膀胱癌细胞p16抑癌基因失活的研究

目的 探讨膀胱癌中p16基因失活情况。方法 采用PCR、PCR—SSCP和DNA甲基化分析技术等方法对25例膀胱癌组织中p16基因进行检测。结果 25例膀胱癌标本中有6例存在p16基因纯合性缺失，缺失率为24％；无1例出现点突变；16例出现异常甲基化，检出率为69．6％(16／23)。结论 外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的事件；通过CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制。     

急性淋巴细胞白血病p16基因纯合性缺失、点突变及启动子甲基化变异

目的 探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患者p16基因的失活机制。方法 从29例患者外周血提取白细胞基因组DNA,采用PCR、PCR—SSCP、MSP分析方法,对p16基因第二外显子的纯合性缺失、点突变及启动子区CpG岛的甲基化变异进行分析。结果 p16基因第二外显子的缺失率为27．6％(8／29),未见其点突变;p16基因启动子区CpG岛的甲基化率为13．8％(4／29)。结论 p16基因的失活和ALL的发生发展有一定的关系。     

膀胱移性细胞癌p16基因缺失、突变、甲基化及其蛋白表达的研究

目的对25例膀胱移性细胞癌(bladder transitional cell carcinoma,简称膀胱癌)患者的p16基因第一、第二外显子纯合性缺失,第二外显子的点突变,第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况及p16蛋白表达进行检测,探讨p16基因在膀胱癌中失活的方式及p16蛋白表达与膀胱癌之间的关系. 方法取患者膀胱癌组织,用酚/氯仿法提取癌组织基因组DNA,设计p16基因第一、二外显子引物,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、PCR-单链构象多态性 (PCR-single strand conformational polymorphism, PCR-SSCP)、甲基化敏感限制性内切酶-PCR分析方法,对25例膀胱癌患者的癌组织基因组DNA的p16基因第一、二外显子的纯合性缺失、第二外显子点突变及第一外显子区5＇CpG岛的甲基化情况进行分析.应用S-P免疫组织化学方法检测25例膀胱癌和6例正常膀胱黏膜组织中p16基因的表达情况,并分析其意义. 结果在这25例膀胱癌患者中,发现p16基因第二外显子缺失者有4例,第一外显子和第二外显子共同缺失者有1例,第一外显子缺失者1例,p16基因的缺失率为24%(6/25);未发现p16基因第二外显子的点突变; p16基因第一外显子区5＇CpG岛的甲基化率为69.6%(16/23).p16基因表达在膀胱癌组织中阳性率为52%(13/25),6例正常膀胱黏膜组织中均阳性,两者比较差异有显著性(P<0.01).随病理分级、临床分期的上升和预后的不良,p16基因的阳性表达率有下降趋势,但差异无显著性(P＞0.05).结论 p16基因的失活方式主要有三种:纯合性缺失、点突变和5＇CpG岛的甲基化,但外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的"事件";通过p16基因第一外显子区5＇CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制.在这25例膀胱癌患者中,未发现p16基因的点突变,但仍不能排除这种失活机制,我们将通过扩大样本,进一步研究p16基因的点突变情况.p16基因表达产物与膀胱癌的发生发展及预后可能有关系,也有待于扩大例数进一步研究.p16基因表达产物可作为诊断膀胱癌的指标之一.     

卵巢癌p16基因的纯合性缺失、突变及表达异常的研究

目的：研究p16基因的纯合性缺失，突变及表达异常与卵巢癌的发生是否存在相关关系。方法：采用PCR-SSCP检测卵巢癌p16基因的纯合性缺失和突变；采用RP-PCR定性及半定量分析p16基因；采用免疫组化技术检测p16蛋白。结果：32例卵巢癌中检测到1例外显子1突变，未检测到p16基因的纯合性缺失；RT-PCR分析卵巢癌中p16基因mRNA均有表达，半定量分析卵巢癌与正常卵巢组织中p16基因mRNA表达水平无差别；免疫组化检测9例卵巢癌中的p16蛋白为阴性（28.2%)。结论：卵巢癌的发生与p16基因的纯合性缺失和突变无相关关系，与p16基因异常表达有相关关系。     

