灭蚊真菌-卡地腐霉蚊虫宿主范围初探

目的：调查和探讨灭蚊真菌．卡地腐霉的蚊虫宿主范围。方法：野外采集蚊幼虫标本，通过形态鉴定其种属，在实验室按标准化方法测定卡地腐霉对其感染能力。结果：野外5处采集蚊虫标本约600只，受感染蚊虫分属2属7种，加上原有调查资料，到目前为止，已知卡地腐霉的蚊虫宿主共3属12种，内含重要疾病媒介蚊虫3种。结论：本研究初步给出了卡地腐霉在常见蚊虫特别是媒介蚊虫中的灭蚊谱。     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。     

rDNA ITS序列在鉴定尖端赛多孢子菌中的应用

为探明一例眼外伤摘除的眼球活组织中培养分离出的一株形态特异的尖端赛多孢子菌的分子生物学特征及其与波氏假阿利什菌、一般尖端赛多孢子菌标准株的亲缘关系,采用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）扩增其ｒＤＮＡ中基因间转录区（ＩＴＳ）,并对ＰＣＲ产物进行限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）。结果发现,形态特异的尖端赛多孢子菌株与标准株及其它同种菌株具有相同的酶切图谱,而与顶孢霉和烟曲霉则不一致,表明该菌株就是波氏假阿利什菌的无性期。该标准菌株的ＩＴＳ序列酶切图谱可供快速、准确地鉴定尖端赛多孢子菌及其有性期,以便于临床早期诊断和及时治疗。     

PCR-RFLP技术在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用

目的:探讨mtDNA分析技术在甲醛固定石蜡包埋组织中的应用.方法:应用限制酶RsaI和MnlI消化mtDNA D-LOOP区(HVI16106-16297)PCR扩增产物,聚丙烯凝胶电泳进行RFLP分型的方法,对随机个体血液样品150例.正常组织10例和甲醛固定石蜡包埋组织5例进行检验.结果:在150例随机个体中,Rs...     

贵阳腐霉几丁质酶的活性及基因片段克隆与序列

目的: 研究贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)几丁质酶的活性及其基因片段的克隆与序列分析.方法: (1) 采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定贵阳腐霉分泌的几丁质酶活性;(2)根据NCBI Protein 数据库中多种生物的几丁质酶氨基酸序列的保守区设计引物,以贵阳腐霉基因组DNA为模版,通过PCR扩增获得特异性DNA片段;(3)将该片段克隆并进行测序分析.结果: 贵阳腐霉经诱导后可以分泌几丁质酶.诱导24 h是该酶分泌高峰期.克隆到一207bp的DNA片段,其第182～207碱基序列与狗(Canis familiaris)的几丁质酶基因的部分序列相同.结论: 本实验证明贵阳腐霉核DNA含有几丁质酶基因,在几丁质类似物的诱导下,该菌可以分泌几丁质酶.所克隆的DNA片段可能是几丁质酶基因的部分序列.     

灭蚊真菌卡地腐霉产生游动孢子所需条件的研究

目的：观察卡地腐霉产生游动孢子所需的环境条件。方法：以卡地腐霉经诱导产生的游动孢子数量为指标，观察不同条件对其产生游动孢子的影响，确定该真菌产生游动孢子所需的最适条件。结果：卡地腐霉产生游动孢子的适宜温度范围为10-30℃，最适温度为24—26℃；适宜产孢的蒸馏水pH值范围为5—12，最适pH值为9—11；8d的培养物产孢量最多；菌块与蒸馏水的比例为1：40时产孢最多；三种光照周期对卡地腐霉的产孢影响不大，紫外线对产孢有抑制作用；NaCl、(NH4)2S04、蛋白胨和葡萄糖对游动孢子的产生有较强抑制作用，产孢能力对尿素的耐受性极大。结论：本观察所得资料对卡地腐霉的基础研究和应用都有重要价值。     

卡地腐霉Pr1蛋白酶cDNA片段的分离和克隆

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉（Pythium carolinianum(Pr1)蛋白酶（subtilisin-like protease)的cDNA片段。方法：用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30h，然后按下述流程操作；抽提菌丝的总RNA；逆转录合成cDNA第一链；根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物，以cDNA第一链为模板，用MOPAC方法（Mixed oligonucleotides primed amplification of cDNA)扩增cDNA；将扩增产物纯化，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果：所获片段中，1个530bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性，尤其与真菌Aphanomyces astaci(卵菌纲，水霉目）的Pr1在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性。分别为59%和49%，此序列已登录Genbank数据库，检索号；AF499006，P.carolinianum与A.astaciPr1部分cDNA序列的比对亦登录Genbank数据库，检索号：AY094976，AY094977。结论：这-DNA片段可能是卡地腐霉Pr1蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段，并加以证实。     

