-αmAb阻断的EBO-G87和EBO-WT转染细胞荧光强度下降至4.31和7.42.结论HBV C基因变异G87上调宿主细胞HLA-Ⅰ表达部分依赖于细胞内TNF-α的自分泌效应.     

HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

研究A83点突变的生物学意义。采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒（HBV）ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段（1814-2452），经KpnⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体。利用定点突变技术对连接载体进行1896点的定点诱变，经错配PCR-RFLP和测序分析。确定突变的克隆，提取突变前后的质粒转染HepG2细胞。突变后在Pre-1C/C第28位氨基酸形成终止密码。HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础。     

乙型肝炎病毒基因的变异

病毒基因的变异是自然发生的、普遍的生物学现象,其变异频率主要由病毒复制周期的数量和复制机制决定的。近年来随着PCR技术及DNA测序技术的发展,病毒基因的变异逐渐受到重视,乙型肝炎病毒基因(HBV DNA)的复制过程必须经过RNA中间体的反转录,此过程缺乏严格的校对酶系统,以矫正其增殖     

乙型肝炎病毒转染及脂多糖刺激对HepG2细胞Toll样受体2和4表达的影响

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)转染对HepG2细胞表面Toll样受体(TLR)表达的影响及脂多糖(LPS)加重HBV转染致肝细胞损伤是否存在直接作用,进一步探讨乙型肝炎发病及重型化的发生机制。方法以不同浓度的LPS刺激HepG2细胞、HepG2．2．15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞),并以免疫细胞化学方法检测HepG2细胞及HepG2．2．15细胞表面TLR 2、4蛋白质表达情况,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR2、4 mRNA表达情况,用Abbot试剂检测HepG2．2．15细胞HgsAg和HgeAg表达情况,用流式细胞仪观察细胞生长周期及细胞凋亡情况。结果HepG2、HepG2．2．15细胞膜上均有TLR2、4蛋白质表达,免疫细胞化学染色在未加LPS及各浓度LPS刺激细胞均可见细胞膜有棕褐色着色,且随着LPS浓度增加,其着色强度增加;对0mg/L及10mg/L LPS诱导HepG2、HepG2．2．15细胞RNA进行RT-PCR扩增,其产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳均可见特异性条带,且10mg/L LPS诱导细胞TLR2和TLR4与分子量标准品的吸光度值比值明显高于0mg/L LPS诱导细胞扩增产物,分别为306．63±6．18对519．84±9．15和700．54±13．56对1116．62±37．67,F值分别为740．58和426．07,P值分别为0．01和0．02;流式细胞仪检测细胞周期发现HepG2绌胞及未经LPS诱导的HepG2．2．15未发生凋亡,各浓度LPS诱导的HepG2．2．15细胞均有细胞凋亡发生,且细胞凋亡率随着LPS浓度增加上升。结论LPS可能通过其与肝细胞膜上的TLR结合,而参与HBV转染后肝细胞损害及肝脏炎症重型化的发病机制。     

应用寡核苷酸芯片对乙型肝炎病毒转染HepG2细胞基因表达谱的研究

HBV与肝细胞之间相互作用的分子机制还不清楚，对HBV蛋白调控宿主细胞基因表达情况也了解甚少。本实验选用基因芯片进行HBV基因表达谱改变的研究，筛选HBV感染应答基因，探讨HBV感染的分子致病机制，寻找预防和治疗HBV感染的靶点。     

pRevX-GFP DN突变体抑制HepG2 2.2.15细胞乙型肝炎病毒复制的实验研究

目的 建立pRev X-GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白的长期稳定表达细胞克隆，进一步研究以乙型肝炎病毒(HBV)X基因作为治疗靶，运用DN突变体技术，进行抗HBV的稳定表达对抗HBV复制的作用。方法 运用基因工程技术，分别以逆转录病毒载体pRev TRE为载体，构建表达野生型HBV X蛋白，GFP蛋白和X与GFP融合的X-GFP融合蛋白的质粒，并分别导入乙型肝炎的转基因细胞株HepG2 2．2．15细胞(简称2．2．15细胞)中，并通过长期的潮霉素抗性选择，获得能稳定表达DN蛋白的2．2．15细胞克隆。应用dot blot检测细胞上清液及细胞中HBV DNA，Southern blot检测细胞内HBV复制中间体，以观察其表达对HBV病毒复制的影响。结果 所构建的pRev X-GFP突变体、pRev Xwt、pRev GFP质粒均能在2．2．15细胞株中稳定高效表达。PRev X-GFP高效表达后，能有效地抑制或阻断细胞内HBV核酸合成及其分泌入细胞上清液。定量聚合酶链反应结果显示，pRev X-GFP组的平均每毫升HBV DNA浓度较2．2．15细胞组分别下降1．0～1．81g值，对细胞内外dot blot结果进行图像分析，其灰度值仪为对照2．2．15细胞组的7．9％，Southern blot分析则发现，X基因DN突变体对HBV复制中间体rcDNA、ssDNA及dsDNA的形成有全面抑制作用。结论 pRev X-GFP DN突变体具有显著抑制HBV复制作用。初步证实X基因是HBV治疗的一个新靶点。针对X基因的治疗，有望为HBV治疗提供一些新的思路。     