胰腺癌MTS1／p16基因纯合性缺失和突变的研究

目的：研究人胰腺癌组织及正常胰腺组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变情况。探讨p16基因异常与胰腺癌的关系。方法：应用聚合酶链式反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）技术检测51例胰腺癌组织中p16基因第1外显子和第2外显子的纯合性缺失和突变频率,以正常胰腺组织15例为对照。结果：全部被检胰腺癌组织中有23例发生p16基因第2外显子缺失,缺失率45％,有1例发生第1外显子的突变,未发现第1外显子缺失和第2外显子突变。正常胰腺组织中均未发生第1外显子和第2外显子的缺失及突变。结论：p16基因缺失与胰腺癌的发生关系密切,p16基因的突变可能与胰腺癌的发生关系不大。     

原发性肝细胞癌中p16、p15、p53基因缺失、突变以及HBV DNA在肝细胞癌中整合的研究

目的构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针，建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法。研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子纯合性缺失，p53基因第七外显子纯合性缺失、点突变以及HBV 前C区、S区、X区在HCC中整合情况。方法用RT-PCR获得p16基因第二外显子cDNA，将其插入质粒pGEM-T中，构建为重组质粒pGEM-pl6。经蓝白选择、限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列分析筛选获得重组质粒的阳性克隆，插入片段经限制性内切酶酶切、纯化后，用随机引物法标记地高辛，以此为探针，用Southern Blot方法分析p16第二外显子PCR产物。应用PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法，对临床38例HCC手术后标本中的p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子、p53基因第七外显子纯合性缺失和点突变进行分析。应用PCR和3' 末端碱基特异性PCR分析肝细胞癌基因组HBV前C区野生型和突变型、PCR分析S区和X区整合的情况。同时检测了血清中HBV 前C区的阳性率。结果重组质粒的限制性内切酶酶切图谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入片段大小为307bp，与引物区间大小一致；地高辛标记探针可与p16 PCR产物杂交。发现在这38例HCC患者中，p16基因第二外显子的缺失率为34.2%，p16基因第一外显子和p15基因第二外显子未发现缺失；未发现p53基因第七外显子纯合性缺失，但4例存在p53基因249密码子点突变，且均为杂合型突变，突变率为10.53%。HBV前C区野生型阳性率为42.1%, 其中10例伴有突变型阳性(26.3%)。HBV X区阳性率为44.7%，HBV S区阳性率为50%。患者血清中，HBV 前C区野生型阳性率为15.8%, 突变型阳性率为18.4%。结论所获重组质粒为pGEM-pl6设计构建，并成功地获得p16第二外显子的cDNA探针和建立了p16 Southern Blot分析方法。所获结果提示在肝细胞癌中p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式，而纯合性缺失不是p15基因在肝细胞癌中的失活方式，但并不排除存在其它失活方式。p53基因第七外显子的杂合性突变提示有肿瘤遗传倾向。未发现纯合性点突变提示在肝细胞癌发生机制中p53基因第七外显子的点突变并不占据主导地位。HBV DNA 在原发性肝细胞癌基因组中可能存在整合,并在HCC发生过程中起一定作用。     

成人急性白血病患者骨髓中p16基因的表达

目的：研究成人急性白血病患者p16基因纯合缺失和甲基化变化与其表达之间的关系，探讨其成人急性白血病发生发展中的生物学意义，方法：分别用多重聚合酶联反应（PCR）技术及甲基化敏感限制性内切酶－PCR技术检测了71例成人急性白血病患者DNA中p16基因纯合缺失及甲基情况；应用原位杂交及免疫技术检测p16基因mRNA及p16基蛋白表达，结果：71例成人急性白血病患者中，2例检测出p16基因纯合缺失，在无p16基因纯合缺失的病例中，5例急性淋巴细胞白血病（5／26）和9例急性髓性白血病（9／43）患者测出p16基因甲基化，p16mRNA及p16蛋白的阳性率分别为70．4％（50／71例）、61．9％（44／71例），结论：在成人急性白血病的发生发展中，p16基因甲基化比p16基因纯合缺失更具有意义；p16基因表达异常与成人急性白血病的发生发展密切相关。     