新分离的灭蚊真菌(Pythium sp. GY1938)对家蝇幼虫的安全性检测

目的: 检测新分离的灭蚊真菌(Pythium sp. 代号GY1938)对非靶生物家蝇(Musca domestica Vicina)幼虫的安全性. 方法: 用分别拌以高(1%)、中(0.5%)和低(0.1%)剂量该真菌菌丝悬液的家蝇饲料饲养家蝇幼虫,并以不加真菌的家蝇饲料饲养的家蝇幼虫作对照.待幼虫成熟后,拣出幼虫并计数,计算幼虫拣出率.并观察幼虫的外形,称体重.结果: 实验组家蝇幼虫的外形和体重与对照组无显著性差异.结论: 灭蚊真菌Pythium sp.GY1938对家蝇没有毒性作用.     

九株虫生真菌灭蚊试验初报

为寻找新的生物灭蚊资源，我们用九株菌株的孢子液作杀灭致倦库蚊早三龄幼虫的实验。其中Ｍ．ＳＰ．ＧＹ，Ｐ．ｆａｒｌｉｎｏｓｕｓ１０２０和Ｐ·ｆｌｕｍｏｓｏ－ｒｏｓｅｕｓ８０７８引起的蚊虫死亡率分别可达７５．１±２３．５％、５８．６±３８．８％和５９．３±１９．８％。从Ｐ·ｆｌｕｍｏｓｏ－ｒｏｓｅｕｓ８０７８感染致死的蚊幼虫中又分离出该菌，培养后产生的分生孢子仍具有较高的蚊虫致死率。Ｍ．ｓｐ，ＧＹ和Ｐ·ｆａｒｌｉｎｏｓｕｓ１０２０的孢子冰冻匀浆能在较短时间（１～２天）内使蚊虫死亡，表现出明显的真菌毒素作用。     

大链壶菌和卡地腐霉的 Pr1和Pr2类蛋白酶的研究

目的：证实灭蚊真菌大链壶菌和卡地腐霉经诱导可产生枯草杆菌蛋白酶类蛋白酶（Prl）和胰蛋白酶类蛋白酶（Pr2）。方法：采用特异性底物测定、X光胶片印迹试验、含底物的硝酸纤维薄膜试验等多种方法对蚊虫体壁类似物--几丁质诱导前后培养液中酶的活性进行检测和比较。结果：大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。并且，经几丁质诱导30-60h后，卡地腐霉产生的Pr1和Pr2类蛋白酶及大链壶菌产生的Pr2类蛋白酶活性均明显增高。并通过对培养液进行冷冻干燥、等电聚焦电泳和脱盐等处理，对该蛋白酶进行了初步纯化。结论：大链壶菌和卡地腐霉均可产生Pr1和Pr2类蛋白酶。几丁质对这些类蛋白酶的释放有诱导作用。     

CYP2A6基因多态性的一步PCR-RFLP分析法

目的：建立CYP2A6基因多态性的一步PCR－RFLP分析法。方法：取外周静脉血100μl，用Rose法提取基因组DNA，用特异性引物CYP2A6F03：5′-CTG ATC GAC TAG GCG TGG TA-3′,cyp2a6r06:5′-CGT CCT GGG TGT TTT CCT TC-3′进行一步PCR扩增，用限制性内切酶Dde I,XcmI对PCR产物进行酶切，3％琼脂糖凝胶电泳。结果：扩增的PCR产物大小为214bp，部分血样标本未获得PCR扩增产物，判为CYP2A6缺失基因型（CYP2A6 del/CYP2A6del)。DdeI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6v2基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段；XcmI酶切后，凝胶电泳可得到部分酶切（CYP2A6wt/CYP2A6vl/CYP2A6wt基因型），未被酶切（CYP2A6wt/CYP2A6wt基因型）两种类型DNA片段。其中，部分血样标本同时被DdeI和XcmI部分酶切（CYP2A6v2/CYP2A6vl基因型）。应用此方法检测，发现中国人群胃癌患者存在CYP2A6等位基因多态性。经双盲重复检测，上述结果一致。结论：采用一步PCR－RFLP技术可以建立简单、稳定、特异的CYP2A6基因多态性分析法。