QSG-7701和HepG2细胞支持不同乙型肝炎病毒复制模式及其机制

目的研究QSG-7701及HepG2细胞支持HBV复制模式的差异及其内在机制。方法质粒PUC18-HBV1.2转染QSG-7701与HepG2细胞后定量检测细胞上清液中HBV DNA和HBsAg;采用基因芯片技术比较分析二者基因表达差异并用实时定量PCR验证。结果HepG2细胞在转染后6 d内培养上清液可检出HBV DNA及HBsAg,QSG-7701细胞转染后2周内均可检出HBV DNA及HBsAg,且HBV DNA在10 d内保持相对稳定的高水平复制(1×107～3×107拷贝/ml);基因芯片检测结果示QSG-7701细胞中与HBV生活周期相关的因予如HLF、RXRα、IL-6高表达,而HBxIP、SPIK1为低表达,MMP3不表达。结论QSG-7701支持高水平的HBV复制,并可维持cccDNA池的相对稳定,基因差异表达可能为二者支持不同HBV复制模式提供解释。     

1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒重组体构建及其在HepG2细胞中表达和复制

目的构建基于pBlueBac4．5质粒的1．2倍基因组长度C基因型乙型肝炎病毒（HBV）重组体，并研究其在HepG2细胞中的表达和复制。方法以重组质粒pWT上的1．2倍基因组长度C基因型HBVDNA序列和pBB4．5HBV1．3（D基因型）上的pBlueBac4．5载体序列为模板，构建重组质粒pBB4．5HBV1．2（C基因型）。用FuGENEHD瞬时转染法，将pBB4．5HBV1．2导人HepG2细胞。用化学发光免疫分析法、Southern印迹杂交法、荧光定量PCR法，分别检测转染后不同时间点HBsAg和HBeAg、HBV复制中间体及HBVDNA水平。此外，对转染时重组质粒用量进行优化。结果酶切和序列分析证实，pBB4．5HBV1．2重组质粒构建成功。初步转染实验证实，在转染细胞培养上清中可检测到HBsAg和HBeAg。优化后转染条件为：使用60mm细胞培养皿，8～11tLgpBB4．5HBV1．2，质粒与转染试剂5：9（μg：μl）。在此条件下，5d实验周期内可检测到HBsAg和HBeAg持续表达（峰值一般出现在转染后第3天）、HBVDNA持续复制（10^6～10^8拷贝／ml）及HBVDNA复制中间体形成。结论在HepG2细胞中，建立了以杆状病毒转移载体pBlueBac4．5为基础的1．2倍基因组长度C基因型HBV体外培养体系，有望为研究HBV耐药、筛选新抗病毒药物等提供新技术平台。     

乙型肝炎病毒表面抗原变异的临床意义

乙型肝炎病毒（ＨＢ）感染是全球性的公共卫生问题，携带者超过３亿５千万人。ＨＢＶ的复制需经复制中间体ＲＮＡ反转录，且病毒的ＤＮＡ聚合酶缺乏校对酶活性，不能修正核苷酸错配，因而具有较高的变异性。乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）包括主蛋白（Ｓ蛋白）、中蛋白（Ｍ蛋白）和大蛋白（Ｌ蛋白）。Ｓ蛋白是其最主要成分，能诱发机体产生保护性免疫反应，是目前制备疫苗的基础。Ｓ蛋白氨基酸（ａａ）１２４～１４７，由１２４与１３７、１３９与１４７位点的半胱氨酸以二硫键相连形成两个ｌｏｏｐ构成ａ决定簇，是乙型肝炎疫苗产生保…