神经母细胞瘤p16基因甲基化研究

目的：明确在神经母细胞瘤中p16基因是否发生甲基化及其频率，阐明p16基因在神经母细胞瘤的作用机制，方法：应用PCR技术结合限制性内切酶FnuDII,SacII,HpaII为工具，对14例神经母细胞癌患者的14个原发灶及其中5例肿瘤周围正常组织p16基因第1外显子CpG岛进行了甲基化修饰的研究。结果：5例正常组织的p16基因第1外显子CpG岛未发生甲基化，而4例原发灶在II（1例），III（2例），IV（1例）期有甲基化发生。结论：神经母细胞瘤组织DNA中不存在p16基因的纯合性缺失，p16基因甲基化不可能为期失活的一种形式，II、III、IV期均有发生，可能是肿瘤发生的早期事件，同一患者的原发灶和转移灶，可有不同的甲基化模式，反映了肿瘤的异质性。     

急性淋巴细胞白血病中p16基因甲基化及表达

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病发生机制中的作用。方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应(PCR)方法检测82例急性淋巴细胞白血病患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况，同时应用免疫组织化学染色法检测p16蛋白的表达。结果：31例急性淋巴细胞白血病患者存在p16基因的甲基化；1例p16基因纯合缺失；39名患者p16蛋白表达阴性；p16蛋白阴性表达患者的初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16蛋白阳性表达者。结论：p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病的发生机制中有一定的作用，p16蛋白可能是评估急性淋巴细胞白血病预后的一个指标。     

原发性非小细胞肺癌中p16/MTS1基因外显子纯合性缺失的研究及临床意义

目的 检测原子性非小细胞肺癌（Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)手术标本p16基因（Multiple Tumor Suppressor Gene,MTS1)第一、二外显子纯合性缺失并探讨其与肿瘤细胞分化程度、组织类型、转移和预后的关系。方法 收集我院1999年1月－12月原发性支气管肺癌且手术病理证实为非小细胞肺癌32例。提取DNA,建立PCR方法分析p16基因第一、二外显子纯合性缺失,用Southern Blotting方法对p16第二外显子的PCR产物进行鉴定。结果 32例NSCLC患者中9例发生p16基因第二外显子的缺失,缺失率为28％（9／32）,p16第一外显子未发现缺失。结论 在原发性非小细胞肺癌中,p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式,且影响肺癌细胞其他生物学行为。     

垂体腺瘤组织P16蛋白表达缺失及原因分析

目的：探讨垂体腺瘤组织中p16的表达及表达缺失的原因。方法：取尸体解剖正常垂体标本6例,临床病理证实的垂体腺瘤标本40例,采用蛋白杂交技术检测P16蛋白的表达;核酸杂交分析p16基因的纯和性缺失;单链构象多态性分析筛选p16基因突变;甲基化分析检测无纯和性缺失和突变的30例肿瘤组织p16基因启动子的甲基化状态。结果：40例垂体腺瘤组织中P16蛋白表达缺失。核酸杂交40例标本10例出现p16基因的纯和性缺失,该10例MRI表现为侵袭性垂体腺瘤。单链构像多态性分析,30例无p16纯合性缺失标本血与肿瘤DNA配对扩增电泳筛选p16第一和第二外显子碱基突变,未发现p16的主要编码区第一、第二外显子存在突变。对无p16纯合性缺失和突变的30例进行甲基化分析发现p16基因启动子存在甲基化。结论：垂体腺瘤的发生与p16的表达缺失有关,其缺失的原因包括p16基因的纯和性缺失的启动子的甲基化,p16基因的纯和性缺失是侵袭性垂体腺瘤的分子标志之一。     

INK4系列抑癌基因(p16、p15、p18、p19)在白血病中的甲基化

目的 探讨p16基因家族失活与白血病发生、发展及预后的关系，进一步阐明白血病发病机制，监测发病过程。方法 采用甲基化敏感限制内切酶Hpa Ⅱ或Msp Ⅰ结合PCR技术研究白血病患者p16、p15、p18、p19基因甲基化状况：(1)研究不同类型、不同阶段白血病p16基因家族外显子1和／或外显子2纯合子缺失，(2)用REP-PCR分别对上述病例中无外显子1缺失的病例进行甲基化研究，探讨甲基化发生频率，分析与白血病发病关系。结果 p16、p15基因外显子1在急性白血病(AL组)甲基化率分别为35．29％，48．65％，急性非淋巴细胞白血病(ANLL组)为25％，37．5%，急性淋巴细胞白血病(ALL组)为60％，69．23％，初治AL组为29．09％，42．10％，复发AL组为61．54％，70．59％，慢性粒细胞白血病(CML)慢性期、急变期、白血病完全缓解(CR-AL)、对照组均无甲基化。p18、p19基因无论在AL组、ALL组、ANLL组、复发AL组、初治AL组，或是在CML的慢性期、急变期、CR-AL、对照组均无甲基化。结论 (1)在p16基因家族中，p16、p15基因甲基化在AL的发生频率较高，ALL甲基化率明显高于ANLL，以复发ALL组最高。p18、p19基因在AL组中未见甲基化。(2)在ALL中，p15甲基化率高于p16甲基化率，在ANLL中，p16、p15基因的甲基化率高于对照组。(3)p16、p15基因甲基化可作为AL病程进展、复发、预后的指标之一。(4)p16、p15基因甲基化在CML病程中(慢性期、急变期)意义不大。     

基因甲基化与急性淋巴细胞白血病的关系

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生机制中的作用。 方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应方法检测82例ALL患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况。 结果：31例ALL患者存在p16基因的甲基化,1例p16基因纯合缺失;p16存在甲基化与纯合缺失的患者初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16基因正常表达者。 结论：p16基因甲基化在ALL发生机制中有一定的作用,可作为评估ALL预后的一个指标。     

神经母细胞瘤p16基因甲基化研究

目的　明确在神经母细胞瘤中p16基因是否发生甲基化及其频率,阐明p16基因在神经母细胞瘤中的作用机制。方法　应用PCR技术结合限制性内切酶FnuDⅡ、SacⅡ、HpaⅡ为工具,对14例神经母细胞瘤患者的14个原发灶及其中5例肿瘤周围正常组织p16基因第1外显子CpG岛进行了甲基化修饰的研究。结果　5例正常组织的p16基因第1外显子CpG岛未发生甲基化,而4例原发灶在Ⅱ(1例)、Ⅲ(2例)、Ⅳ(1例)期有甲基化发生。结论　神经母细胞瘤瘤组织DNA中不存在p16基因的纯合性缺失,p16基因甲基化可能为其失活的一种形式,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期均有发生,可能是肿瘤发生的早期事件。同一患者的原发灶和转移灶,可有不同的甲基化模式,反映了肿瘤的异质性。     

垂体腺瘤组织P16蛋白表达缺失及原因分析

目的 :探讨垂体腺瘤组织中p16的表达及表达缺失的原因。方法 :取尸体解剖正常垂体标本 6例 ,临床病理证实的垂体腺瘤标本 40例 ,采用蛋白杂交技术检测P16蛋白的表达 ;核酸杂交分析p16基因的纯和性缺失 ;单链构象多态性分析筛选p16基因突变 ;甲基化分析检测无纯和性缺失和突变的 30例肿瘤组织p16基因启动子的甲基化状态。结果 :40例垂体腺瘤组织中P16蛋白表达缺失。核酸杂交 40例标本 10例出现p16基因的纯和性缺失 ,该 10例MRI表现为侵袭性垂体腺瘤。单链构像多态性分析 ,30例无p16纯合性缺失标本血与肿瘤DNA配对扩增电泳筛选p16第一和第二外显子碱基突变 ,未发现p16的主要编码区第一、第二外显子存在突变。对无p16纯合性缺失和突变的 30例进行甲基化分析发现p16基因启动子存在甲基化。结论 :垂体腺瘤的发生与p16的表达缺失有关 ,其缺失的原因包括p16基因的纯和性缺失和启动子的甲基化 ,p16基因的纯和性缺失是侵袭性垂体腺瘤的分子标志之一。     

p16基因第二外显子纯合性缺失检测对肺癌所致胸液的临床价值

目的　探讨p16基因第二外显子纯合性缺失检测对肺癌所致胸腔积液的临床价值。方法　用PCR技术检测 31例肺癌胸液及 21例结核性胸腔积液中p16基因第二外显子纯合性缺失的情况,同时送检胸液脱落细胞学作为对照分析。结果　表明所检 21例结核性胸液无p16基因第二外显子纯合性缺失, 31例肺癌胸液标本中有 12例出现第二外显子纯合性缺失,缺失率为 38 7% ( 12 /31 )。同时 16例脱落细胞学检测阳性,阳性率为 51 62% (16 /31)。在 15例脱落细胞学阴性中,有 6例存在p16基因第二外显子纯合性缺失,两者联合检测阳性率提高至 70 97% (22 /31),明显高于单独检测(P<0 05)。另外,p16基因第二外显子纯合性缺失与肿瘤细胞的组织学类型、转移、预后相关。本组研究表明鳞癌出现p16基因第二外显子缺失的机率虽高于腺癌但差异无显著性;而有淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(P<0 005)。同时,在 12例p16基因纯合性缺失的患者中有 9例已发生一处以上的肺外转移,预后极差。结论　检测胸液p16基因第二外显子纯合性缺失对肺癌胸腔积液的诊断有重要价值,且特异性高;与脱落细胞学联合检测,可补充和提高其诊断阳性率,对鉴别癌性和结核性胸腔积液及判断肺癌的预后有一定的参考意义。     

喉鳞癌中FHIT基因第5,8外显子纯合性缺失及突变研究

目的探讨喉鳞癌(laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)组织中脆性组氨酸三联体(FHIT)基因第5,8外显子纯合性缺失及突变的情况。方法分别采用外显子特异PCR及PCR-SSCP技术检测41例LSCC中FHIT基因第5,8外显子纯合性缺失及点突变。结果LSCC中,第5外显子纯合性缺失率为26.8%(11/41),且与患者TNM分期及淋巴结转移有关(P<0.05);第8外显子纯合性缺失率为29.3%(12/41),且与患者TNM分期、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05);FHIT基因第5,8外显子的纯合性缺失有明显的相关性(P<0.01);所有标本没有检测到第5,8外显子的点突变。结论LSCC中,FHIT基因第5,8外显子为其基因缺失的重要靶区,两者的纯合性缺失可作为检测LSCC生物学行为的重要标志。LSCC中,点突变可能不是FHIT基因失活的主要机制。     

多重PCR法检测喉癌组织中P16基因纯合缺失及异常甲基化

目的：采用多重ＰＣＲ法检测喉癌及癌旁组织中Ｐ１６ 基因纯合缺失和异常甲基化。方法：选用二对引物分别扩增Ｐ１６ 基因外显子１ 和２,分析有无纯合缺失,对未检出缺失的样品用甲基化敏感内切酶Ｓｍ ａＩ消化后,再扩增外显子１,分析有无Ｐ１６ 基因异常甲基化。结果：３９ 例喉癌组织标本中９ 例标本有Ｐ１６ 基因纯合缺失,缺失率为２３．０８％ （９／３９）。３０ 例未检测到Ｐ１６ 基因缺失的喉癌组织标本,有４ 例检出异常甲基化,检出率为１３．３３％ （４／３０）。３９ 例癌旁组织标本均未检测到Ｐ１６基因缺失或异常甲基化。结论：采用多重ＰＣＲ法可检测出Ｐ１６ 基因常见的纯合缺失和异常甲基化失活。研究表明,Ｐ１６ 基因失活可能在喉癌的发生发展中起重要作用     

成人急性髓性白血病中p16/p15缺失与甲基化

目的探讨p16/p15基因第二外显子在成人急性髓性白血病(AML)中的缺失与甲基化。方法 用常规PCR及酶切技术研究33例成人AML中p16/p15基因第二外显子的缺失与甲基化情况。结果 统计学分析p16 E2的HapII、SacII和NruI各位点之间以及p16 E2和p15 E2的HapII位点之间的甲基化状况无相关性(均为P>0.005),成人AML患者组与正常对照组p16 E2甲基化状况在。HapII位点无显著差异(P=0.078),在SacII和NruI位点有显著差异(P=0.037)。结论 成人AML中p16/p15基因第二外显子的缺失不是主要失活方式,基因编码区位点甲基化的发生可能是随机的,p16E2的甲基化在成人AML基因诊断中有一定作用。     

脑星形细胞瘤p16基因缺失及5'CpG岛甲基化检测

目的探讨p16基因异常与脑星形细胞瘤发生、发展的关系。方法利用PCR及PCR-based甲基化技术检测了56例不同级别的脑星形细胞瘤组织p16基因缺失及5'CpG岛甲基化状况。结果18例高病理级别的脑星形细胞瘤发生了p16基因缺失,而低病理级别的脑星形细胞瘤无一例发生缺失（P<0.05）;6例脑星形细胞瘤发生了p16基因5'CpG岛甲基化。结论p16基因失活可能参与脑星形细胞瘤的病理发生、恶性进展。p16基因纯合缺失是p16基因失活的主要机制。